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Biology

माइलॉयड जन्मजात संकेतन मार्ग विनियमन MALT1 Paracaspase गतिविधि द्वारा

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58439
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Autoimmunity, Transplantation and Inflammation, Novartis Institutes for BioMedical Research
* These authors contributed equally

Summary

MALT1 जन्मजात प्रतिरक्षा को नियंत्रित करता है, लेकिन यह कैसे होता है बीमार परिभाषित रहता है । हम चुनिंदा MALT1 paracaspase अवरोध करनेवाला MLT-८२७ का उपयोग करने के लिए MALT1 के योगदान को सहज संकेतन के बहाव के लिए टोल की तरह या सी-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स की तरह, प्रदर्शन कि MALT1 माइलॉयड साइटोकिंस के उत्पादन को नियंत्रित करता है, और बहाव सी के प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स, चुनिंदा की तरह ।

Abstract

लसीकावत् कोशिकाओं है, जो कई अध्ययनों से संबोधित किया गया है में अपने कार्य के अलावा, paracaspase MALT1 भी जन्मजात कोशिकाओं पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स के बहाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । सबसे अच्छा अध्ययन किया Dectin-1 और Dectin-2 के सदस्यों सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर परिवार की तरह है कि एक SYK-और CARD9-निर्भर संकेतन झरना NF-κB सक्रियण के लिए अग्रणी, एक MALT1-निर्भर तरीके से प्रेरित कर रहे हैं । इसके विपरीत, टोल जैसे रिसेप्टर्स (TLR), जैसे TLR-4, प्रचार NF-κB सक्रियण लेकिन एक MYD88/IRAK-निर्भर झरना के माध्यम से संकेत । फिर भी, चाहे MALT1 TLR में योगदान कर सकते है-4 संकेत अस्पष्ट बनी हुई है । MLT के साथ हाल ही में सबूत-८२७, MALT1 paracaspase गतिविधि के एक शक्तिशाली और चयनात्मक अवरोध करनेवाला, इंगित करता है कि TNF-TLR के उत्पादन बहाव-मानव माइलॉयड कोशिकाओं में 4 MALT1 से स्वतंत्र है, के रूप में TNF का विरोध-उत्पादन बहाव Dectin-1 है, जो MALT1 है निर्भर. यहां, हम पैटर्न मांयता में MALT1 के चयनात्मक भागीदारी को संबोधित किया आगे संवेदन, मानव और माउस सेलुलर तैयारी की एक किस्म का उपयोग कर, और Dectin की उत्तेजना-1, MINCLE या TLR-4 रास्ते । हम भी TNF से परे साइटोकिंस की खोज के द्वारा अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान की-, और एक SYK अवरोध करनेवाला (Cpd11) के लिए MLT-८२७ तुलना करके और एक मतान्ध अवरोध करनेवाला (AFN700) । सामूहिक रूप से, डाटा प्रदान की MALT1-निर्भरता के लिए और अधिक सबूत सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर की तरह-TLR संकेत के विपरीत द्वारा संकेतन ।

Introduction

MALT1 की paracaspase गतिविधि (म्यूकोसा जुड़े लसीकावत् ऊतक लिंफोमा translocation प्रोटीन 1) २००८1,2में पता चला था । तब से, अध्ययन के एक नंबर लिम्फोसाइटों में प्रतिजन रिसेप्टर प्रतिक्रियाओं के लिए अपने महत्वपूर्ण योगदान की सूचना दी है । माउस में आनुवंशिक मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औषध विज्ञान डेटा टी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका, t-सेल में निर्भर उन्मुक्ति और B-सेल लिंफोमा सेटिंग्स3,4में समर्थन करते हैं । लिम्फोसाइटों में, MALT1 paracaspase सक्रियण एक CARD11-BCL10-MALT1 जटिल5, जो प्रतिजन-टी या बी-सेल रिसेप्टर के संकेतन के बहाव से शुरू हो रहा है की विधानसभा पर होता है । वहां भी पर्याप्त सबूत है कि एक समान CARD9-BCL10-MALT1 जटिल सी के बहाव संकेत-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स की तरह (CLLR), जैसे, Dectin-1, Dectin-2 और माइलॉयड कोशिकाओं में MINCLE6,7के प्रवाह का प्रचार के लिए महत्वपूर्ण है । Dectin-1 विशेष रूप से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है क्योंकि इस मार्ग कवक संक्रमण8,9के खिलाफ मेजबान रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । टोल में MALT1 के निहितार्थ-रिसेप्टर (TLR) रास्ते की तरह है, तथापि, विवादास्पद10बनी हुई है । मानव माइलॉयड कोशिकाओं में हाल ही में सबूत TLR-411के TNF-उत्पादन बहाव के विनियमन में MALT1 paracaspase गतिविधि के लिए एक सीधी भूमिका से इनकार किया ।

वर्तमान काम में, हम विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स और मानव और माउस माइलॉयड कोशिकाओं में stimulatory शर्तों सहज संकेतन रास्ते की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, विशिष्ट औषधीय उपकरण अवरोधकों और cytokine उत्पादन की माप पर निर्भर है ।

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Protocol

नोवार्टिस मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशानिर्देशों और मानकों के अनुसार प्रयोग किए गए ।

1. मानव Buffy कोट से परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) की तैयारी

