Summary
Neste estudo, nós modificamos um método experimental existente para obter resultados mais reprodutíveis, estabelecendo um modelo do rato (MCAO) de oclusão de artéria cerebral média. A administração oral de Glycyrrhizae Radix et extrato de metanol de rizoma (GR) (GRex), após indução de acidente vascular cerebral, diminuiu significativamente o volume de infarto total em relação ao grupo controle não tratado.
Abstract
Isquemia seguida de reperfusão do fluxo sanguíneo cerebral após um acidente vascular cerebral leva à morte das células nervosas e perda de tecido cerebral. O modelo animal mais comumente usado para estudar o curso é o modelo de oclusão (MCAO) da artéria cerebral média. Estudos anteriores relataram tamanhos diferentes de infarto mesmo quando a mesma espécie de animal experimental foi utilizada em condições similares MCAO. Portanto, nós desenvolvemos um método experimental melhorado para resolver esta discrepância. Os ratos foram submetidos a MCAO usando um filamento como o material de oclusão para imitar as condições do acidente vascular cerebral humano e espessura do filamento foi otimizada para estabelecer mais volume de infarto pode ser reproduzido. Camundongos tratados com um metanol extrair do Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex) após a indução de acidente vascular cerebral mostrou um volume de infarto total significativamente diminuída e aumento do número de sobreviventes de células em relação ao grupo controle não tratado. Este modificado com êxito o protocolo experimental e reproducibly demonstrado o efeito benéfico de GRex sobre acidente vascular cerebral isquêmico.
Introduction
Danos cerebrais causados por isquemia e reperfusão do fluxo sanguíneo cerebral leva à morte das células nervosas e perda de tecido cerebral. Este tipo de dano cerebral continua a aumentar com o aumento da prevalência de doenças cerebrovasculares, devido à propagação de doenças metabólicas como obesidade, hipertensão arterial e diabetes mellitus1,2. O número absoluto de pacientes idosos com acidente vascular cerebral tem aumentado drasticamente em todo o mundo, e o custo da assistência médica para estes pacientes, que muitas vezes são deixados com deficiência a longo prazo, é um grande fardo societal. Portanto, a deficiência secundária deve ser atenuada tanto quanto possível para reduzir o encargo económico1,2.
O modelo de roedor mais comumente usado de infarto cerebral é o modelo de oclusão (MCAO) de artéria cerebral média (MCA), no qual o MCA é obstruído com um filamento de silicone revestido cirúrgico sutura para bloquear o fluxo sanguíneo, causando acidente vascular cerebral isquêmico3, 4. usando um filamento, como o material de oclusão permite o controle do tempo de oclusão e permanência manipulando-se a duração da inserção do filamento intra-luminal.
Estudos anteriores mostraram que, mesmo quando é usado o mesmo modelo MCAO de roedores, o volume total de infarto cerebral varia entre experimentos, causando baixa reprodutibilidade dos estudos. Para melhorar a reprodutibilidade, nós aperfeiçoamos a espessura do filamento mint utilizado no experimento. Os resultados de um estudo preliminar sobre o período de isquemia cerebral e infarto induzido mostrou que mais de 60 min e um período isquêmico permitido região volumétrica de danificado tecido cerebral para ser observada e quantificada.
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), também conhecida como alcaçuz, consiste nas raízes secas e rizomas de Glycyrrhiza uralensis e g. glabra. Ela tem sido usada na medicina tradicional chinesa e coreana para diversos fins, inclusive como um aditivo alimentar e medicinalmente5,6,7.
Em um anterior estudo8, pré-tratamento com GR extrato de metanol (GRex) mostrou um efeito antiapoptose em ratos MCAO, incluindo significativa prevenção da diminuição na expressão de proteínas de linfoma de célula B 2 (Bcl-2) e Bcl extra-grande (Bcl-xL). Este estudo foi realizado para melhorar a reprodutibilidade do modelo convencional de rato MCAO avaliando sua eficiência em determinar se o tratamento pós-infarto com GRex efetivamente reduziu o volume de infarto em dano cerebral induzida por MCAO.
