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Biology

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

doi: 10.3791/58439 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

Abstract

수많은 연구에 의해 해결 되었습니다, 림프 세포, 그것의 기능 외 paracaspase MALT1 또한 패턴 인식 수용 체의 타고 난 셀 하류에 중요 한 역할을 재생 합니다. 최고의 공부는 Dectin-1 및 Dectin-2 일원 이다 C 형 lectin 같이 수용 체 가족의 SYK-및 CARD9-종속 MALT1 종속 방식에서 NF-κB 활성화를 선도 하는 캐스케이드 신호를 유도 하는. 대비, 통행세 같이 수용 체 (TLR), TLR-4, 같은 의해 NF-κB 활성화 하지만 신호는 MYD88/IRAK 종속 캐스케이드를 통해 전파 합니다. 그럼에도 불구 하 고, MALT1 TLR 4 신호에 기여할 수 있습니다 여부 불분명 남아 있다. MLT-827, MALT1 paracaspase 활동의 강력 하 고 선택적 억제제와 최근 증거가 나타냅니다 TNF-생산 하류 TLR-4 인간의 골수성 세포에서의 Dectin-1, TNF-생산 하류 반대로 MALT1의 독립적인 MALT1은 종속. 여기, 우리는 더 이상 감지, 및 마우스 세포 준비, Dectin 1, MINCLE 또는 TLR 4 통로의 자극의 다양 한 사용 패턴 인식에 MALT1의 선택적 참여 해결. 우리는 또한 넘어 TNF-, cytokines를 탐험 하 고 SYK 억제제 (Cpd11)와 IKK 억제제 (AFN700) MLT-827를 비교 하 여 추가적인 통찰력을 제공 했습니다. C-타입 lectin 같이 수용 체의 MALT1 종속성에 대 한 제공 하는 데이터 추가, 증거를-반대로 TLR 신호를 신호.

Introduction

MALT1의 paracaspase 활동 (점 막 관련 림프 조직 림프 종 전 좌 단백질 1) 20081,2에서 밝혀졌다. 그 이후, 연구의 여러 세포에 항 원 수용 체 응답의 중요 한 기여를 보고 있다. 유전자 모델 마우스 뿐만 아니라 T 세포, T 세포 의존 면역 및 B-세포 림프 종 설정3,4약리학 데이터는 중요 한 역할을 지원. MALT1 paracaspase 활성화는 CARD11-BCL10-MALT1 복잡 한5, 항 원 수용 체 근 위 신호에 의해 트리거되는 조립 시 발생 하는 림프 톨에 T 또는 B 세포 수용 체의 다운스트림. 또한 유사한 CARD9-BCL10-MALT1 복잡 한 예를 들어 C 형 lectin 같이 수용 체 (CLLR)의 하류 신호를 전파에 대 한 중요 하다는 충분 한 증거가 있다, Dectin-1, Dectin 2, MINCLE에 골수성 세포6,7. Dectin-1이이 통로 곰 팡이 감염8,9에 대 한 호스트 방어에 매우 중요 하기 때문에 특히 잘 공부 되었습니다 했다. 그러나, 수용 체 통행세 같이 (TLR) 경로에서 MALT1의 의미는 논란이10남아 있다. 인간의 골수성 세포에서 최근 증거 MALT1 paracaspase 활동 TNF-생산의 하류 TLR 411의 규정에 대 한 직접적인 역할을 배제.

현재 작업에서 다양 한 실험 설정 물질로 인간의 및 마우스 골수성 세포 타고 난 신호 경로, 특정 약리 도구 억제제 및 cytokine 생산의 측정 프로브를 사용 우리.

Protocol

실험 지침 및 노바 티 스 인간의 연구 윤리 위원회의 기준에 따라 실시 했다.

1. 인간의 버 피 코트에서 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비

참고: 우리 컬렉션, 50 mL 가방에서 후에 1 일 건강 한 지원자에서 버 피 코트를 받았다. 그들은 동의에서 제공 하 고 Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz통해 수집 했다. 우리는 다르게 지정 하지 않는 한에 실 온에서 아래 절차를 사용 하 여 처리 합니다.