नोट: हम एक दिन के संग्रह के बाद स्वस्थ स्वयंसेवकों से buffy कोट प्राप्त, ५० मिलीलीटर बैग में । वे सूचित सहमति के तहत प्रदान की गई और Blutspende Schweizeriches रो््स Kreuzके माध्यम से एकत्र किया गया । हम उंहें संभाला नीचे की प्रक्रिया का उपयोग कर, कमरे के तापमान पर जब तक अंयथा निर्दिष्ट ।

  1. एक प्लास्टिक की थैली (एक लेमिना प्रवाह के तहत) के साथ एक बाँझ और साफ जोड़ी कैंची और एक 1 एल चोंच की तैयारी करें ।
  2. buffy कोट को यूरिन में ट्रांसफर करें और इसे कैंची से सावधानीपूर्वक खोलें ।
  3. एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, १०० मिलीग्राम फॉस्फेट-बफर खारा बफर/ethylenediaminetetraacetic एसिड (पंजाब/EDTA: पंजाबियों 1x पीएच ७.४ युक्त कोई CaCl2 और कोई MgCl2, 2 मिमी EDTA पीएच ८.० के साथ पूरक) ।
    नोट: एक ही पिपेट का प्रयोग और के बाद धीरे समाधान pipetting ऊपर और नीचे, 6 शंकु के केंद्रापसारक ट्यूबों में पतला buffy कोट के 25 मिलीलीटर वितरण ५० मिलीलीटर पूर्व polysaccharide के 15 मिलीलीटर के साथ भरा घनत्व ढाल ।
  4. केंद्रापसारक मध्यम त्वरण के साथ ८०० x जी पर 20 मिनट (9 से बाहर 4 पर सेट) और ब्रेक के बिना अपने घनत्व के आधार पर कोशिकाओं के विभाजन के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: केंद्रापसारक के बाद, तीन परतों दिखाई जाएगी; एक लाल रक्त कोशिकाओं और granulocytes, प्लाज्मा से बना एक ऊपरी परत से युक्त गोली, और एक सफेद परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) युक्त अंगूठी के बीच में ।
  5. फसल PBMC अंगूठी एक 10 मिलीलीटर पिपेट और नए ५० मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण का उपयोग कर ।
    नोट: दो से ३ ५० मिलीलीटर ट्यूब आम तौर पर buffy कोट प्रति आवश्यक हैं । इस स्तर पर, कुछ प्लाज्मा की संभावना एकत्र PBMCs, जो बाद में संवर्धन कदम पर कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए दूषित ।
  6. ऊपर ५० मिलीलीटर हर ट्यूब का उपयोग कर पंजाब/EDTA और कम केंद्रापसारक समय और गति के साथ तीन उत्तराधिकारी धोने के लिए आगे बढ़ना (५२० एक्स जीमें 15 मिनट, ३३० एक्स जीमें 10 मिनट, १५० x जी में 8 मिनट) ।
    नोट: हर कदम पर, supernatant एक तरल अपशिष्ट कंटेनर में बंद डाल दिया है और सेल गोली EDTA के ५० मिलीलीटर में resuspend है (छर्रों पहली धोने के बाद जमा हो सकता है) ।
  7. अंतिम धोने के बाद, एक बर्फ ठंड lysis बफर के 25 मिलीलीटर में गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) को आसमाटिक दबाव से लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे ।
  8. जब तक समाधान साफ हो जाता है (कमरे के तापमान पर ≤ 5 मिनट) ।
  9. जुदाई बफर के 25 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो (पंजाबियों 1x ph ७.४ कोई CaCl2 और कोई MgCl2युक्त, 2% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1 मिमी EDTA पीएच ८.०) ।
  10. १५० x g पर 8 मिनट के लिए एक और समय धो लें ।
    नोट: इस स्तर पर PBMCs एक थोक जनसंख्या के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (चरण 3: PBMCs और monocytes उपचार और stimulatory शर्तों देखें) या monocyte संवर्धन के लिए संसाधित (देखें चरण 2: monocytes से PBMCs की तैयारी), या क्रमिक उपयोग के लिए नीचे जमे हुए (चरण 5 देखें: Monocytes और PBMCs फ्रीजिंग प्रक्रियाओं) ।

2. PBMCs से Monocytes की तैयारी

  1. पृथक्करण बफर में कदम १.१० पर प्राप्त PBMCs resuspend और 5 x 107कोशिकाओं/एमएल तक पहुंचने के लिए उंहें गिनती ।
  2. कैप के साथ एक 14 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  3. सेल सस्पेंशन, भंवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की मशीन के प्रति मिलीलीटर monocyte संवर्धन एंटीबॉडी कॉकटेल के ५० µ एल जोड़ें ।
  4. कोशिकाओं की मिलीलीटर प्रति monocyte संवर्धन मोतियों की ५० µ एल जोड़ें ।
    नोट: इस मोतियों को निलंबन की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से भंवरित होना चाहिए ।
  5. मोतियों को जोड़ने के बाद, शीघ्र ही सेल निलंबन और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट की मशीन भंवर ।
  6. जुदाई बफर के साथ ट्यूब के ऊपरी भाग कुल्ला जब तक ट्यूब 10 मिलीलीटर तक भरा है ।
  7. धीरे pipetting ऊपर और नीचे से समाधान मिश्रण ।
  8. टोपी के बिना एक जुदाई चुंबक में ट्यूब प्लेस ।
  9. कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए मशीन ।
  10. एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में धीरे डालो ।
  11. इस स्तर पर, सीधे monocytes का उपयोग करें (चरण 3 देखें: PBMCs और monocytes उपचार और stimulatory शर्तों) या उंहें मैंmmature मोnocyte में अंतर-व्युत्पंन डीendritic सीपक्षएस (iMoDCs) (4 कदम देखें), या उंहें बाद में उपयोग के लिए नीचे फ्रीज (चरण 5 देखें) ।

