Här beskriver vi ett protokoll för immunisering av de vuxna zebrafiskar (Danio rerio) med DNA-baserad vaccin och Visa validering av en lyckad vaccination händelse. Denna metod är lämplig för den prekliniska screeningen av vaccinkandidater i olika infektion modeller.
Intresset för DNA-baserade vaccination har ökat under de senaste två decennierna. DNA vaccination är baserad på kloning av en sekvens av en valda antigen eller en kombination av antigener i en plasmid, som möjliggör en skräddarsydd och säker design. Förvaltning av DNA-vaccin till värdceller leder till uttrycket av antigener som stimulerar både humorala och cellmedierade immunsvaret. Denna rapport beskriver ett protokoll för kloning av antigen sekvenser i pCMV-andra plasmiden, immunisering av vuxen zebrafiskar med vaccinkandidater genom intramuskulär Mikroskop och den efterföljande elektroporation att förbättra intaget. Vaccinantigen uttrycks som grönt fluorescerande protein (GFP)-fusionsproteiner, vilket gör att bekräftelsen av antigen uttrycket under UV-ljus från levande fisk och kvantifiering av uttrycksnivåerna för fusionsprotein med ELISA, såväl som deras upptäckt med en western blot-analys. Den skyddande effekten av vaccinet kandidaterna testas genom att infektera fisken med Mycobacterium marinum fem veckor efter vaccination, följt av kvantifiering av bakterierna med qPCR fyra veckor senare. Denna metod jämfört med däggdjur prekliniska screening modeller, och ger en kostnadseffektiv metod för preliminära screening av romanen DNA-baserade vaccinkandidater mot en mykobakteriella infektioner. Metoden kan tillämpas ytterligare till screening DNA-baserade vacciner mot olika bakteriella och virala sjukdomar.
De första DNA-vaccin studierna utfördes på 1990-talet1, och sedan dess har DNA-vaccin testats mot olika infektionssjukdomar, cancer, autoimmunitet och allergi2. Hos däggdjur, ett DNA-vaccin mot West Nile-virus i hästar och ett terapeutiskt cancervaccin för hundarnas muntliga malignt melanom har licensierats, men dessa är inte närvarande i klinisk användning2. Förutom det intresse som frammanade av däggdjur studier, har DNA vaccination visat sig vara ett bekvämt sätt att vaccinera odlad fisk mot virussjukdomar. Ett vaccin mot fisk infektiös hematopoetisk nekros virus (IHNV) har använts kommersiellt sedan 2005, och ett vaccin mot infektiös pankreasnekros virus (IPNV) var nyligen licensierade3. Dessutom utvecklas flera DNA-vaccin mot fisk patogener.
Som traditionella vacciner innehåller ofta inaktiverade eller levande försvagade smittämnen, utgör de en potentiell risk för överföring av sjukdomen2. DNA-vaccin, i sin tur avvärja denna risk, eftersom de bygger på administrationen av Plasmiden kodning bakteriella eller virala antigener, snarare än hela patogenen själv2,4. DNA-vaccin tillverkas med DNA rekombination tekniker, vilket gör den exakta utformningen av vaccinantigen och flexibla utformningen av antigen kombinationer och tillsatser i ett enda vaccin konstruera5. Dessutom är produktionen av DNA-vaccin snabbare, enklare och mer kostnadseffektiv än protein-baserade rekombinant vaccin, som är en stor fördel för vaccinkandidat screening ändamål, men också, till exempel vid pandemiskt utbrott 2.
I fisk, de vanligaste administreringsvägar för DNA-vaccin är intraperitoneal, intramuskulär och muntliga3,6,7, medan hos däggdjur, subkutan och intrakutana rutter är ytterligare alternativ2. Efter en intramuskulär injektion, administreras DNA plasmidsna in i cellerna på administrationswebbplatsen (t.ex., mestadels myocyter, men också bosatt antigen-presenterande celler [trupptransportfordon]). Andelen transfekterade celler kan ökas betydligt genom elektroporation2,8. Efter in i cellen, in vissa plasmid DNA i kärnan, där de gener som kodas av Plasmiden är transkriberade2. I detta protokoll använder vi pCMV-andra plasmiden som har en stark allestädes närvarande promotor optimerad för eukaryota uttryck9. I denna konstruktion översätts antigenerna som ett fusionsprotein med en god Jordbrukarsed. GFP kan bekräftelsen av en lyckad vaccination och produktens rätta antigen genom enkel visualisering av antigen uttryck med fluorescens Mikroskop i levande fisk.
Hos däggdjur, har DNA-vaccin visat sig stimulera olika typer av immunsvar beroende på transfekterade cell typer2,5. Transfekterade myocyter utsöndrar antigener i extracellulära eller släppa dem vid celldöd och de antigener som uppslukas av trupptransportfordon, presenteras därefter på stora histocompatibility komplex II molekyler2. Detta utlöser CD4 och CD8 T cell svar, speciellt, förutom B-cell svar2,5,10. I fisk, har T- och B-lymfocyter, liksom dendritiska celler (DCs), identifierats, men deras arbetsfördelning i antigen-presentation är mindre väl förstått11. Zebrafiskar DCs, har dock visat att dela bevarade fenotypiska och funktionella egenskaper med deras däggdjur motsvarigheter12. Dessutom har DNA vaccination visat sig framkalla liknande immunsvar i fisk och däggdjur, inklusive T- och B-cell svar6,13,14,15,16 .