  1. 가 위 (아래 lamina 흐름) 비닐 봉지 1 리터 비 커의 살 균 하 고 깨끗 한 쌍을 준비 합니다.
  2. 비 커에 버 피 코트를 전송 하 고 신중 하 게는 위.
  3. 25 mL 피 펫을 사용 하 여 추가 100 mL의 인산 염 버퍼 염 분 버퍼/ethylenediaminetetraacetic 산 (PBS/EDTA: PBS 1 x pH 7.4 아니 CaCl2 및 없음 MgCl2, 보충 2 mM EDTA pH 8.0).
    참고: 동일을 사용 하 여 플라스틱 그리고 pipetting 솔루션을 위아래로 천천히, 후 미리 가득 다 당 류 기반 밀도 기울기의 15 mL 50 mL의 6 원뿔 원심 분리기 튜브 25 mL 희석된 버 피 코트의 분배.
  4. 적당 한 가속 (4 개의 9 설정) 800 x g 20 분 원심 브레이크를 그들의 밀도에 따라 세포의 분리에 대 한 허용 없이.
    참고: 원심, 후 3 개의 레이어를 볼; 수 있습니다. 적혈구 및 granulocytes, 플라즈마, 그리고 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 포함 하는 백색 반지 사이 하는 상위 계층을 포함 하는 펠 릿.
  5. PBMC 링 10 mL 피 펫 및 새로운 50 mL 튜브에 사용 하 여 수확.
    참고: 2 ~ 3 50 mL 튜브는 일반적으로 버 피 코트 당 필요 합니다. 이 단계에서 일부 플라즈마 가능성이 오염 후속 농축 단계에 영향을 주지 않습니다 있어야 수집된 PBMCs.
  6. 최대 50 mL PBS/EDTA를 사용 하 여 모든 튜브 탑 하 고 감소 하는 원심 분리 시간 및 속도 (520 g, 330 x g에서 10 분, 150 x g8 분 x 15 분)와 함께 3 연속 세척을 진행 합니다.
    참고: 각 단계에서 액체 폐기물 컨테이너에는 상쾌한 떨어져 부 어 있으며 셀 펠 렛 50 ml PBS/EDTA의 resuspended (펠 릿 첫 세척 후 풀링된 수 있습니다).
  7. 최종 세척 후 얼음 세포의 용 해 버퍼의 25 mL에 있는 펠 릿 resuspend ( 테이블의 자료참조)를 삼투성 압력에 의해 붉은 혈액 세포를 lyse.
  8. 솔루션 취소 될 때까지 품 어 (실 온에서 ≤ 5 분).
  9. 분리 버퍼 (PBS 1 pH 7.4 아니 CaCl2 없음 MgCl2, 2% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충을 포함 하 고 1 mM EDTA pH 8.0 x) 25 mL를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
  10. 150 x g 8 분에 한 번 더 씻는 다.
    참고: 이 단계에서 PBMCs 대량 인구로 사용할 수 있습니다 (3 단계 참조: PBMCs 및 monocytes 물질로 조건 및) monocyte 농축 처리 또는 (단계 2 참조: PBMCs에서 monocytes의 준비), 또는 사용에 대 한 아래로 냉동 (단계 5 참조: Monocytes 그리고 PBMCs 냉동/해 동 절차).

2입니다. PBMCs에서 Monocytes의 준비

  1. 1.10 분리 버퍼에 단계에서 얻은 PBMCs resuspend 및 5 x 107셀/mL를 도달 하는 그들.
  2. 모자와 14 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
  3. 추가 50 µ L monocyte 농축 항 체 세포 현 탁 액의 mL 당 칵테일의 소용돌이, 4 ° c.에서 10 분을 품 어 고
  4. 셀의 mL 당 monocyte 농축 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
    참고: 구슬 vortexed는 서 스 펜 션의 균질 성을 보장 하 철저 하 게 수 있어야 합니다.
  5. 후 구슬, 곧 소용돌이 세포 현 탁 액을 추가 하 고 4 ° c.에서 5 분을 품 어
  6. 튜브는 최대 10 mL 때까지 분리 버퍼 튜브의 위쪽 부분을 씻어.
  7. 천천히 아래로 pipetting으로 솔루션을 혼합.
  8. 분리 자석에 모자 없이 튜브를 놓습니다.
  9. 실 온에서 2.5 분 동안 품 어.
  10. 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 천천히 붓는 다.
  11. 이 단계에서 직접 사용 monocytes (3 단계 참조: PBMCs 및 monocytes 치료 및 물질로 조건) 또는 mmature nocyte 파생 Dendritic Cells (iMoDCs)으로 구분 (4 단계 참조), 또는 이후 사용에 대 한 그들을 내려 고정 (단계 5 참조).