3. PBMCs और Monocytes उपचार और Stimulatory शर्तें

  1. कोशिकाओं की गणना और उन्हें संस्कृति माध्यम में पतला (रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम (RPMI) 10% FBS + 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट + १०० यू/एमएल पेनिसिलिन Streptomycin (पेन/Strep) + 5 µ m β-mercaptoethanol), १.२५ x 104 कोशिकाओं के लिए नीचे/
  2. एक ३८४-खैर प्लेट के प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 30 µ एल वितरित करें ।
  3. ३७ ° c, 5% CO2पर 1 h के लिए 4x केंद्रित यौगिक समाधान और पूर्व-मशीन के 15 µ एल जोड़ें ।
  4. १०० µ जी के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी/एमएल, या समाप्त zymosan (DZ) के अंतिम एकाग्रता के लिए lipopolysaccharide (एलपीएस) जोड़ें, या सादे माध्यम में रखने के लिए ।
  5. ३७ ° c, 5% CO2पर रातोंरात मशीन ।
  6. supernatant के 10 µ एल लो स्रावित TNF को मापने के लिए-एक स्तर (देखें चरण 7: साइटोकिंस और व्यवहार्यता माप) ।

4. iMoDCs और Stimulatory स्थितियों में Monocytes विभेद

  1. गिनती monocytes (2 कदम पर समृद्ध) और 5 मिनट के लिए ५२० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  2. पिपेट बंद supernatant और संस्कृति मध्यम जोड़ें (RPMI + 10% FBS ०.४ x 106 कोशिकाओं के एक अंतिम सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए/
  3. ८० एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-4 + १०० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ जोड़ें ।
  4. एक 6-अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से 5 मिलीलीटर सेल निलंबन के वितरण ।
  5. ३७ ° c, 5% CO2पर 7 दिनों के लिए मशीन ।
  6. 7 दिन में, pipetting धीरे से फसल कोशिकाओं को अपने सक्रियण से बचने के लिए ।
  7. 5 मिनट के लिए ५२० x g पर केंद्रापसारक ।
  8. वैक्यूम महाप्राण और विकास कारकों के बिना संस्कृति माध्यम के ५० मिलीलीटर में resuspend ।
  9. 5 मिनट के लिए ५२० x g पर केंद्रापसारक और 1 एक्स 106 कोशिकाओं में resuspend/
  10. वितरण १०० सेल निलंबन के µ एल (105 कोशिकाओं) के प्रति अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट ।
  11. पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मशीन 4x केंद्रित यौगिक समाधान के ५० µ एल जोड़ने के बाद, के रूप में तैयार कदम 8: यौगिकों तैयारी में वर्णित है ।
  12. उत्तेजनाओं के ५० µ एल जोड़ें (4x केंद्रित), तैयार के रूप में 9 कदम पर वर्णित है ।
  13. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे की मशीन ।
  14. एक अच्छी तरह से और स्थानांतरण कोशिकाओं और supernatant (SN) एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट में मिलाएं ।
  15. 5 मिनट के लिए ४७५ x g पर नीचे स्पिन ।
  16. स्थानांतरण supernatant में एक नया ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट, सील और फ्रीज में-20 डिग्री सेल्सियस तक आगे का उपयोग करें ।

5. Monocytes और PBMCs जमने वाली प्रक्रियाओं/

  1. ठंड
    1. 5 मिनट के लिए ५२० x जी में PBMC या monocyte सेल की तैयारी नीचे स्पिन ।
    2. वैक्यूम महाप्राण 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल में ठंड मध्यम में supernatant और पुनर्निलंबित कोशिकाओं ।
    3. cryotubes में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर वितरण, एक विशिष्ट शीतलक डिवाइस के लिए ट्यूबों हस्तांतरण (सामग्री तालिका देखें) और यह जगह-८० ° c ।
  2. विगलन
    1. cryotube गल और जल्दी से एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब संस्कृति माध्यम के 9 मिलीलीटर युक्त में अपनी सामग्री हस्तांतरण ।
    2. 5 मिनट के लिए ५२० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. वैक्यूम महाप्राण supernatant और संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । सेल अब आगे प्रयोगात्मक प्रसंस्करण के लिए तैयार हैं ।

6. माउस तिल्ली कोशिकाओं तैयारी और उपचार

नोट: हम नोवार्टिस पशु कल्याण संगठन के दिशा निर्देशों और मानकों के अनुसार पशु बलि का आयोजन किया । अध्ययन क्षेत्रीय अशासकीय प्राधिकरण (Kantonales Veterinäramt डेर Stadt बासल)की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किए गए । हम पर isoflurane द्वारा पशुओं का बलिदान-जोखिम, सभी को दुख कम करने के लिए किए गए प्रयासों के साथ ।