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Protocol
Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nacional de Pusan (número de aprovação, PNU-2016-1087). Uma visão geral gráfica deste estudo é mostrada na Figura 1.
1. preparação e administração de GRex
Nota: O GR utilizado neste estudo foi comprado de uma empresa farmacêutica comercial.
- Coloque 200 g de GR em 2.000 mL de metanol e incubar a temperatura ambiente (25 ° C) por 5 dias.
- Filtrar a mistura usando papel de filtro com 0,26 mm de espessura e tamanho de poros de 5 µm e em seguida, remover o sobrenadante. Adicione 1.000 mL de metanol ao resíduo GR e filtrar novamente.
- Combinar os dois sobrenadantes, filtrar por papel de filtro, concentrar-se sob vácuo e em seguida congela o resíduo para produzir GRex.
- Dissolver o GRex em dimetilsulfóxido (DMSO), diluir com soro fisiológico 0,9% e filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 µm. Em seguida, ajuste a concentração final de DMSO a < 5%.
- Administre GRex (300 mg/kg de peso corporal) 1 h após a reperfusão de MCAO via oral gavage. Administre DMSO diluída em soro fisiológico (10 mL/kg de peso corporal) só para o grupo normal e grupos de controle, respectivamente.
Nota: A concentração de GRex usado neste experimento foi determinada de acordo com a concentração que foi ativa através de nossa anterior estudo8.
2. Mouse modelo de MCAO
- Camundongos C57BL/6 machos de uso com idades entre 6 semanas e pesando 22-25 g. fornecer a todos os animais com acesso gratuito ao chow padrão e água e casa-los em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 1 ° C) e um ciclo claro/escuro de 12 h.
- Divida os ratos em grupos de seis ratos cada, que devem consistir de GRex grupos de tratamento, controle e operação normal.
- Realizar a cirurgia MCAO (modificação do método de Koizumi et al 9) no controle e tratamento de GRex grupos usando um estereoscópio.
- Induzi a anestesia por inalação em ratos usando 2% de isoflurano em 70% N2O e 30% O2. Anestesia é considerada suficiente quando o mouse se torna não responde a estímulos mecânicos aplicados a sua cauda. Manter a temperatura do corpo dos ratos a 36,5 ± 0,5 ° C, com um corpo de temperatura-terra arrendada cobertor conectado a um termômetro.
- Remover todos os pelos no peito e pescoços dos ratos de corte seguido pelo uso de creme depilatório, desinfectar o local cirúrgico da pele com esfoliante de betadine, alternando com álcool por duas vezes e então fazem uma incisão de aproximadamente 2 cm de comprimento com cirúrgica lâmina no centro do pescoço. Cuidadosamente, isole a artéria carótida comum esquerda (LCCA), artéria carótida externa e o ramo da artéria carótida interna de tecidos conectivos circundantes.
- Ligar a artéria carótida externa e artéria carótida comum com uma sutura cirúrgica (sutura de seda 4-0, half hitch nó) para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo na artéria carótida interna durante a operação.
- Inserir uma sutura de silicone revestido de nylon (monofilamento 8-0, 11 mm de comprimento) através da artéria carótida interna para a origem do MCA a esquerda. Ajustar a espessura da parte do silicone revestido do filamento de uma gama de 0,10-0.12 mm.
- Medir a diminuição do fluxo sanguíneo cerebral relativo (rCBF) no MCA usando um medidor de fluxo Doppler laser. MCAO será confirmada quando o rCBF é mantida no < 20% dos valores de condição de descanso durante todo o período de isquemia.
- Corrigir o filamento inserido para o vaso sanguíneo para 2 h, enquanto a artéria cerebral é obstruída e em seguida, Retire cuidadosamente o filamento para restaurar o fluxo de sangue para 22 h de reperfusão. Sutura da pele por costura em 5 lugares (sutura de seda 3-0, dois engates meio nó) e permitir que cada mouse para despertar da anestesia.