3. PBMCs 및 Monocytes 치료 물질로 조건

  1. 셀의 개수와 문화 매체에서 그들을 희석 (로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 10 %FBS + 1mm 나트륨 Pyruvate + 100 U/mL 페니실린 스 (펜/Strep) 5 µ M β-mercaptoethanol), 104 셀/잘 x 1.25까지.
  2. 384-잘 접시의 당 세포 현 탁 액의 30 µ L를 배포 합니다.
  3. 4 집중된 복합 솔루션 x 15 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 사전 품 어.
  4. 10 ng/mL의 최종 농도에 lipopolysaccharide (LPS)를 추가 또는 zymosan (DZ) 100 µ g/mL의 최종 농도에 소진 하거나 일반 매체에 계속.
  5. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
  6. 분 비 되는 TNF 수준을 측정 하는 상쾌한의 10 µ L를가지고 (단계 7를 참조 하십시오: Cytokines 및 생존 능력 측정).

4. iMoDCs와 물질로 조건 monocytes 분화

  1. Monocytes (단계 2에서 농축)을 계산 하 고 5 분 동안 520 x g 에 세포 현 탁 액을 원심.
  2. 상쾌한에서 플라스틱 및 문화 매체 추가 (RPMI + 10 %FBS 106 셀/mL x 0.4의 최종 세포 현 탁 액.
  3. 80 ng/mL 재조합 인간 IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF를 추가 합니다.
  4. 6 잘 플레이트에 잘 당 세포 현 탁 액의 5 mL을 분배.
  5. 37 ° C, 5% CO2에서 7 일 동안 품 어.
  6. 7 일에 그들의 정품 인증 피하기 위해 부드럽게 pipetting으로 세포를 수확.
  7. 5 분 동안 520 x g 에서 원심 분리기.
  8. Aspirate 진공 및 성장 인자 없이 문화 매체의 50 mL에 resuspend.
  9. 520 x g 5 분에 centrifuge 고 1 x 106 셀/mL 문화 매체에서에서 resuspend.
  10. 세포 현 탁 액 (105 셀)의 100 µ L 당 96 잘 플랫 바닥판의 분배.
  11. 1 h 50 추가한 후 37 ° C에 대 한 사전 incubate µ L 4 x의 집중 복합 솔루션, 8 단계에서 설명한 대로 준비: 준비 화합물.
  12. 9 단계에서 설명한 대로 준비 자극 (4 x 집중), 50 µ L를 추가 합니다.
  13. 37 ° c.에 24 시간을 품 어
  14. 96-잘 V-아래 접시에 각 잘 및 전송 셀과 상쾌한 (SN)를 혼합.
  15. 475 x g 5 분에서 아래로 회전 합니다.
  16. 새로운 96-잘 플랫 바닥 접시에 상쾌한을 전송, 인감 및 사용까지-20 ° C에서 동결.

5. monocytes 그리고 PBMCs 냉동/해 동 절차

  1. 동결
    1. 5 분 동안 520 x g 에서 PBMC 또는 monocyte 셀 준비 아래로 회전 합니다.
    2. 진공은 상쾌한 발음 하 고 resuspend 1 x 107 셀/mL에서 중간에 셀.
    3. Cryotubes에 세포 현 탁 액 1 mL를 분배, 특정 냉각 장치에는 튜브를 전송 (참조 자료 테이블)-80 ° c.에 그것을 배치 하 고
  2. 녹고
    1. cryotube을 해 동 하 고 신속 하 게 문화 매체의 9 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 콘텐츠를 전송.
    2. 5 분 동안 520 x g 에서 원심 분리기.
    3. Aspirate 상쾌한 진공 및 문화 매체의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 셀 더 실험적인 처리에 대 한 준비가 지금입니다.

6. 마우스 비장 세포 준비 및 치료

참고: 우리는 지침과 노바 티 스 동물 복지 조직의 표준에 따라 동물 희생을 실시. 연구는 지역 정부 기관의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Kantonales Veterinäramt 더 타트 바젤). 우리는 고통을 최소화 하기 위해 만든 모든 노력 isoflurane 노출, 여 동물을 희생.