  1. तिल्ली और अलग कर देना ऊतक एक यांत्रिक ऊतक चक्की डिवाइस से सुसज्जित ट्यूब का उपयोग कर फसल और ठंड RPMI मध्यम के 5 मिलीलीटर से भरा ।
  2. अंगों को पीसने के लिए पृथक्करण मशीन के प्लीहा कार्यक्रम का प्रयोग करें ।
  3. एक १०० mm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर ।
  4. ५० मिलीलीटर ट्यूबों में निलंबन स्थानांतरण और 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ३२० x gपर केंद्रापसारक
  5. वैक्यूम महाप्राण supernatant, बर्फ ठंडा lysis बफर के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और बर्फ पर ≤ 2 मिनट के लिए मशीन ।
  6. RPMI मीडियम के 7 मिलीलीटर जोड़कर lysis रोकें ।
  7. एक १०० µm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से फिर से फ़िल्टर ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३३० x g पर सेल सस्पेंशन डाउन स्पिन ।
  9. वैक्यूम महाप्राण supernatant और कोशिकाओं को पुनः निलंबित 11 x 106 कोशिकाओं/एमएल में पूर्ण मध्यम (RPMI पूरक के साथ 10% FBS, १०० U/एमएल पेन/कदम और 5 µ m β-Mercaptoethanol) ।
  10. प्लेट 1 x 106 कोशिकाओं को अच्छी तरह से (९० µ एल) एक ९६ में अच्छी तरह से थाली (नीचे सपाट) ।
  11. जोड़ें 5 µ 20x केंद्रित यौगिक पहले RPMI माध्यम में पतला समाधान के रूप में चरण ८.३: murine तिल्ली कोशिकाओं के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने के रूप में वर्णित है ।
  12. ३७ ° c, 5% CO2पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  13. 20x केंद्रित DZ के 5 µ l को जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 30 µ g/ml) या 20x केंद्रित एलपीएस + IFN-g (TLR-4) (अंतिम एकाग्रता 1 µ m एलपीएस और 10 एनजी/एमएल IFN-जी) ।
  14. ३७ ° c, 5% CO2पर रातोंरात मशीन ।
  15. 10 मिनट के लिए ३३० x g पर केंद्रापसारक ।
  16. स्थानांतरण नई प्लेटों में supernatants, सील और अधिक उपयोग जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।

7. साइटोकिंस और व्यवहार्यता मापन

  1. मानव TNF-HTRF द्वारा एक माप (समरूप समय हल प्रतिदीप्ति)
    नोट: प्रोटोकॉल आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद, संक्षेप में नीचे संक्षेप ।
    1. पुनर्गठन बफर (५० मिमी फॉस्फेट बफर पीएच ७.०, ०.८ एम पोटेशियम फ्लोराइड (KF), ०.२% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)) के 19 संस्करणों के साथ पुनर्गठित रिएजेंट (एंटी TNF-ए-cryptate और एंटी-TNF-a-XL665) के 1 खंड मिक्स ।
    2. मिश्रण दो तैयार करने के लिए उपयोग एंटीबॉडी समाधान 1:1 बस रिएजेंट वितरण करने से पहले ।
    3. ३.६ कदम से सफेद ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों में supernatants के 10 µ एल वितरण ।
    4. एंटीबॉडी मिश्रण के 10 µ l को बांटे ।
    5. एक मुहर के साथ प्लेट को कवर और 4 ° c रात भर में गर्मी ।
    6. एक microplate पाठक (50-200 फ्लैश) पर थाली पढ़ें ।
  2. मानव IL-23 HTRF द्वारा माप (समरूप समय हल प्रतिदीप्ति)
    नोट: प्रोटोकॉल आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद, संक्षेप में नीचे संक्षेप ।
    1. (एंटी आईएल-23-cryptate-एंटीबॉडी और एंटी-il-23 D2-एंटीबॉडी) का पता लगाने बफर #3 के 19 संस्करणों के साथ पुनर्गठन एजेंट का एक खंड मिश्रण ।
    2. मिश्रण दो तैयार करने के लिए उपयोग एंटीबॉडी समाधान 1:1 बस रिएजेंट वितरण करने से पहले ।
    3. ३.६ कदम से सफेद ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों में supernatants के 10 µ एल वितरण ।
    4. एंटीबॉडी मिश्रण के 10 µ l को बांटे ।
    5. एक मुहर के साथ प्लेट को कवर और 4 ° c रात भर में गर्मी ।
    6. एक microplate पाठक पर थाली पढ़ें (50-200 एनएम फ़्लैश) ।
  3. मानव आईएल-6, आईएल-8, आईएल-1β और TNF-α माप electrochemiluminescence द्वारा
    नोट: सभी नमूनों में 1/150 पर पतला किया गया मंदक 2 (पहले कमजोर पड़ने: 10 µ l में १५० µ l, फिर 20 µ l में १८० µ l). प्रोटोकॉल आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद:
    1. मंदक 2 में नमूनों और मानक पतला ।
    2. मंदक 2 में मानक के कमजोर पड़ने के लिए आगे बढ़ना एक 1/4 धारावाहिक गुना कमजोर पड़ने का उपयोग कर ।
    3. धोने बफर के साथ तीन बार प्लेटें धो लें ।
    4. वितरण ५० नमूनों या मानक के प्रति अच्छी तरह से µ एल ।
    5. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
    6. पंजाब के साथ चार बार प्लेट धो + ०.०५% Polysorbate 20 ।
    7. मंदक 3 में 3 मिलीलीटर फाइनल के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के 25 µ l का डिटेक्शन एंटीबॉडी (६० µ l) जोड़ें ।
    8. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
    9. पंजाब के साथ चार बार प्लेट धो + ०.०५% Polysorbate 20 ।
    10. बुलबुले से परहेज, पढ़ने के बफर के प्रति अच्छी तरह से १५० µ एल जोड़ें (Tris आधारित tripropylamine युक्त बफर,2ddH में 2x पतला) एक सह के रूप में electrochemiluminescence immunoassays में प्रकाश पीढ़ी के लिए प्रतिक्रिया ।
    11. एक मल्टीप्लेक्स प्लेट रीडर पर प्लेट (बिना देरी) पढ़ें ।
  4. माउस TNF-है आपूर्तिकर्ता प्रोटोकॉल निंनलिखित एलिसा द्वारा एक माप
    1. पतला परख मंदक में supernatant 1:1 (प्रोटीन युक्त बफर का उपयोग करने के लिए तैयार) ।
      1. किट में वर्णित के रूप में एजेंट, नमूने, और मानक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । प्रत्येक कुआं को परख मंदक के ५० μL जोड़ें ।
      2. मानक, नियंत्रण, या प्रति अच्छी तरह से नमूना के ५० μL जोड़ें ।
    2. धीरे 1 मिनट के लिए प्लेट फ्रेम दोहन से मिश्रण ।
    3. प्रदान चिपकने वाला पट्टी के साथ कवर और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
    4. महाप्राण प्रत्येक अच्छी तरह से और ४०० μL/अच्छी तरह से धो (कुल में पांच बार इस कदम को दोहराने) ।
    5. अंतिम धोने के बाद, aspirating द्वारा किसी भी शेष धोने बफर निकालें ।
    6. प्लेट और साफ कागज तौलिए के खिलाफ दाग उलटा ।
    7. माउस TNF के १०० μL जोड़ें-α संयुग्मी प्रत्येक अच्छी तरह से । एक नया चिपकने वाला पट्टी के साथ कवर ।
    8. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
    9. कदम 7.4.4 में के रूप में आकांक्षा/
    10. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सब्सट्रेट समाधान के १०० μL जोड़ें और प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    11. एक अच्छी तरह से पतला हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान (बंद करो समाधान) के १०० μL जोड़ें । धीरे पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए थाली नल ।
    12. ४५० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय (सुधार तरंग दैर्ध्य ५६० एनएम पर सेट के साथ) एक microplate पाठक का उपयोग कर (30 मिनट के भीतर किया जाएगा) ।
  5. सेल व्यवहार्यता
    1. PBMC या monocyte तैयारी से supernatants हटाने के बाद, सेल व्यवहार्यता का आकलन resazurin समाधान (ऑक्सीकरण कमी संकेतक) का उपयोग करने के लिए तैयार का उपयोग कर 10% अंतिम एकाग्रता के लिए सेल निलंबन के लिए सीधे जोड़ा ।
    2. ३७ ° c, 5% CO2में 1 से 2 ज के लिए मशीन ।
    3. ५९० एनएम (उत्तेजना ५४० एनएम) एक microplate रीडर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति पढ़ें ।

