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Medicine

应用短暂的中脑动脉闭塞小鼠模型评价甘草提取物的神经保护作用

doi: 10.3791/58454 Published: December 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

在本研究中, 我们通过建立大脑中动脉闭塞 (mcao) 小鼠模型, 修改了现有的实验方法, 以获得更多的重现性结果。口服甘草和根状茎 (gr) 甲醇提取物 (grex), 脑卒中诱导后, 与未治疗对照组相比, 总梗死量显著降低。

Abstract

脑卒中后脑血流再灌注后的缺血导致神经细胞死亡和脑组织丢失。脑卒中最常用的动物模型是大脑中动脉闭塞 (mcao) 模型。以前的研究报告了不同的梗死大小, 即使在类似的 mcao 条件下使用相同的实验动物物种。因此, 我们开发了一种改进的实验方法来解决这种差异。小鼠接受 mcao 使用长丝作为遮挡材料, 以模拟人类中风条件和灯丝厚度进行优化, 以建立更可重现的梗死体积。脑卒中诱导后用甘草提取物处理的小鼠总梗死体积明显下降, 存活细胞数量相对于未治疗的对照组有所增加。该改进的实验方案成功地和可重现地证明了 grex 对缺血性脑卒中的有益作用。

Introduction

脑血流缺血再灌注引起的脑损伤导致神经细胞死亡和脑组织丢失。随着肥胖、高血压和糖尿病等代谢疾病的传播, 脑血管疾病的发病率不断上升, 这种类型的脑损伤继续增加.全世界老年中风患者的绝对人数急剧增加, 这些患者的医疗费用是一个主要的社会负担, 这些患者往往患有长期残疾。因此, 应尽可能减轻继发性残疾, 以减轻经济负担1,2

脑梗死最常用的啮齿类动物模型是大脑中动脉闭塞 (mcao) 模型, 其中 mca 被硅涂层手术缝合长丝封闭, 以阻断血液流动, 导致缺血性中风3,4. 使用灯丝作为闭塞材料, 可以通过控制腔内灯丝插入的持续时间来控制闭塞时间和持久性。

以往的研究表明, 即使使用相同的啮齿类动物 mcao 模型, 脑梗死的总量也因实验而异, 导致研究的重现性较低。为了提高重现性, 我们优化了实验中使用的细丝薄荷的厚度。脑缺血期和诱发梗死的初步研究结果表明, 缺血期超过 60分钟, 可以观察和量化受损脑组织的体积区域。

甘草, 又名甘草, 由甘草和葛根的干根和根状茎组成. 它已被用于中国和韩国传统医学的各种用途, 包括作为食品添加剂和药用5,6,7

在先前的一项研究8中, gr 甲醇提取物 (grex) 预处理显示出 mcao 小鼠的抗凋亡作用, 包括显著防止 b 细胞淋巴瘤 2 (bcl-2) 和 bcl 超大 (bcl-xl) 蛋白表达的降低。本研究通过评价传统 mcao 小鼠模型在确定 grex 在梗死后处理中的效率, 有效地降低了 mcao 所致脑损伤的梗死体积, 从而提高了该模型的重现性。

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Protocol

所有涉及动物的程序都得到了釜山国立大学道德委员会的批准 (批准号码, pu-2016-1087)。图 1显示了这项研究的图形概述。

1. grex 的准备和管理

注: 本研究中使用的 gr 是从一家商业制药公司购买的。

  1. 将200克 gr 放入 2, 000 毫升甲醇中, 在室温 (25°c) 下孵育5天。
  2. 使用厚度为 0.26 mm、孔径为5μm 的滤纸对混合物进行过滤, 然后去除上清液。在 gr 残渣中加入1000毫升甲醇, 然后再过滤。
  3. 将两种上清液混合, 通过滤纸过滤, 在真空下浓缩, 然后冷冻干燥残渣产生 grex。
  4. 将 grex 溶解在二甲基亚硫酸 (dmso) 中, 用0.9% 的生理盐水稀释, 并通过0.45μm 注射器过滤器进行过滤。然后, 将 dmso 的最终浓度调整为 & lt; 5%。
  5. 通过口腔灌胃再灌注 mcao 后1小时管理 grex (体重 300 mg/kg). 在生理盐水 (10 mL/kg 体重) 中分别对正常组和对照组进行 ddmso 稀释。
    注: 本实验中使用的 grex 浓度是根据我们以前的研究8所显示的活性浓度确定的。