  1. 비장을 수확 하 고 분열 조직 기계적 조직 분쇄기 장치를 장착 하 고 가득 찬 RPMI 매체의 5 mL 튜브를 사용 하 여.
  2. 분리 컴퓨터의 비장 프로그램을 사용 하 여 장기를 갈아.
  3. 100 m m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다.
  4. 현 탁 액 50 mL 튜브 및 320 x g에서 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기로 전송.
  5. 진공 aspirate는 상쾌한 차가운 세포의 용 해 버퍼의 3 mL에 셀 펠 릿 resuspend 그리고 ≤2 분 얼음에 품 어.
  6. RPMI 매체의 7 mL을 추가 하 여 세포를 중지 합니다.
  7. 100 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 다시 필터링.
  8. 세포 현 탁 액 330 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 아래로 회전
  9. Aspirate 상쾌한 진공 및 11 x 106 셀/mL (RPMI 보충 10 %FBS, 100 U/mL 펜/단계, 5 µ M β-Mercaptoethanol) 완전 한 매체에서에서 세포를 resuspend.
  10. 플레이트 1 x 106 셀/잘 (90 µ L) 96 잘 접시 (플랫 바닥).
  11. 20 x 5 µ L 집중 단계 8.3에서에서 설명한 대로 이전 RPMI 매체에 희석 복합 솔루션 추가: murine 비장 세포에 대 한 직렬 희석.
  12. 37 ° C, 5% CO2에서 30 분 동안 품 어.
  13. 20 x 5 µ L 집중 DZ (최종 농도 30 µ g/mL) 또는 20 배 농축 LPS + IFN-g (TLR-4) (최종 농도 1 µ M LPS 및 10 ng/mL IFN-g)를 추가 합니다.
  14. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
  15. 10 분 동안 330 x g 에서 원심 분리기.
  16. 새로운 접시에 supernatants 전송, 인감 및 추가 사용까지-20 ° C에서 동결.

7. Cytokines 및 생존 능력 측정

  1. HTRF (균일 시간 해결 형광)에 의해 인간 TNF를 측정
    참고: 프로토콜 다음 공급 업체의 권장 사항, 간단히 아래 요약.
    1. 믹스 1 볼륨 재구성된 시 약 (항 TNF는 cryptate 및 안티 TNF-XL665)의 재구성 버퍼 (50 m m 인산 버퍼 pH 7.0, 0.8 M 칼륨 불 화물 (KF), 0.2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA))의 19 볼륨.
    2. 두 항 체 준비-사용 솔루션은 시 약을 분배 하기 전에 1:1 혼합.
    3. 10 µ L 화이트 384-잘 접시에 3.6 단계에서 supernatants의 분배.
    4. 10 µ L 항 체 혼합의 분배.
    5. 커버 플레이트는 마감재와 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
    6. 접시 microplate 리더 (50-200 플래시)에 읽기.
  2. HTRF (균일 시간 해결 형광)에 의해 인간의 IL 23 측정
    참고: 프로토콜 다음 공급 업체의 권장 사항, 간단히 아래 요약.
    1. 검색 버퍼 # 3의 19 볼륨 재구성된 시 약 (안티 IL-23-cryptate-항 체 및 안티-일-23 d 2 항)에의 한 볼륨 믹스.
    2. 두 항 체 준비-사용 솔루션은 시 약을 분배 하기 전에 1:1 혼합.
    3. 10 µ L 화이트 384-잘 접시에 3.6 단계에서 supernatants의 분배.
    4. 10 µ L 항 체 혼합의 분배.
    5. 커버 플레이트는 마감재와 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
    6. 접시 microplate 리더 (50-200 nm 플래시)에 읽기.
  3. 인간의 일리노이-6, 일리노이-8, IL 1β 및 electrochemiluminescence에 의해 TNF-α 측정
    참고: 모든 샘플 1/150 희석제 2에서에서 희석 했다 (첫번째 희석: 150 µ L에 10 µ L 다음 180 µ L에서 20 µ L). 프로토콜 다음 공급 업체의 권장 사항:
    1. 샘플 및 희석제 2에서 표준 희석.
    2. 희석제 2 1/4 직렬 배 희석을 사용 하 여 표준의 희석을 진행 합니다.
    3. 세 번 세척 버퍼와 세척 접시입니다.
    4. 50 µ L 샘플 또는 잘 당 표준의 분배.
    5. 동요에서 실 온에서 2 h에 품 어.
    6. 4 시간 PBS + 0.05%와 접시를 씻고 음식을 20.
    7. 희석제 3에서 탐지 항 체 (최종 3 mL에 대 한 각 항 체의 60 µ L)의 25 µ L를 추가 합니다.
    8. 동요에서 실 온에서 2 h에 품 어.
    9. 4 시간 PBS + 0.05%와 접시를 씻고 음식을 20.
    10. 읽기 버퍼의 당 150 µ L 추가 거품을 피하고, (tripropylamine을 포함 하는 트리 기반 버퍼 ddH20에에서 2 배 희석) electrochemiluminescence immunoassays 가벼운 발생에 대 한 공동 반응으로.
    11. 멀티플렉스 플레이트 리더에 (지체) 없이 접시를 읽기.
  4. 마우스 공급 업체의 프로토콜을 따르고 ELISA에 의해 TNF를 측정
    1. 상쾌한 분석 결과 희석제 (단백질 포함 된 버퍼를 사용 하 여 준비)에 1:1 희석.
      1. 키트에 설명 된 대로 시 약, 예제 및 표준 희석을 준비 합니다. 각 잘 하 50 μ의 희석제 분석 결과 추가 합니다.
      2. 표준, 제어, 또는 잘 당 샘플의 50 μ를 추가 합니다.
    2. 부드럽게 1 분 동안 접시 프레임을 활용 하 여 혼합.
    3. 제공 된 접착제 스트립과 커버 하 고 실내 온도에서 2 h에 품 어.
    4. 각 잘 하 고 400 μ/잘 (반복이 총에서 5 번 단계) 세척 발음.
    5. 최종 세척 후 발음에 의해 모든 나머지 워시 버퍼를 제거 합니다.
    6. 접시를 반전 하 고 깨끗 한 종이 수건에 대 한 오 점.
    7. 각 잘 추가 마우스 TNF-α 켤레의 100 μ. 새로운 접착제 스트립 커버.
    8. 실 온에서 2 h에 품 어.
    9. 7.4.4 단계 에서처럼 포부/워시를 반복 합니다.
    10. 각 잘 하 기판 솔루션의 100 μ를 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    11. 각 우물에 염 산을 희석된 솔루션 (정지 솔루션)의 100 μ를 추가 합니다. 부드럽게 철저 하 게 혼합 되도록 접시를 누릅니다.
    12. 450에서 광학 밀도 측정 nm (560에서 설정 수정 파장으로 nm) (해야 할 30 분 이내) microplate 리더를 사용 하 여.
  5. 세포 생존 능력
    1. 제거한 후 supernatants PBMC 또는 monocyte 준비에서 resazurin 솔루션 (oxidation-reduction 포함) 10% 최종 농도에 세포 현 탁 액에 직접 추가 사용 하는 준비를 사용 하 여 세포 생존 능력을 평가 합니다.
    2. 1-2 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
    3. 590에서 형광을 읽고 nm (여기 540 nm) microplate 리더를 사용 하 여.