8. यौगिक तैयारी

  1. iMoDCs के लिए सीरियल कमजोर पड़ने
    1. पतला MLT-८२७ स्टॉक समाधान (dimethyl sulfoxide में 10 मिमी (DMSO) मध्यम में एक जाना (4x केंद्रित) में 8 µ मीटर तक पहुंचने के लिए ।
    2. एक छह-चरण 1:5 सीरियल कमजोर पड़ने, मध्यम + ०.०८% DMSO का उपयोग करते हुए । वाहन (कोई यौगिक) शर्त के लिए एक ही मध्यम + ०.०८% DMSO समाधान का उपयोग करें ।
  2. iMoDCs के लिए एकल खुराक परीक्षण
    1. मध्यम में MLT-८२७, AFN700 और Cpd11 शेयर समाधान पतला एक जाना (4x केंद्रित) में 4 µ मीटर तक पहुंचने के लिए ।
  3. murine तिल्ली कोशिकाओं के लिए सीरियल कमजोर पड़ने
    1. एक 10 µ एम MLT-८२७ समाधान पतला (एक 10 मिमी स्टॉक समाधान से प्राप्त एक के बाद मध्यम में कमजोर पड़ने) ०.०१ µ एम, ०.१% की एक DMSO अंत एकाग्रता के साथ ।
    2. कमजोर पड़ने वाले कदमों के लिए, प्रत्येक कमजोर पड़ने के 2 µ एल ले लो, ३८ µ एल RPMI जोड़ें, और प्लास्टिक 5 µ एल में अच्छी तरह से ।
      नोट: सभी उपचार तपसिल में प्रदर्शन कर रहे हैं ।

9. उत्तेजनाओं की तैयारी

  1. घट zymosan (DZ)
    1. DZ के 10 मिलीग्राम के लिए बाँझ endotoxin-मुफ्त पानी की 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. भंवर homogenize स्टॉक समाधान करने के लिए, भंवर भी पूर्व प्रत्येक का उपयोग करें ।
    3. Aliquot समाधान और स्टोर aliquots पर-20 ° c ।
  2. Trehalose-6, 6-dibehenate (TDB)
    1. जोड़ें १०० µ एल DMSO के लिए 1 मिलीग्राम TDB, गर्मी में ६० ° c एक जल स्नान में के लिए 15 – 30 एस.
    2. भंवर और तुरंत बाँझ पंजाबियों, भंवर फिर से ९०० µ एल जोड़ें ।
    3. 10 के लिए हीट-६० डिग्री सेल्सियस और homogenize पर 15 मिनट पूर्व प्रत्येक उपयोग के भंवर से ।
    4. 4 ° c पर समाधान रखें ।
    5. धारावाहिक कमजोर पड़ने और MLT-८२७ यौगिक के लिए के रूप में एकल खुराक तैयारी प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: क्योंकि TDB DMSO में तैयार करने की जरूरत है, एक अंतिम 1% DMSO एकाग्रता कोशिका उत्तेजना के दौरान मौजूद है ।