Både larver och vuxna zebrafiskar används allmänt till modell olika infektionssjukdomar, till exempel fisk M. marinum infektion modell av tuberkulos som används i detta protokoll17,18,19,20 ,21,22. I jämförelse med däggdjur modellorganismer, fördelarna med zebrafiskar inkluderar deras liten storlek, snabb reproducerbarhet och låg bostäder kostnader23. Dessa aspekter gör att zebrafiskar en idealisk djurmodell för storskaliga prekliniska screening studier för nya vacciner och läkemedelssubstanser23,24,25.
I detta protokoll beskriver vi hur romanen vaccine antigen kandidater mot mycobacteriosis kan utvärderas med DNA-baserad vaccination av vuxna zebrafiskar. Först beskriver vi hur antigener är klonade in pCMV-andra uttryck plasmiden, följt av ett detaljerat protokoll för intramuskulär injektion av vaccin plasmider och den efterföljande elektroporation i muskel. Ett uttryck för varje antigen bekräftas av fluorescence mikroskopi veckas postimmunization. Effekten av antigen kandidaterna testas sedan genom att experimentellt infektera vaccinerade fisk med M. marinum.
Tillvägagångssättet av immuniseringsämnet vuxen zebrafiskar med DNA-baserad vacciner kräver viss teknisk expertis. Även för en erfaren forskare tar vaccinera en enda fisk ca 3 min, exklusive preparat. Således kan maximalt ungefär 100 fisk vara immuniserade inom en dag. Om mer än 100 fisk krävs för experimentet kan immunizations delas mellan upp till 3 dagar. Förutom kvaliteten på experimentet är tillräcklig utbildning för Tillträdeskriterier för hantering av fisken och utföra immunisering viktigt för välbefinnandet hos fisken. Se till att följa lokala rättsliga och djurskydd regler och riktlinjer när det gäller bostäder fisken, planera experiment, och de kvalifikationer som krävs för de personal som utför experiment.
Sammanfattningsvis finns det flera kritiska steg för att undvika komplikationer i protokollet immunisering. För framgångsrika immunisering, se till att 1) fisken till vara immuniserats är friska och tillräcklig ålder och storlek (immunisering av mer ungfisk kan kräva ner skalning vaccin volymen och elektroporation inställningar); 2) fisken bedövas ordentligt med ingen starkare än 0,02% 3-aminobensoesyra acid ethyl ester, och de förblir sövda under hela förfarandet (anestesi bör hållas så kort som möjligt för att säkerställa indrivning av fisk); 3) svamp pad är ordentligt blöt; 4) vätska injiceras i varje puls från pneumatiska pumpen och, om inte, puls längd justeras (dra nålen något bakåt längs y-axeln kan hjälpa); 5) det finns inga luftbubblor med vaccin lösningen; 6) elektroporation inställningarna och faktiska puls spänning och längd är korrekt. 7) elektroderna inte orsakar hudskador på webbplatsen elektroporation (under elektroporation, hålla elektroderna i mild kontakt med fisken, och släppa fisken omedelbart in i recovery tanken efter elektroporation).
Det är viktigt att övervaka fisken efter elektroporation i återhämtning tanken och att avliva en fisk som visar tecken på obehag. Det är vidare nödvändigt att öva proceduren innan du börjar ett storskaligt experiment, för att säkerställa ett flytande arbetsflöde. Om möjligt, be en tillräckligt utbildade kollega för hjälp med att fylla nålar och elektroporation.
Metoden DNA vaccination kan den skräddarsydda designen av vaccinantigen. Det är möjligt att klona hela antigen eller, helst, markera delar av antigenet baserat på cellulär lokalisering och immunogenicitet24. Dessutom kan metoden att kombinera flera antigener eller tillsatsmedel till en vaccindos konstruera eller injicera flera separata plasmider vid samma tid2. Genom bland annat ett stop-kodon efter sekvensen antigen eller excising den andra genen från plasmiden, är det möjligt att utnyttja samma plasmid vektorn också för att uttrycka antigenen utan efterföljande N-terminala GFP etiketten. Detta kan vara rimliga för att bekräfta resultaten positiv screening, som GFP relativt stora storlek kan påverka vikningen av antigenet och, därmed, begränsa humorala svar potentiellt frammanade med vaccination.