- No grupo normal, realizar uma operação de Souza, seguindo o mesmo procedimento acima (até 2.4), com a seguinte exceção. Ligar a artéria carótida comum e suturar a incisão no músculo e pele.
3. a medição do Volume de tecido cerebral danificado
- Após eutanásia dos ratos para medição de danos cerebrais com inalação de CO2 , impostos especiais de consumo o mouse cérebros 24 h após o início da MCAO usando uma tesoura cirúrgica íris e pinça angular.
- Depois de retirar a cabeça com uma tesoura, fazer uma incisão na pele na linha média da cabeça virar a pele do crânio.
- Quebrar os ossos parietais com pinça angular, descascando dura matéria ao mesmo tempo e então isolar o cérebro cuidadosamente do crânio.
- Corte o tecido excisado em seções (1 mm de espessura) usando uma matriz de cérebro de rato e em seguida mancha as seções para 17 min em uma solução de cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium de 2% (TTC).
- Corrigir as seções em formol a 10% pelo menos 2h e então fotografá-los usando uma câmera digital. TTC será observado para manchar o tecido viável vermelha enquanto que as áreas de necrose será brancas.
- Analisar e quantificar a área de infarto cerebral de cada seção usando o ImageJ.
4. hematoxilina e eosina (H & E) e cresilo coloração violeta de cortes histológicos
- Eutanásia por inalação de CO2 em ratos para estudo histológico e perfundi-los transcardially com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS), seguido por 10 mL de paraformaldeído 4% (PFA). Isolar o cérebro usando o mesmo procedimento acima (3.1) e mergulhe o cérebro em 10 mL de 30% de sacarose durante a noite.
- Incorporar o tecido cerebral no ideal da temperatura de corte (OCT) composto e cortá-lo em seções de 15 µm de espessura usando um criostato. Monte as seções em lâminas de vidro, seguidas de coloração com hematoxilina e eosina (H & E) ou cresilo violetas.
- Imergir as lâminas de vidro em etanol a 80% por 1 min, seguido de coloração na solução de hematoxilina por 5 min.
- Mergulhe os slides em álcool ácido 1% duas vezes, mergulhe na solução saturada de carbonato de lítio por 30 s, lave com água da torneira por 30 s e em seguida corante de contraste em solução de eosina por 30 s.
- Lavar as lâminas em água da torneira, mergulhe em 95% e etanol absoluto consecutivamente.
- Secar ao ar livre os slides, eliminá-los em xilol pelo menos 10 min e montar as lamelas usando o meio de montagem.
- Coloque as lâminas de vidro em um slide mais quente pelo menos 1 h, seguido de imersão em etanol a 50% diluída com clorofórmio durante a noite.
- Mancha os slides com violeta de cresilo 0,1% por 10 min em forno seco de 40 ° C.
- Mergulhe em etanol a 95% por 30 min e, em seguida, desidrata-se em etanol absoluto por 2 vezes.
- Clear 2 vezes em xilol por 5 min e, em seguida, montar com meio de montagem após a secagem do ar.
- Usando um microscópio, observe as alterações histológicas que ocorreram após a lesão cerebral induzida por MCAO.
5. análise estatística
- Expressar os resultados experimentais como meios ± desvio-padrão e determinar a significância estatística entre os grupos usando um só de ida de análise de variância (ANOVA) seguido de análise post hoc de Tukey usando um software de análise de dados.
- Definir a significância estatística em um p-valor < 0,05.
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Representative Results
O grupo normal de operação, sem infarto cerebral observa-se Considerando que no grupo controle, observa-se uma gama relativamente ampla de áreas danificadas. Nos ratos, 300 mg/kg administrado GRex no grupo modelo MCAO, uma redução estatisticamente significativa na área danificada é observada (Figura 2).