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Representative Results

माइलॉयड कोशिकाओं में, MALT1 जैसे Dectin-1, Dectin-2 और MINCLE6के रूप में कई सी-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स, के बहाव सक्रियण संकेत रिले । इन रास्ते (हेम) आईटम आकृति-रिसेप्टर्स युक्त (जैसे, Dectin-1) या आईटम आकृति-युक्त सह रिसेप्टर्स (जैसे, FcRγ, Dectin-2 और MINCLE के लिए) है कि भर्ती और सक्रिय SYK कळेनासे (चित्रा 1) पर भरोसा करते हैं । यह एक प्रोटीन कळेनासे सी isoform, अर्थात् PKCδ, जो phosphorylates CARD9, जिससे CARD9/BCL10/MALT1 परिसर के गठन और TRAF6 के बहाव NF-κB सक्रियकरण12के लिए भर्ती ट्रिगर के सक्रियकरण की ओर जाता है । इसके विपरीत, TLR-4 मार्ग एक MALT1-स्वतंत्र लेकिन MYD88/IRAK-κB सक्रियण (चित्रा 1) के लिए निर्भर तरीके से रंगरूटों में TRAF6 । MALT1 के इस अंतर की भागीदारी के लिए सबूत MALT1 की कमी के आनुवंशिक मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से peptidic सक्रिय साइट अवरोधक z-VRPR-fmk11,13,14के साथ औषधीय उपचार का उपयोग कर प्राप्त किया गया था ।

हम हाल ही में रिपोर्ट शक्तिशाली और चयनात्मक MALT1 अवरोध करनेवाला MLT-८२७15 का इस्तेमाल किया और पूछा कि क्या इस परिसर सी प्रकार लेक्टिन के TNF उत्पादन बहाव को विनियमित करने की तरह है और जैसे टोल रिसेप्टर्स, क्रमशः । मानव PBMCs और माउस प्लीहा कोशिकाओं के साथ उत्तेजित हो गया था समाप्त zymosan (DZ, एक ज्ञात एगोनिस्ट के Dectin-1) या lipopolysaccharide (एलपीएस, एगोनिस्ट के एक ज्ञात TLR-4) और हम मापा TNF-रिलीज संस्कृति में supernatant के बाद 20 ज. दोनों मानव और माउस परख में, MLT-८२७ चुनिंदा TNF अवरुद्ध-उत्पादन Dectin-1 मार्ग से संचालित है, लेकिन TLR-4 मार्ग (चित्रा 2) द्वारा नहीं । हम जेड के साथ मशीन पर समान डेटा प्राप्त-VRPR-fmk यौगिक (अनुपूरक चित्रा 1) ।

मार्ग अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम मानव monocytes में और अपरिपक्व monocytes-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं (iMoDCs) में, MLT-८२७ के प्रभाव की तुलना SYK अवरोध करनेवाला16 Cpd11 के लिए और है कि मतान्ध अवरोध करनेवाला AFN700 15 के लिए आगे प्रयोगों का आयोजन किया . एलपीएस के साथ उत्तेजित monocytes में, TNF के उत्पादन-α लगभग पूरी तरह से निष्प्रभाव द्वारा AFN700 था, लेकिन Cpd11 के प्रति संवेदनशील नहीं था (आंकड़ा 3ए), जो निर्भरता के साथ संगत है/TLR के-4 मार्ग NF पर-κB/SYK गतिविधि, क्रमशः ( चित्र 1देखें) । इसके विपरीत, TNF-α उत्पादन में Dectin-1 द्वारा संचालित iMoDCs में Cpd11 संवेदनशीलता के अलावा MLT के लिए संवेदनशीलता प्रदर्शित-८२७ और AFN700 (चित्र 3 बी, अनुपूरक चित्रा 2), एक SYK की भागीदारी के लिए आगे सबूत उपलब्ध कराने/सीबीएम संकेतन Dectin-1 मार्ग में झरना (चित्रा 1) । उल्लेखनीय, Dectin-1 उत्तेजना पर आईएल-1, आईएल-6 और आईएल-23 का उत्पादन भी तीन अवरोधकों के प्रति संवेदनशील था, जिससे नियामक TNF के समान तंत्र का संकेत-। हालांकि, IL-8 उत्पादन पर तीन यौगिकों के एक सीमित प्रभाव इस cytokine के लिए एक अलग विनियामक तंत्र का सुझाव दिया (चित्र 3 बी, अनुपूरक चित्रा 2) ।