8. 복합 준비

  1. IMoDCs에 대 한 직렬 희석
    1. 희석 MLT-827 재고 솔루션 (10 mM (4 x 집중)를에서 8 µ M를 도달 하는 중간에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에.
    2. 6 단계 1:5 직렬 희석, 매체 + 0.08 %DMSO 사용 하 여 수행 합니다. 차량 (복합) 조건에 대 한 동일한 매체 + 0.08 %DMSO 솔루션을 사용 합니다.
  2. 단 하나의 복용량 iMoDCs에 대 한 테스트
    1. 한 가지 (4 x 집중) 4 µ M를 도달 하는 매체로 MLT-827, AFN700 및 Cpd11 재고 솔루션을 희석.
  3. Murine 비장 세포에 대 한 직렬 희석
    1. 0.1%의 DMSO 최종 농도 0.01 µ m (중간에 한 가지 희석 다음 10 m m 재고 솔루션에서 얻은) 10 µ M MLT-827 솔루션을 희석.
    2. 희석 단계 각 희석의 2 µ L, 우물에 38 µ L RPMI, 피펫으로 5 µ L를 추가.
      참고: 모든 치료는 3 중에서 수행 됩니다.

9. 자극 준비

  1. 고갈된 zymosan (DZ)
    1. Dz.의 10 mg을 멸 균도 무료 물 2 mL를 추가
    2. 균질 재고 솔루션, 소용돌이 사전 각 사용 하는 소용돌이.
    3. -20 ° c.에 aliquot 솔루션 및 저장소 aliquots
  2. 트 레 할 로스-6, 6-dibehenate (TDB)
    1. 1 mg TDB, 물 목욕 15-30 s의 60 ° C에서 열에 DMSO의 100 µ L를 추가 합니다.
    2. 와 동 즉시 살 균 PBS, 다시 소용돌이의 900 µ L을 추가 하 고.
    3. 60 ° C에서 10-15 분에 대 한 열 하 고 균질 vortexing 사전에 의해 사용 합니다.
    4. 4 ° c.에 솔루션을 계속
    5. 직렬 희석 MLT-827 화합물에 관해서는 단일 투여 준비를 수행 합니다.
      참고: TDB DMSO에 준비 하기 때문에, 마지막 1 %DMSO 농도 세포 자극 중입니다.

Representative Results

골수성 세포에서 MALT1 여러 C 형 lectin 같이 수용 체, Dectin 1, Dectin 2, MINCLE6등의 하류 활성화 신호를 릴레이합니다. (앙) ITAM는 수용 체를 포함 하는 주제에 의존 하는이 경로 (예:, Dectin-1) 또는 ITAM 주제 포함 된 공동 수용 체 (예:, FcRγ, Dectin 2, MINCLE)를 채용 하 고 SYK 키 (그림 1)을 활성화. 이 활성화 한 단백질 키 니 아 제 C isoform, 즉 PKCδ, phosphorylates CARD9, CARD9/BCL10/MALT1 복잡 한 형성 및 다운스트림 NF-κB 활성화12TRAF6의 채용 함으로써 실행을 이끌어 낸다. 대조적으로, TLR 4 통로 TRAF6 MYD88/IRAK 종속 방식으로 NF-κB 활성화 (그림 1)에 대 한 하지만 MALT1 독립에 보충 한다. MALT1의 차등이 참여에 대 한 증거는 peptidic 액티브 사이트 억제제 z-VRPR-fmk11,,1314MALT1 결핍 뿐만 아니라 약리 치료의 유전자 모델을 사용 하 여 얻은 했다.

우리는 최근 보고 된 강력 하 고 선택적인 MALT1 억제제 MLT-82715 를 사용 하 고 경우이 화합물 TNF-다운스트림의 생산 C 유형 lectin과 같은 그리고 통행세 같이 수용 체, 각각 규제 것 이라고 물었다. 인간 PBMCs 및 마우스 비장 세포 고갈된 zymosan (DZ, Dectin-1의 알려진된 주 작동 근)을 자극 했다 또는 lipopolysaccharide (LPS, TLR 4의 알려진된 주 작동 근)와 우리 문화 표면에 뜨는 20 h 후 TNF-릴리스 측정. 모두 인간와 마우스 분석 실험, MLT-827 선택적으로 TNF-생산 TLR 4 통로 (그림 2) 아니라 Dectin-1 통로 의해 구동을 차단. 우리는 z-VRPR-fmk 화합물 (보충 그림 1)과 부 화에 유사한 데이터를 얻었다.

통로 인 사이트를 얻으려면, 우리 실험 더 인간 monocytes 그리고 미 숙 monocytes 파생 된 모 수석 세포 (iMoDCs), SYK 억제제 Cpd1116 의 IKK 억제제 AFN700의 MLT-827의 효과 비교15 . Monocytes LPS로 자극된, TNF-α의 생산 하지만 AFN700에 의해 거의 완전 하 게 폐지 했다 Cpd11에 과민 했다 (그림 3A)는 NF-κB/SYK 활동, 각각 (TLR 4 통로의 종속성/독립와 일치 그림 1참조). 대조적으로, iMoDCs에 Dectin-1에 의해 구동 하는 TNF-α 생산 표시 감도 Cpd11 MLT-827 및 AFN700 감도 뿐만 아니라 (그림 3B, 보충 그림 2), 신호 SYK/CBM의 참여에 대 한 추가 증거를 제공 하 Dectin-1 통로 (그림 1)에서 계단식. 주목, 일리노이-1의 생산 일리노이-6, 일리노이-23 Dectin-1 자극에는 또한 3 억제제에 민감한 따라서 TNF-비슷한 규제 메커니즘을 나타내는. 그러나, IL-8 생산에 세 가지 화합물의 제한 된 효과이 cytokine (그림 3B, 그림 2)에 대 한 뚜렷한 규제 메커니즘을 제안 했다.

Dectin-1, Dectin 2, MINCLE, CARD9 signalosome7의 자극을 통해 기능 등 다른 CLLRs 외. 우리는 따라서 iMoDCs MINCLE 주 작동 근 트 레 할 로스-6, 6-dibehenate (미정)와 도전 MLT-827를 테스트. TNF-의 생산을 주도 50 µ g/mL 이상의 미정 농도 높이 일리노이-6와 일리노이-1, MLT-827 (그림 4A)의 차단 효과에서 보듯이 MALT1 paracaspase 활동에 의존. 일관 된 결과 때 가져온 iMoDCs Dectin-1 (그림 4B)를 자극 하는 DZ의 농도 증가 함께 도전.