2. mcao 的鼠标模型

  1. 使用6周体重 22-25 g 的雄性 c57bl6 小鼠, 为所有动物提供免费的标准食物和水, 并将它们安置在温度可控 (22±1°c) 和12小时光/黑暗循环的环境中。
    1. 将小鼠分成六只小鼠, 每组由假操作的正常、对照和 grex 治疗组组成。
    2. 进行 mcao 手术 (小泉等人的方法修改).9) 对对照组和 grex 处理组采用立体显微镜。
  2. 在 70% n-2 o 和30% o2 中使用2% 异氟醚诱导小鼠吸入麻醉.当小鼠对尾巴上的机械刺激没有反应时, 麻醉就被认为是足够的。使用连接到温度计的身体保持温度的毯子, 将小鼠的体温保持在36.5°c。
  3. 通过剃须, 然后使用脱毛膏, 取出老鼠胸部和脖子上的所有头发, 用 betadine 擦洗与酒精交替消毒皮肤部位两次, 然后用手术做一个长约2厘米的切口刀片在脖子的中心。从周围结缔组织中仔细分离左颈总动脉 (lcca)、颈外动脉和颈内动脉分支。
  4. 将颈外动脉和颈总动脉与手术缝合线 (4-0 丝缝合线, 半挂结) 结合, 暂时阻断手术中进入颈内动脉的血液流动。
  5. 通过颈内动脉插入硅涂层尼龙缝合线 (8-0 单丝, 长11毫米), 直至左侧 mca 的起源。将长丝的硅涂层部分的厚度调整到 0.10-0.12 mm 的范围内。
  6. 利用激光多普勒流量计测量 mca 中相对脑血流 (rcbf) 的减少情况。当 rcbf 在整个缺血期间保持在 & lt; 20% 的静息条件值时, mcao 将得到确认。
  7. 将插入的长丝固定在血管上 2小时, 而大脑动脉被阻断, 然后小心地取出长丝, 恢复血液流动22小时的再灌注。缝合皮肤缝制在5个地方 (3-0 丝绸缝合, 两个半搭丝结), 让每只老鼠从麻醉中醒来。
  8. 在正常组中, 按照上述相同的过程 (直到 2.4) 执行假操作, 但以下异常。结扎颈总动脉, 缝合切割的肌肉和皮肤。

3. 脑组织受损体积的测量

  1. 在对小鼠进行脑损伤测量后, 用二氧化碳吸入切除小鼠大脑, 在 mcao 发病24小时后, 用虹膜手术剪刀和角度钳切除小鼠的大脑。
    1. 用剪刀取下头部后, 在头部中线皮肤上做一个切口, 从头骨上翻转皮肤。
    2. 用角度钳打破顶骨, 同时剥落硬脑膜物质, 然后将大脑与头骨仔细隔离。
  2. 使用小鼠大脑基质将切除的组织切割成部分 (1 毫米厚), 然后在 2% 2, 3, 5-三苯基四唑氯化铵 (ttc) 的溶液中染色该部分17分钟。
  3. 将10% 福尔拉林中的部分固定至少 2小时, 然后用数码相机拍摄。ttc 将被观察到染色可行的组织红色, 而坏死的区域将是白色的。
  4. 使用 imagej 分析和量化每个部分的脑梗死面积。

4. 组织学切片的血红素、eosin (h & amp; e) 和 cresyl 紫罗兰染色

  1. 用 co2 吸入方法对小鼠进行组织学研究 , 并在心脏上用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对其进行灌注, 然后对小鼠进行10% 的4% 甲醛 (pfa)。使用与上述相同的程序 (3.1) 隔离大脑, 并在一夜之间将大脑浸入30% 蔗糖的10毫升中。
  2. 将脑组织嵌入最佳切割温度 (oct) 化合物中, 并使用低温恒温器将其分形切割成15μm 厚的部分。将切片安装在玻璃幻灯片上, 然后用血红素、eosin (h & amp; e) 或 cresyl 紫色染色。
  3. 将玻璃滑块浸泡在80% 乙醇中 1分钟, 然后在血红素溶液中染色5分钟。
    1. 将幻灯片浸入1% 酸醇两次, 浸泡在饱和碳酸锂溶液中 30秒, 用自来水清洗 30秒, 然后在 eosin 溶液中进行30秒的反污渍。
    2. 用自来水冲洗滑梯, 浸泡 95%, 并连续浸泡绝对乙醇。
    3. 将滑块风干, 用二甲苯清除至少 10分钟, 然后使用安装介质安装盖板。
  4. 将玻璃滑梯放在至少1小时的滑梯上, 然后浸泡在50% 的乙醇中, 用氯仿稀释一夜。
    1. 在40°c 的干烤箱中, 用0.1% 的环己基紫罗兰粉将滑块染色10分钟。
    2. 将95% 乙醇浸泡 30分钟, 然后在绝对乙醇中脱水2次。
    3. 在二甲苯中清除 2次 5分钟, 然后在空气干燥后安装在安装介质上。
  5. 用显微镜观察 mcao 引起的脑损伤后的组织学改变。