Dectin के अलावा-1, अंय CLLRs, जैसे Dectin-2 और MINCLE, एक CARD9 signalosome7की उत्तेजना के माध्यम से समारोह । हम इसलिए MINCLE एगोनिस्ट Trehalose-6, 6-dibehenate (TBD) के साथ चुनौती दी iMoDCs में MLT-८२७ का परीक्षण किया । ५० µ जी/एमएल के उत्पादन के लिए नेतृत्व के ऊपर TBD सांद्रता स्थापना TNF-, il-6 और il-1, जो MALT1 paracaspase गतिविधि पर भरोसा के रूप में MLT के अवरुद्ध प्रभाव-८२७ (चित्रा 4a) से देखा । सुसंगत परिणाम प्राप्त किया गया जब DZ की सांद्रता बढ़ाने के साथ iMoDCs चुनौतीपूर्ण Dectin-1 (चित्रा 4B) को उत्तेजित करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: NF-κB संकेतन Dectin-1, MINCLE और TLR-4 के बहाव । कार्टून Dectin-1, Dectin-2, MINCLE या TLR-4 माइलॉयड कोशिकाओं में विहित NF-κB सक्रियण मार्ग के बहाव की प्रमुख विशेषताओं को दर्शाया गया है । hemITAM युक्त Dectin-1 रिसेप्टर17 सीधे संलग्न कर सकते हैं SYK सीबीएम को उत्तेजित करने के लिए (CARD9/BCL10/MALT1) जटिल गठन, TRAF6 निर्भर NF-κB सक्रियण के लिए अग्रणी. अंय सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स जैसे Dectin-2 या MINCLE एक आईटम-FcRγ चेन युक्त एक सीबीएम संलग्न करने के लिए भर्ती करने की जरूरत है और NF-κB सक्रिय करें । TLR-4 रिसेप्टर्स NF-κB सक्रियण के लिए एक और तंत्र का उपयोग करें, MYD88 और IRAK1 पर भरोसा/IRAK4 kinases के नदी के ऊपर ।

Figure 2
चित्रा 2: मानव और माउस कोशिकाओं में TNF-α के उत्पादन के लिए MALT1 के माध्यम से Dectin-1 संकेत. (क) Unterreiner एट अल., २०१७ (चित्रा 2a)11के रूप में मानव PBMCs डेटा । मानव PBMCs एलपीएस के 1 एनजी/एमएल (TLR-4 एगोनिस्ट) या १०० µ जी/एमएल DZ (Dectin-1 एगोनिस्ट) MLT-८२७ के वर्गीकृत सांद्रता की उपस्थिति में 20 एच के लिए प्रेरित किया गया । TNF-supernatant में स्पर्म को HTRF ने quantified था. (ख) माउस तिल्ली कोशिकाओं 30 मिनट के लिए MLT-८२७ की एक एकाग्रता सीमा के साथ इलाज किया गया और बाद में 30 µ g/एमएल DZ या 1 µ g/एमएल एलपीएस के साथ उत्तेजित + 10 एनजी/एमएल IFN-के लिए 18 एच । सेल कल्चर supernatant में TNF-α को एलिसा से मापा गया । इसी तरह के परिणामों के साथ दो प्रयोगों में से एक दिखाया गया है, के रूप में तीन माप का ± SEM ।

Figure 3
चित्र 3: मतान्ध-और/या SYK-TLR-4 और Dectin-1 के cytokine उत्पादन बहाव की निर्भरता । (क) मानव monocytes को MLT-८२७ (१ µ मीटर), Cpd11 (१ µ मी), या AFN700 (३ µ मी) या वाहन (DMSO) के साथ १ एच के लिए पूर्व-उपचार किया गया. कोशिकाओं को 10 एनजी/एमएल एलपीएस के लिए 20 एच और TNF के साथ उत्तेजित थे-में supernatant HTRF द्वारा quantified था । (ख) TNF-α, आईएल-1β, आईएल-६, il-23 और il-8 मानव monocytes द्वारा उत्पादन-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं (iMoDCs) DZ के साथ 24 घंटे के लिए प्रेरित (१०० µ g/एमएल) के बाद 1 एच MLT के साथ पूर्व-मशीन-८२७, Cpd11, AFN700 (सभी पर 1 µ m) या DMSO । DMSO-उपचारित नमूनों में Cytokine का स्तर १००% पर सेट किया गया । डेटा का अर्थ है ± तीन माप के एसडी, और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । * P < ०.०५; * * P < ०.०१; पी < ०.००१, दो पूंछ वाले छात्र का टी टेस्ट ख़राब.

Figure 4
चित्र 4: C प्रकार लेक्टिन-जैसे-निर्भर cytokine उत्पादन iMoDCs द्वारा । TNF-α, il-1β, और il-6 उत्पादन iMoDCs द्वारा MINCLE एगोनिस्ट Trehalose के साथ 24 ज के लिए प्रेरित-6, 6-dibehenate (TDB, १०० µ g/ml) (A) या साथ Dectin-1 एगोनिस्ट DZ (१०० µ g/ml) (B) के बाद 1 ज प्री-मशीन के साथ MLT-८२७ (1 µ m) या DMSO. डेटा का अर्थ है ± तीन माप के एसडी और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.