Figure 1
그림 1: NF-κB 신호 Dectin 1, MINCLE, TLR 4의 다운스트림. 만화는 Dectin 1, Dectin 2, MINCLE 또는 골수성 세포에서 TLR 4의 정식 NF-κB 활성화 경로 다운스트림의 주요 기능을 보여 줍니다. Dectin-1 hemITAM-포함 된 수용 체17 직접 SYK TRAF6 종속 NF-κB 활성화로 이어지는 CBM (CARD9/BCL10/MALT1) 복잡 한 대형 자극을 참여하실 수 있습니다. Dectin-2 또는 MINCLE 같은 다른 C 형 Lectin 같이 수용 체는 CBM 고 NF-κB 활성화 ITAM 포함 된 FcRγ 체인 모집 해야 합니다. TLR 4 수용 체 의존 하는 MYD88 및 IRAK1/IRAK4 kinases 상류 TRAF6의 NF-κB 활성화를 위해 다른 메커니즘을 사용 합니다.

Figure 2
그림 2: Dectin-1 인간에서 TNF-α와 마우스 세포의 생산에 대 한 통해 MALT1 신호. (A) Unterreiner에서 인간 PBMCs 데이터 그 외 여러분, 2017 (그림 2A)11. 인간의 PBMCs LPS (TLR 4 주 작동 근)의 1 ng/mL와 µ g/100ml DZ (Dectin-1 주 작동 근) 20 h 등급된 농도 MLT-827의 존재에 대 한 자극 했다. TNF-는 상쾌한에 출시 된 HTRF에 의해 정량 했다. DZ 또는 1 µ g/mL LPS (B) 마우스 비장 세포 치료와 함께 한 농도 범위의 MLT-827 30 분 및 그 후 30 µ g/mL로 자극 + 10 ng/mL IFN-18 헤 TNF-α 세포 배양 표면에 뜨는 ELISA에 의해 측정 되었다. 3 측정의 ± SEM을 수단으로 비슷한 결과 두 실험 중 하나 표시 됩니다.

Figure 3
그림 3: IKK-또는 SYK-종속성 cytokine 생산의 하류 TLR 4 및 Dectin-1. (A) 인간 monocytes MLT-827로 1 시간에 대 한 사전 처리 했다 (1 µ M), Cpd11 (1 µ M), 또는 AFN700 (3 µ M) 또는 차량 (DMSO). 셀 20 h 10 ng/mL LPS로 자극 했다와 TNF-는 상쾌한에는 HTRF에 의해 계량. (B) TNF-α, 일리노이-1β, 일리노이-6, 인간 monocytes 파생 수지상 세포 (iMoDCs)와 DZ 24 h에 대 한 자극된에 의해 일-23, IL-8 생산 (100 µ g/mL) MLT-827, Cpd11, AFN700 (1 µ M)에 모두와 함께 h 1 사전 부 화 후 또는 DMSO. DMSO 치료 샘플에서 Cytokine 수준 100%에서 설정 했다. 데이터의 3 측정 수단 ± SD 고 3 개의 독립적인 실험의 대표. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001, 짝이 없는 양측 학생의 t 시험.

Figure 4
그림 4: C 타입 lectin 같은 종속 cytokine 생산 iMoDCs. TNF-α, 일리노이-1β, 및 iMoDCs에 의해 일리노이-6 생산 MINCLE 주 작동 근 트 레 할 로스-6, 6-dibehenate (TDB, 100 µ g/mL) 24 h에 대 한 자극 (A) 또는 Dectin-1 주 작동 근 DZ (100 µ g/mL) (B) MLT-827로 1 h 사전 부 화 후 (1 µ M) 또는 DMSO. 데이터의 3 측정 수단 ± SD 고 3 개의 독립적인 실험의 대표.

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Discussion

이 작품에서 우리 인간의 신호 통로 마우스 타고 난 세포를 연구 하 고 MALT1 분해 기능에 대 한 그들의 의존성을 심문 간단한 실험 설정 사용. 이전 작업11에 확대, 우리의 연구 MALT1 paracaspase 활동 C 형 lectin 같은 수용 체 유도 cytokine 생산, TNF-α를 포함 하 여 컨트롤을 보여주었다. 반면, TLR 4 유도 하는 TNF-α MALT1 두 종에서 독립 했다. 샨 다, 이러한 데이터는 MALT1/CBM signalosome 하류 C 형 lectin 같이 수용 체의 이전 연구6,12,18에 의해 공개 됐다이의 키와 선택적 기여 뒷받침.

TLR 4 MALT1 골수성 세포에서에 신호의 명확한 독립 다른 적용 여부 셀 유형 탐험 남아 있다. 예를 들어, B 림프 톨에 TLR 신호 이전 표시 했다 B 세포 항 원 수용 체19의 하류 B 세포 활성화에 기여. 사실, 우리는 증거 TLR 4 자극 인간의 마우스 B 세포 MLT-827에 감도 표시 되지 않은 있다. 따라서, 추가 기계 통찰력 B 세포 수용 체의 하류 귀중 한 것입니다. 이러한 맥락에서 B 세포 림프 종에서 최근 연구는 B 세포 수용 체 및 TLR9 수용 체20의 하류 신호 통로의 클러스터링에 대 한 증거를 제공. B 세포 수용 체에 TLR 경로 NF-κB 활성화를 위한 중재자 역할 TRAF6 MALT1 효소 저해에 두 통로의 감도 설명할 수 있는 크로스 토크의 포인트 될 수도 있습니다. 반대로, TRAF6 NF-κB의 유도 대 한 CLLRs 및 TLRs의 일반적인 다운스트림 선수 이기도 하지만이 두 경로 골수성 세포에서 MALT1 paracaspase 종속 방식에서 누화에 표시 되지 않습니다.

이 작품은 신호 경로 대 한 쉬운 판독을 제공 하 고 복합 프로 파일링 쉽게 구현할 수 있다 cytokine 생산에 집중 했다. 그것은 몇몇 MALT1 생물학 MALT1의 선택적이 고 강력한 억제제의 가치를 강조 했다. 기계적 통찰력을 더 얻기 필요 합니다 추가 작업 및 개발 보다 근 분석 실험의 예를 들어, 레 귤 레이 션 신호 MALT1 타고 난에 참여의 기판의 특성.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리에 대 한 그들의 허가 (면허 번호 4334770630127) Unterreiner 그 외 여러분 에서 여기 그림 2A 를 재현 하는 Elsevier 감사 (2017)입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm nylon cell strainer Sigma CLS431752
14 mL Falcon tube BD Falcon 352057
15 mL Falcon tube Falcon 352090
50 mL Falcon tube Falcon 352070
6 well plates Costar 3516
96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid Costar 3595
96 well V-bottom plate Costar 734-1798
Ammonium Chloride - NH4Cl Sigma A9434
Assay diluent RD1-W ELISA R&D 895038 Assay diluent
Cell culture microplate, 384 well, black Greiner 781986
Depleted Zymosan Invivogen tlrl-dzn now: tlrl-zyd
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO
EDTA-Na2 Sigma E5134 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate
ELISA muTNF-α R&D SMTA00
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
GM-CSF Novartis -
Heat-inactivated Fetal bovine serum Gibco 10082 FBS
HTRF hu IL-23 CisBio 62HIL23PEG
HTRF hu TNF-α CisBio 62TNFPEC
HTRF reconstitution buffer CisBio 62RB3RDE 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA
IFN-γ R&D L4516
IL-4 Novartis -
Isoflurane Abbott Forene
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma L4391 LPS used in human samples
Lipopolysaccharides Sigma L4516 LPS used in murine samples
Lysis buffer Self-made - 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4
Magnet Stemcell 18001
Microplate, 384 well white Greiner 784075
Monocytes enrichment kit Stemcell 19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1°C Freezing Container Nalgene 5100-0001 cooling device (containing Propanol-2)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 Gibco 10010 Phosphate-buffered saline
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 Pen/Strep
Potassium bicarbonate - KHCO3 Sigma P9144
PrestoBlue Invitrogen A13262 Resazurin solution for viability assessment
Propanol-2 Merck 1.09634
Read buffer MesoScale Discovery R92TC-3 Tris-based buffer containing tripropylamine
Recovery cell culture freezing medium Gibco 12648-010 freezing medium
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax Gibco 61870 + 10% FBS for iMoDCs
+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes
+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes
Separation buffer Self-made - PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Trehalose-6,6-dibehenate Invivogen tlrl-tdb TDB
Tween 20 Sigma P7949 Polysorbate 20
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15675 Ethylenediaminetetraacetic acid
Viewseal sealer Greiner BioOne 676070
V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit MesoScale Discovery K15049D electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-Mercaptoethanol Gibco 31350

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References

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골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동
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Unterreiner, A., Touil, R., Anastasi, D., Dubois, N., Niwa, S., Calzascia, T., Bornancin, F. Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity. J. Vis. Exp. (143), e58439, doi:10.3791/58439 (2019).More

Unterreiner, A., Touil, R., Anastasi, D., Dubois, N., Niwa, S., Calzascia, T., Bornancin, F. Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity. J. Vis. Exp. (143), e58439, doi:10.3791/58439 (2019).

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