5. 统计分析

  1. 用标准偏差的单向分析 (anova) 和 tukey 的事后分析 (数据分析软件), 将实验结果表示为标准偏差, 并确定各组之间的统计意义。
  2. 将统计意义设置为p值 & lt; 0.05。

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Representative Results

在假操作的正常组, 没有观察到脑梗塞, 而在对照组, 观察到相对广泛的损伤区域。在 mcao 模型组给小鼠的 300 mg/kg grex 中, 损伤面积显著减少 (图 2)。

用 h & amp; e 或 cresyl 紫染色缺血性脑切片, 研究其组织学改变。h & amp; e 染色提供有关细胞10的结构信息和特定功能信息, 而 cresyl 紫色染色用于估计海马神经元11的总数。因此, 使用 imagej 软件 (图 3a) 测量的 h & amp; e 或 cresyl 紫罗兰色强度提供了细胞存活的指标。对照组 h & amp; e 和 cresyl 紫染色强度相对于正常组明显下降 (图 3b, 3c)。grex 治疗组的组织学完整性大于对照组 (图 3c), 这意味着神经元细胞死亡程度较低 (图 3 c)。这些结果表明 grex 对缺血再灌注性脑损伤具有强大的神经保护作用。

Figure 1
图 1.大脑中动脉闭塞 (mcao) 模型方案及甘草提取物 (grex) 的甲醇提取物的处理.mcao 再灌注后, 用 300 mg kg grex 1 小时对小鼠进行了治疗, mcao 再灌注后保持了 2小时, mcao 开始后24小时对小鼠进行了安乐死, 然后将采集到的大脑切片保存在深度冷冻中进行蛋白质检测, 或用 ttc 溶液染色, 以进行梗死 测量。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.(a) 大脑切片的代表性图像显示甘草和根状茎 (grex) 治疗的甲醇提取物对大脑中动脉闭塞 (mcao) 诱导的脑梗死体积的影响和 (b) 使用 300 mg/kg grex 1 小时的单一治疗的影响mcao 再灌注后明显抑制梗死体积。结果以±sds. # # #p 与 lt;0.001 与正常组、* * p<0.01 对照组的对比结果;n=6/组。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.(a) 血红素和 eosin (h & amp; e) 和 cresyl 紫罗兰染色脑块和 (b, c) 颜色强度的代表性图像, 用于评估甘草和根状茎 (grex) 甲醇提取物对中大脑的影响脑动脉闭塞 (mcao) 损伤小鼠。使用 (b) h & amp; e 或 (c) cresyl 紫色染色1小时后 mcao 再灌注评估小鼠大脑的组织学完整性和组织损伤。h & amp; e 染色部分的红色染色表示核损伤。用紫罗兰色染色的神经元被染成紫色。grex 治疗组的组织学完整性优于对照组, 显示神经元细胞死亡较少。a、h & amp; e 染色;b, 仙人掌紫罗兰染色;cd, 扩大ab。结果为±sds. # # #p & lt; 0.001, * p<0.05 与正常组和对照组相比;n = 每组6。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

随着慢性高血压、糖尿病、高脂血症等代谢疾病的发病率不断上升, 脑卒中的主要危险因素, 脑卒中的预防和治疗已成为医学研究的一个重要领域12.13. 中风后语言和运动方面的缺陷与脑组织14的损伤程度密切相关, 导致患者及其家属的生活质量差.重要的是要使用一个适当的中风动物模型, 其中涉及相同的病理变化发生在人类疾病, 以研究药物治疗的有效性。mcao 模型通过阻塞脑动脉血管来模拟血栓中风。它通常用于, 因为它是相对可重复和微创16,17,18,19

然而, 通过对一些研究人员报告的相同静息时间所诱导的脑梗死面积的比较, 发现不同研究的总梗死量各不相同。我们的结论是, 这是由于不同的闭塞材料使用和手术程序。因此, 尽管 mcao 啮齿类动物模型被认为是高度可重复性的, 但并不总是能够获得这种可重复性。因此, 通过初步研究和上一次报告8, 优化了小鼠 mcao 模型中使用的细丝厚度。

与其他研究相比, 我们的初步研究最显著的结果是, ttc 染色在缺血诱导60分钟时没有发现任何脑梗死 (数据未显示)。即使在小鼠的 mcao 90分钟和120分钟后, 我们的结果显示, 梗死体积也低于其他研究。这项研究的一个局限性是, 我们还没有确定这些结果的确切原因;不过, 我们正计划在进一步的研究中探讨这一现象。

许多研究最近报告说, gr 或其成分具有药理作用, 包括抗肿瘤、抗菌和抗炎作用20,21,22。先前的一项研究报告说, grex 预处理通过抑制 bcl-2 和 bcl-xl8的蛋白质表达, 有效地抑制了 caspase-9 的活化。然而, 与中风后治疗相比, 中风的预防性治疗在临床上的相关性较低。

在这项研究中, 基于先前的研究, 8评估了 grex 后处理在 mcao 小鼠模型中的有效性。如代表性结果部分所示, grex 治疗后在减少 mcao 所致小鼠脑损伤中的总梗死体积和改善细胞结构损伤具有有益的作用。本研究缺乏 grex 对缺血性脑损伤的具体作用机制, 但本研究中使用的实验方案通过模仿中风对人类的影响, 成功地证明了这种草药疗法的作用。

虽然在这项研究中没有观察到实验结果, 但在我们的初步实验中测量了神经元缺陷评分 (nds), 对照组和 grex 治疗组之间没有明显差异, 这被认为是应该的与中风的严重程度相比, 观察时间较短。我们正计划观察 grex 治疗在造成中度损害后的长期影响。

总之, 本研究证明了 grex 处理在小鼠 mcao 模型中的神经保护作用, 具有良好的重现性。在未来的研究中, 应研究参与基础机制的蛋白质。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

不适用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper Advantec Filter paper No. 2 Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-250ML Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm) Sigma CLS431220 Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope Leica M50 Stereo Microscope
Stereo Microscope Nikon SMZ745 Stereo Microscope
Laser Doppler Moor Instrument moorVMS-LDF Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System Harvard Appratus 34-1352 Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System Harvard Appratus 55-7020 Homeothermic Monitoring System
Digital Camera Canon Eos-M2 Digital Camera
Cryostat Leica CM3050S Cryostat
Microscope Carl Zeiss Zeiss Axio Microscope
Data Analysis Systat Software Inc. SigmaPlot version 12 Data Analysis
Data Analysis NIH Image ImageJ Data Analysis
Mouse diet Doo Yeol Biotech Standard rodent chow Mouse diet
Isoflurane JOONGWAE A02104781 Isoflurane
Isoflurane TROIKAA ISOTROY 100 Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)  AILEE SK47510 Silk suture (4-0 Black silk) 
Silk suture (3-0 White silk)  Baekjae 57 Silk suture (3-0 White silk) 
Nylon suture (8-0 monofilament)  AILEE NB825 Nylon suture (8-0 monofilament) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877-25G 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution) JUNSEI 69360-1263 20KG Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin) YD Diagnostics EasyStain Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution) MUTO PURE CHEMICALS 3200-2 Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate) Sigma C5042-10G Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-1KG Paraformaldehyde 
Sucrose JUNSEI 31365-0350 1KG Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound Scigen 4583 Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife Fine Science Tools 10055-12 Disecting Knife
#4 Forcep Fine Science Tools 11241-30 #4 Forcep
#5 Forcep Fine Science Tools 11254-20 #5 Forcep
#6 Forcep Fine Science Tools 11260-20 #6 Forcep
#7 Fine Forcep Fine Science Tools 11274-20 #7 Fine Forcep
Surgical Scissors Fine Science Tools 14001-12 Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors Fine Science Tools 15371-92 Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep Fine Science Tools 18153-11 Vessel Dilating Forcep

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