Ett högre antigen uttryck har kopplats till DNA vaccin immunogenicitet2. Elektroporation efter injektion, således tagits med i detta protokoll, eftersom det har visat sig öka uttrycket av antigener eller reporter gener från fyrfaldigt till tiofaldigt i zebrafiskar32. Dessutom orsakar elektroporation som en teknik måttlig vävnadsskada, således framkalla lokal inflammation som ytterligare främjar de vaccininducerade immunsvar2. Däremot, tolereras elektroporation generellt väl. Med den utrustning som används här, praktiskt taget 100% av vuxen zebrafiskar kommer att återhämta sig väl från sex pulserna 40 V används i detta protokoll35.
Förutom att använda elektroporation för att förbättra införandet av vaccinet plasmiden in i cellerna, använder vi en stark allestädes närvarande promotor i vaccin plasmiden och polyA svans slutet 3′ av antigenet för att förbättra antigen uttryck i transfekterade fisk cellerna. I vissa fall om kodon användningen av target patogenen avsevärt skiljer sig från de vaccinerade arterna, har kodon optimering visat sig användbara i ytterligare öka målet gene expression2. I denna zebrafisk –M. marinum modell, dock kodon optimering hade ingen signifikant effekt på uttrycket nivåer av två mykobakteriella modell gener, ESAT-6 och CFP-10, och har således ansetts onödigt i denna modell35 .
Målprofiler gen uttryck har viss tidsmässig variation mellan antigenerna, exempelvis beroende på storleken och strukturen av antigener i fråga. Antigen uttryck är dock oftast liknande inom en grupp av fiskar som immuniserats med samma vaccin. Vanligtvis det ljusaste andra uttrycket observeras fyra dagar till en vecka efter vaccination, men en skala på 2 – 10 dagar är möjligt. Det rekommenderas att validera ett uttryck för varje antigen-andra fusionsprotein i en liten grupp av fisk (2 – 3) innan antigen i ett storskaligt experiment. Om ingen GFP uttryck observeras vid något tillfälle 2 – 10 dagar efter immunisering, se till att 1) protokollet immunisering följdes noga. Alltid har en grupp av fiskar som immuniserats med tomma pCMV-andra plasmiden som positiv kontroll och se till att 2) antigen design och molekylär kloning genomfördes korrekt (adekvat primer design; antigenet och andra taggen är båda i samma behandlingen ram och inga mellanliggande stop kodon ingår). I vissa fall, trots den rätta antigen designen, kan GFP inte identifieras. Detta kan bero på den felaktiga vikning eller snabb nedbrytning av proteinet fusion. Under dessa omständigheter kan det vara nödvändigt att omforma antigenet.
I vacciner som används för att vaccinera odlad fisk, är den plasmid dosen som används typiskt 1 µg eller mindre7,33,34. I zebrafiskar, kan reporter genuttryck också upptäckas efter minst en 0.5 µg plasmid injektion efter elektroporation; dock ökar relativt mål genuttrycket markant med en högre mängd plasmiden per fisk (kompletterande Figur1). Fisk injiceras med pCMV-andra reporter plasmiden, resulterade en injektion med 5-20 µg av Plasmiden i fyra till åtta gånger högre andra nivåer jämfört med fisk injiceras med 0,5 µg. Därför, för att säkerställa en tillräckligt hög mål genuttryck, men ändå ha injektionsvolymer som är liten nog (≤7 µL) för att förhindra överflödig vävnad eller vaccin läckage, valde vi att använda 5 till 12 µg per fisk för att preliminär screening. Förutom vaccin immunogenicitet, en hög nog målet genuttryck krävs att upptäcka reporter genuttryck med fluorescens Mikroskop och western blot, vilket är nödvändigt för screening i syfte att bekräfta den rätta i vivo Översättning av antigen som mål. Emellertid lägre plasmid doser (0,5 – 1 µg) kan vara användbar för andra typer av experimentell användning.
Avslutningsvis kan detta protokoll för immunisering av vuxen zebrafiskar med en DNA-plasmiden användas för preklinisk testning av nya vaccinkandidater mot olika bakteriella eller virala infektioner. Uttrycket av vaccin antigen som ett GFP-fusionsprotein tillåter visualisering av en framgångsrik immunisering händelse och antigen uttryck. Vi tillämpar denna metod för prekliniska screening av romanen vaccinkandidater antigen mot tuberkulos. För detta, vi infektera den zebrafiskar fem veckor efter vaccination och bestämma bakteriella räknas i varje fisk med qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma till medlemmarna i forskargruppen experimentell immunologi, och särskilt till Leena Mäkinen och Hannaleena Piippo, för allt arbetet som de har gjort i att utveckla och optimera vaccinationsprotokoll och deras hjälp i faktiska experiment med hjälp av protokollet.
Detta arbete stöds av Jane Johansson Aatos Erkon Säätiö (Jane och Aatos Erkkos stiftelse; att M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius stiftelsen; att M.R.), konkurrenskraftiga statlig forskning finansieringen av området Expert ansvar i Tammerfors universitet Sjukhus (till M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tammerfors tuberkulos Foundation; att M.R., H.M. och M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (finska kulturfonden; att H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finska mot tuberkulos Stiftelsen; till H.M.), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö och Laina Kivi Foundation; att M.N.) och Tammerfors stad Science Foundation (till M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |