Summary
本研究では、中大脳動脈閉塞 (MCAO) マウス モデルを確立することでより再現性のある結果を取得する既存の手法を変更します。芩の経口投与ら減少した根茎 (GR) メタノール抽出物 (GRex)、次のストロークの誘導、対照群に比べ総梗塞ボリューム。
Abstract
虚血後, 脳卒中後の脳血流の再灌流は、神経細胞の死と脳組織の喪失に します。ストロークを研究するための最も一般的に使用される動物モデルは中大脳動脈閉塞 (MCAO) モデルです。前の研究は、同じ実験動物種を MCAO の同様の条件の下で使用した場合にも異なる梗塞サイズを報告しています。そこで、この矛盾に対処する実験手法。マウスは MCAO 人間ストローク条件を模倣する閉塞材料としてフィラメントを使用して, より多くの再現性梗塞容積を確立するフィラメントの厚みを最適化しました。メタノールを投与したマウス抽出芩 et 根茎 (GRex) ストローク誘導を示した大幅減少総梗塞ボリュームと対照群に比べ細胞の生存数の増加。これは実験的プロトコルを正しく修正し、再現性をもって虚血性脳卒中に GRex の有益な効果を発揮します。
Introduction
脳損傷による虚血と再灌流脳血流は、神経細胞の死と脳組織の喪失に します。このタイプの脳損傷は、肥満、高血圧、糖尿病1,2など代謝性疾患の普及により脳血管疾患の増加率で増加を続けています。高齢脳卒中患者の絶対数は世界中で劇的に増加、長期障害残っている多くの場合、これらの患者のための医療費は大きな社会負担。したがって、経済的負担1,2を減らすために可能な限り、二次障害は軽減する必要があります。
脳梗塞の最も一般的に使用される齧歯動物モデルは、MCA が妨げられている血流をブロックするシリコン被覆手術縫合糸と虚血性脳卒中の3、の原因と中大脳動脈 (MCA) 閉塞 (MCAO) モデル4. 閉塞材料のため閉塞時間と永続性の制御内の内腔フィラメント挿入の期間を操作することによってフィラメントを使用しています。
以前の研究では、同じ齧歯類 MCAO モデルを使用するときにも脳梗塞の総量は異なります実験、研究の低再現性の原因を示しています。再現性を高めるためには、実験で使用されるフィラメント ミントの厚さを最適化されています。脳虚血期間 60 分よりも虚血期間が体積領域を許可されることを示した誘導の梗塞の予備的研究の結果では、脳組織観察し定量化を破損しています。
芩 et 大黄 (GR)、として知られている甘草乾燥した根やカンゾウ属の根茎から成っている、 G. glabra 。それは、食品添加物や医薬5,6,7を含む様々 な目的のため中国や韓国の伝統医学で使用されています。
以前研究8、MCAO マウスにおける抗アポトーシス効果を示したグラム メタノール抽出 (GRex) の前処理 (Bcl 2) B 細胞リンパ腫 2 の蛋白質発現の減少の重要な予防と Bcl 特大 (Bcl-xl) を含みます。GRex と梗塞後の治療効果的に削減 MCAO による脳損傷で梗塞ボリュームを判断する際の効率を評価することによって従来の MCAO マウス モデルの再現性を改善するために本研究を行った。
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Protocol
動物を含むすべてのプロシージャは、釜山国立大学 (承認番号、PNU-2016-1087) の倫理委員会によって承認されました。本研究のグラフィカルな概要は図 1に示します。
1. 準備と GRex の管理
注: この研究で使用される GR は製薬会社から購入しました。
- 2,000 mL のメタノールで GR の 200 g を置き、室温 (25 ° C) で 5 日間インキュベートします。
- 厚さ 0.26 mm と 5 μ m の細孔径、フィルター ペーパーを使用して混合物をフィルター、上澄みを取り外します。GR 残基に 1,000 mL のメタノールを追加し、もう一度フィルター処理します。
- 2 つの培養上清を結合、フィルター ペーパーを通してフィルター、真空下で集中、GRex を生成する残留物を凍結乾燥します。
- ジメチルスルホキシド (DMSO)、0.9% 生理食塩水に希釈で GRex を溶かし、0.45 μ m のシリンジ フィルターを介してフィルターします。< 5 %dmso の最終濃度を調整します。
- 経口を介してMCAO の再灌流後 1 h GRex (300 mg/kg 体重) を管理します。それぞれ通常のグループとコントロール グループにのみ生理食塩水 (10 mL/kg 体重) で希釈した DMSO を管理します。
注: この実験で使用される GRex の濃度は、私たちの以前の研究8を通じて活躍した濃度によると決定しました。
2. MCAO のマウスモデル
- 使用男性 c57bl/6 マウスに 6 週間が高齢者し、温度制御 (22 ± 1 ° C) の環境で、12 時間の明暗サイクルの家と水、標準的な食事への無料アクセスとすべての動物を提供する 22 25 g. の重量を量るします。
- 偽手術通常、制御、および GRex 治療グループから成っているべきである六つのマウスをそれぞれのグループにマウスを分割します。
- MCAO 手術 (小泉らの方法の変更を行う9) コントロール、ステレオ顕微鏡を用いた GRex 治療群。
- 2% 70% N2O のイソフルランと 30% O2を使ってマウスの吸入麻酔を誘導します。麻酔と見なされるのに十分なマウスに尾機械的刺激に応答しなくなります。36.5 ± 0.5 ° C 温度保持毛布は、温度計に接続されているボディを使用してマウスの体温を維持します。
- 胸上のすべての毛を削除とシェービングによるマウスの首、脱毛クリームの使用に続いて 2 回アルコールと交互に betadine スクラブで皮膚の手術部位を消毒し約 2 cm の切開を行いますと手術首の中心にブレード。慎重に分離 (LCCA) 左総頸動脈、外頸動脈、周囲の結合組織から内頚動脈の枝。
- 操作中に内頸動脈に外頸動脈と外科的縫合 (4-0 絹糸、ハーフヒッチ ノット) の血流を一時的にブロックすると総頸動脈を縛る。
- 左 MCA の語源に頸動脈をシリコン コーティング ナイロン縫合糸 (8-0 モノフィラメント、長さ 11 mm) を挿入します。0.10 0.12 の範囲にフィラメントのシリコン コーティング部分の肉厚 mm。
- Mca のレーザー レーザードップラー血流計を使用して相対的な脳血流量 (rCBF) の低下を測定します。MCAO は 190. が全体の虚血性の期間の間に休憩状態値の < 20% で維持されるときに確認されます。
- 中大脳動脈を閉塞すると、2 時間血管に挿入されたフィラメントを修正し、再灌流の 22 h の血流を回復するフィラメントを慎重に撤回します。5 場所 (3-0 絹糸、2 つ結びの結び目) で縫うことによって皮膚を縫合、各マウス麻酔から目覚めさせることができます。
- 通常のグループで、次の例外 (2.4) まで上記同じ手順に従う偽操作を実行します。総頸動脈の結紮し、切開筋と皮膚を縫合します。
3. 破損した脳組織の容積の測定
- CO2吸入による脳損傷計測のためマウスの安楽死後、消費税マウス脳のアイリス外科はさみと鉗子を使用して MCAO 発症後 24 h。
- はさみを使って頭を除去した後、頭蓋骨から皮膚を裏返して頭の正中皮膚切開を行います。
- 鉗子と頭頂骨が折れて、問題で、同時に硬膜を剥離し、慎重に頭蓋骨から脳を分離します。
- カット セクション (厚さ 1 mm) に摘出組織マウス脳マトリックスを使用して、2 %2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム) のソリューションで 17 分間のセクションを染色します。
- 少なくとも 2 時間 10% ホルマリンでセクションを修正し、デジタル カメラによる写真します。TTC は、壊死部分が白になります中実行可能な組織を赤に染色する観察されます。
- 分析して ImageJ を用いた各セクションの脳梗塞領域を定量化します。
4. ヘマトキシリンとエオシン (H & E) とクレシル バイオレット染色組織切片
- CO2吸入による組織学的研究用マウスを安楽死させるし、4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 10 mL に続いて 10 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の transcardially を灌流します。(3.1) 上記と同じ手順を使用して脳を分離し、10 mL の 30% ショ糖に脳を一晩浸します。
- 最適切削温度 (OCT) 化合物で脳組織を埋め込み、歯肉クライオスタットを用いて 15 μ m 厚いセクションにスライスします。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) またはクレシル バイオレット染色続くガラス スライド上のセクションをマウントします。
- ヘマトキシリン溶液 5 分間染色後 1 分 80% エタノールでスライド ガラスを浸します。
- 2 回 1% アルコールに酸スライドを浸し、30 の飽和炭酸リチウム溶液に浸す s、30 s、および 30 のエオシン ソリューションで対比染色を水道水でよく洗って s。
- スライドを水道水ですすぎ、連続して 95% と無水エタノールに浸します。
- スライドを風乾、キシレン、少なくとも 10 分のためにそれらをクリアし、メディアをマウントを使用して coverslips をマウントします。
- 一晩クロロホルムで希釈 50% エタノールに浸漬後、少なくとも 1 時間暖かいスライドのスライド ガラスを配置します。
- 40 ° C の乾燥オーブンで 10 分間 0.1% クレシル バイオレットとスライドを染色します。
- 30 分の 95% エタノールに浸漬し、2 回の無水エタノールの脱水します。
- キシレン 5 分で 2 回をクリアし、空気乾燥した後、メディアをマウントをマウントします。
- 顕微鏡を使用して、MCAO 誘発脳損傷後に発生した組織学的変化を調べる。
5. 統計解析
- 平均 ± 標準偏差として実験結果を表現し、一方向の分散分析 (ANOVA) テューキー投稿アドホック分析データ解析ソフトウェアを使用して続いてを使用してグループ間の統計的有意性を決定します。
- Pで統計的有意性を設定-< 0.05 の値します。
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Representative Results
Sham の通常のグループ被災地の比較的広い範囲を観察対照群で脳梗塞が認められなかった。マウス投与 300 mg/kg GRex MCAO モデル グループ、被災地域の統計的に有意な減少は (図 2) に観察されます。
H & E またはクレシル バイオレットと虚血性脳セクションを汚す、組織学的変化を調べた。H & E 染色することによってクレシル バイオレット染色、海馬ニューロン11の合計数を推定するために使用されますの構造情報と細胞10についての特定機能を提供します。したがって、H & E またはクレシル バイオレット強度、ImageJ ソフトウェア (図 3A) を用いて測定した細胞の生存のインデックスを示します。H & E とクレシル バイオレット強度を著しく汚損は、通常のグループ (図 3B、3 C) を基準にしてコントロール群で低下します。GRex 投与群は対照群 (図 3C) より少ない神経細胞死を意味より組織学的整合性を示しています。GRex が虚血再灌流性脳損傷に対する強力な神経保護効果を持っていることが示唆されました。
図 1.芩のメタノール抽出物における中大脳動脈閉塞 (MCAO) モデルと治療の方式 et 根茎 (GRex).GRex 1 h 維持された MCAO の再灌流後の 300 mg/kg 投与マウス 2 のためマウスが 24 h の安楽死、MCAO は開始、し、収穫された脳スライスされた蛋白質の試金の深い凍結保存または梗塞の TTC ソリューションで染色後 測定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.芩エキス メタノールの影響を示す (A) 脳セクションの代表的な画像 et 後中大脳動脈閉塞 (MCAO) の根茎 (GRex) 治療-脳梗塞体積と 300 mg/kg GRex 1 h (B) 単一の治療MCAO 再灌流は有意に梗塞体積を抑制した後。結果は平均 ± SDs ## #p として掲載されて < 0.001 対通常グループ * * p < 0.01 対制御グループ。n = グループあたり 6。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.(A) ヘマトキシリンとエオシン (H & E) の代表的なイメージ- およびクレシル バイオレット染色脳セクションと (B, C) 色芩のメタノール抽出物の効果を評価するために使用された強度 et 根茎 (GRex) 中間の脳に脳動脈閉塞症 (MCAO)-マウスを負傷した。マウス脳の組織学的整合性と組織損傷された評価を使用 (B) H & E または (C) クレシル バイオレット染色 1 h ポスト MCAO 再灌流。赤 H & E 染色切片の染色では、原子力損害を示します。クレシル バイオレット染色ニューロンを紫色に染色された.GRex 投与群は、制御グループは、以下の神経細胞死を示すよりもより良い組織学的整合性を示した。H & E 染色;b、クレシル バイオレット染色;c 、 d b、引き伸ばしそれぞれ。結果は、平均 ± SDs ## #p < 0.001、と * p < 0.05 対常態および制御グループ;。n = グループあたり 6。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
脳卒中の主な危険因子は、慢性高血圧、糖尿病、高脂血症などの代謝性疾患の有病率増加、脳卒中の予防と治療医学研究12,の重要なエリアとなっています。13。 言語と脳卒中後の運動障害は脳の組織14と貧しい生活の質は、患者とその家族の15のへの損傷の程度と相関します。薬物治療の有効性を研究する人間の病気で発生するものと同じ病理学的変化を含むストロークの適切な動物モデルを使用することが重要です。MCAO モデルは、脳動脈の血管の閉塞によって血栓性脳卒中を模倣します。それは、比較的再現性と低侵襲16,17,18,19だから使用されます。
ただし、同じ安静時の誘発脳の梗塞の領域の比較の時間はいくつかの研究者によって報告された総梗塞ボリュームは異なります研究を明らかにします。これが咬合材と手術の違いが原因だったことが分かった。したがって、MCAO 齧歯動物モデルが再現性が高いと考えられるが、それは常にそのような再現性を得ることが可能です。したがって、我々 は予備的考察と前のレポート8を通じてマウス MCAO モデルで使用される繊維の厚さを最適化されています。
私たちの予備的な研究の最も特徴的な結果は、TTC 染色 60 分 (データは示されていない) の虚血を惹起するときすべての脳梗塞には明らかしなかった他の研究と比較。我々 の結果を示した他の研究よりも音量梗塞マウスで、MCAO の 90 と 120 分、次も。本研究の 1 つの制限は、これらの結果の正確な原因はまだ決めていないことしかし、さらに研究ではこの現象を探索する予定です。
多くの研究は最近 GR またはそのコンポーネント抗腫瘍、抗菌、抗炎症効果20,21,22を含む薬理活性があることを報告しています。以前の研究報告 GRex 前処理は効果的ににより骨折 bcl-2 と Bcl xL8の蛋白質発現にカスパーゼ 9 の活性化を抑制しました。ただし、脳卒中の予防治療、脳卒中治療よりも少ない臨床的に関連します。
この研究をベースにした先行研究8評価 GRex MCAO マウスモデルでの治療後の効果。代表の結果示されて、GRex 後処理は総梗塞ボリュームを減らし、MCAO 誘発脳損傷マウスの細胞構造への損傷を改善での有益な効果を示した。本研究では虚血後の脳障害に対する GRex の特定のアクション機構を欠いているが、正常に本研究で使用される実験的プロトコルは、ストロークの人体への影響を模倣してこの漢方薬の効果を実証します。
実験の結果は、この研究では、神経欠損スコア観察されていませんが予備実験で測定した (NDS) と有意差は認められないコントロールと GRex 投与群の間に予定されていると推定ストロークの重要度と比較して短い観測時間に。NDS の中程度の損害を引き起こした後長い期間にわたって GRex 治療の効果を確認する予定です。
結論としては、MCAO マウスモデルにおける GRex 治療の神経保護効果を再現性の良い本研究で示した。今後の研究の基本的なメカニズムに関与するタンパク質を検討すべき。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
適用されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Qualitative filter paper | Advantec | Filter paper No. 2 | Qualitative filter paper |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
| Syringe filter (0.45 µm) | Sigma | CLS431220 | Syringe filter (0.45 µm) |
| Stereo Microscope | Leica | M50 | Stereo Microscope |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | Stereo Microscope |
| Laser Doppler | Moor Instrument | moorVMS-LDF | Laser Doppler |
| Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System | Harvard Appratus | 34-1352 | Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Appratus | 55-7020 | Homeothermic Monitoring System |
| Digital Camera | Canon | Eos-M2 | Digital Camera |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Cryostat |
| Microscope | Carl Zeiss | Zeiss Axio | Microscope |
| Data Analysis | Systat Software Inc. | SigmaPlot version 12 | Data Analysis |
| Data Analysis | NIH Image | ImageJ | Data Analysis |
| Mouse diet | Doo Yeol Biotech | Standard rodent chow | Mouse diet |
| Isoflurane | JOONGWAE | A02104781 | Isoflurane |
| Isoflurane | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isoflurane |
| Silk suture (4-0 Black silk) | AILEE | SK47510 | Silk suture (4-0 Black silk) |
| Silk suture (3-0 White silk) | Baekjae | 57 | Silk suture (3-0 White silk) |
| Nylon suture (8-0 monofilament) | AILEE | NB825 | Nylon suture (8-0 monofilament) |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877-25G | 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) |
| Formalin (Formaldehyde solution) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalin (Formaldehyde solution) |
| Hematoxylin (Harris Hematoxylin) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoxylin (Harris Hematoxylin) |
| Eosin (1% Eosin Y Solution) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eosin (1% Eosin Y Solution) |
| Cresyl violet (acetate) | Sigma | C5042-10G | Cresyl violet (acetate) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Paraformaldehyde |
| Sucrose | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sucrose |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Scigen | 4583 | Optimum cutting temperature (OCT) compound |
| Disecting Knife | Fine Science Tools | 10055-12 | Disecting Knife |
| #4 Forcep | Fine Science Tools | 11241-30 | #4 Forcep |
| #5 Forcep | Fine Science Tools | 11254-20 | #5 Forcep |
| #6 Forcep | Fine Science Tools | 11260-20 | #6 Forcep |
| #7 Fine Forcep | Fine Science Tools | 11274-20 | #7 Fine Forcep |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | Surgical Scissors |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Extra Fine Bonn Scissors |
| Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors |
| Vessel Dilating Forcep | Fine Science Tools | 18153-11 | Vessel Dilating Forcep |
References
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