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Discussion

इस काम में, हम मानव और माउस सहज कोशिकाओं में संकेत रास्ते का अध्ययन करने के लिए सरल प्रयोगात्मक सेटिंग्स का इस्तेमाल किया, और MALT1 proteolytic समारोह पर उनकी निर्भरता पूछताछ. पिछले काम11पर विस्तार, हमारे अध्ययन से पता चला है कि MALT1 paracaspase गतिविधि सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर प्रेरित cytokine उत्पादन की तरह नियंत्रण, TNF-α सहित. इसके विपरीत, TLR-4-प्रेरित TNF-α दोनों प्रजातियों में MALT1 से स्वतंत्र था । सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों पुष्टि MALT1/सीबीएम signalosome बहाव के सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स, जो पहले अध्ययन द्वारा अनावरण किया गया था की कुंजी और चयनात्मक योगदान6,12,18।

चाहे TLR-4 माइलॉयड कोशिकाओं में MALT1 पर संकेतन के स्पष्ट निर्भरता अंय प्रकार की कोशिका पर लागू होता है के लिए पता लगाया है । उदाहरण के लिए, b-लिम्फोसाइटों में, TLR सिग्नलिंग पहले बी-सेल antigen रिसेप्टर19के b-कक्ष सक्रियण बहाव में योगदान करने के लिए दिखाया गया था । वास्तव में, हम अप्रकाशित सबूत है कि TLR-4 उत्तेजित मानव और माउस बी कोशिकाओं MLT के लिए संवेदनशीलता प्रदर्शन-८२७ । इसलिए, आगे बी-सेल रिसेप्टर के यंत्रवत अंतर्दृष्टि बहाव मूल्यवान हो जाएगा । इस संदर्भ में, बी सेल लिंफोमा में हाल के एक अध्ययन के संकेतन रास्ते बी सेल रिसेप्टर और TLR9 रिसेप्टर20के बहाव के clustering के लिए सबूत प्रदान की है । TRAF6, जो दोनों बी सेल रिसेप्टर और TLR रास्ते में NF-κB सक्रियण के लिए एक मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है, crosstalk का एक बिंदु है, जो दोनों रास्ते की संवेदनशीलता को MALT1 के लिए संकोच निषेध समझा जा सकता है हो सकता है । इसके विपरीत, TRAF6 भी NF-κB की प्रेरण के लिए CLLRs और TLRs के एक आम बहाव खिलाड़ी है, लेकिन इन दो रास्ते माइलॉयड कोशिकाओं में एक crosstalk MALT1-निर्भर तरीके से paracaspase करने के लिए दिखाई नहीं देते ।

यह काम cytokine उत्पादन पर केंद्रित है, जो संकेत रास्ते के लिए एक आसान readout प्रदान करता है और यौगिक रूपरेखा के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है । यह चयनात्मक और unravelling MALT1 जीवविज्ञान के लिए MALT1 के प्रबल अवरोधकों के मूल्य पर प्रकाश डाला । आगे यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के अतिरिक्त काम और अधिक समीपस्थ परख के विकास की आवश्यकता होगी, उदाहरण के लिए, जंमजात संकेतन विनियमन में शामिल MALT1 के सब्सट्रेट विशेषताएं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनके प्राधिकरण (लाइसेंस नंबर ४३३४७७०६३०१२७) के लिए Elsevier धंयवाद यहां Unterreiner एट अल से चित्रा 2a प्रतिलिपि । (२०१७) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm nylon cell strainer Sigma CLS431752
14 mL Falcon tube BD Falcon 352057
15 mL Falcon tube Falcon 352090
50 mL Falcon tube Falcon 352070
6 well plates Costar 3516
96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid Costar 3595
96 well V-bottom plate Costar 734-1798
Ammonium Chloride - NH4Cl Sigma A9434
Assay diluent RD1-W ELISA R&D 895038 Assay diluent
Cell culture microplate, 384 well, black Greiner 781986
Depleted Zymosan Invivogen tlrl-dzn now: tlrl-zyd
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO
EDTA-Na2 Sigma E5134 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate
ELISA muTNF-α R&D SMTA00
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
GM-CSF Novartis -
Heat-inactivated Fetal bovine serum Gibco 10082 FBS
HTRF hu IL-23 CisBio 62HIL23PEG
HTRF hu TNF-α CisBio 62TNFPEC
HTRF reconstitution buffer CisBio 62RB3RDE 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA
IFN-γ R&D L4516
IL-4 Novartis -
Isoflurane Abbott Forene
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma L4391 LPS used in human samples
Lipopolysaccharides Sigma L4516 LPS used in murine samples
Lysis buffer Self-made - 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4
Magnet Stemcell 18001
Microplate, 384 well white Greiner 784075
Monocytes enrichment kit Stemcell 19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1°C Freezing Container Nalgene 5100-0001 cooling device (containing Propanol-2)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 Gibco 10010 Phosphate-buffered saline
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 Pen/Strep
Potassium bicarbonate - KHCO3 Sigma P9144
PrestoBlue Invitrogen A13262 Resazurin solution for viability assessment
Propanol-2 Merck 1.09634
Read buffer MesoScale Discovery R92TC-3 Tris-based buffer containing tripropylamine
Recovery cell culture freezing medium Gibco 12648-010 freezing medium
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax Gibco 61870 + 10% FBS for iMoDCs
+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes
+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes
Separation buffer Self-made - PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Trehalose-6,6-dibehenate Invivogen tlrl-tdb TDB
Tween 20 Sigma P7949 Polysorbate 20
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15675 Ethylenediaminetetraacetic acid
Viewseal sealer Greiner BioOne 676070
V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit MesoScale Discovery K15049D electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-Mercaptoethanol Gibco 31350

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References

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Unterreiner, A., Touil, R., Anastasi, D., Dubois, N., Niwa, S., Calzascia, T., Bornancin, F. Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity. J. Vis. Exp. (143), e58439, doi:10.3791/58439 (2019).

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