As alterações histológicas são investigadas pela coloração de seções de isquemia cerebral com H & E ou cresilo violeta. Coloração H & E fornece informações estruturais e funcionais específicas sobre células10, Considerando que a coloração violeta cresilo é usada para estimar o número total de neurônios hippocampal11. Assim, H & E ou cresilo violeta intensidade, medida utilizando o software ImageJ (Figura 3A), fornece um índice de sobrevivência da célula. H & E e cresilo violeta as intensidades de coloração significativamente diminuem no grupo controle em relação ao grupo normal (Figura 3B, 3 C). O grupo GRex-tratados mostra maior integridade histológica, implicando menos morte celular neuronal, que o grupo controle (Figura 3C). Estes resultados indicam que a GRex tem efeitos neuroprotective potente contra lesão cerebral isquemia/reperfusão-induzida.
Figura 1 . Esquema do modelo de oclusão (MCAO) da artéria cerebral média e tratamento com o extrato de metanol de Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex). Os ratos foram tratados com 300 mg/kg de GRex 1 h após a reperfusão MCAO, que foi mantida por 2 h. os ratos foram sacrificado 24 h após o MCAO começou, e então as fatias de cérebro colhidos foram armazenadas em um congelador para ensaio da proteína ou coradas com solução TTC para infarto medição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Imagens representativas das seções (A) cérebro mostrando os efeitos do metanol extrato de Glycyrrhizae Radix et tratamento rizoma (GRex) na oclusão da artéria cerebral média pós (MCAO)-induzido por volumes de infarto cerebral e (B) o único tratamento com 300 mg/kg 1 GRex h Depois de reperfusão MCAO significativamente suprimido volumes de infarto. Os resultados são apresentados como meios ± SDs. #p # # < grupo normal vs 0,001, * * p < 0,01 vs controlam de grupo; n = 6 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Imagens representativas do (A) hematoxilina e eosina (H & E)- e seções do cérebro violeta manchado de cresilo e (B, C) cor intensidades, que foram utilizadas para avaliar os efeitos do extracto de metanol do Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex) em cérebros de médio oclusão da artéria cerebral (MCAO)-feridas de ratos. Dano histológico de integridade e tecido em cérebro de rato foram avaliados usando (B) H & E ou (C) reperfusão de post-MCAO cresilo violeta coloração h 1. Vermelho, coloração em H & seções manchadas E indica danos nucleares. Neurônios tingidos com violeta de cresilo estavam manchados de roxos. O grupo GRex-Tratado mostrou histológica integridade, melhor do que o grupo de controle, indicando menos morte celular neuronal. um, H & E manchada; b, cresilo manchadas de violeta; c e d, ampliações de a e b, respectivamente. Os resultados são meios ± SDs. #p # # < 0,001, e * p < 0,05 vs normais e grupos de controle; n = 6 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com o aumento da prevalência de doenças metabólicas como hipertensão crônica, diabetes e hiperlipidemia, quais são os principais fatores de risco para AVC, tratamento e prevenção de acidente vascular cerebral tornaram-se uma importante área de pesquisa médica12, 13. déficits na linguagem e movimento após um acidente vascular cerebral estão fortemente correlacionados com o grau de dano ao tecido14 no cérebro e resultar em uma pobre qualidade de vida para os pacientes e suas famílias,15. É importante usar um modelo animal adequado do curso que envolve as mesmas alterações patológicas como aqueles que ocorrem em doenças humanas para estudar a eficácia de tratamentos com drogas. O modelo MCAO imita a acidentes vasculares cerebrais trombóticos obstruindo vasos arteriais cerebrais. É comumente usado porque é relativamente reproduzíveis e minimamente invasivos16,17,18,19.
No entanto, uma comparação da área de infarto cerebral induzida para o descanso mesmo tempo relatado por vários pesquisadores, revela que o volume de infarto total varia entre os estudos. Concluiu-se que este era devido a diferenças na oclusão materiais utilizados e o procedimento cirúrgico. Portanto, embora o modelo de roedores MCAO é considerado altamente reprodutível, não é sempre possível obter tal reprodutibilidade. Portanto, nós aperfeiçoamos a espessura dos filamentos usados no modelo MCAO do mouse através do nosso estudo preliminar e anterior relatório8.
O resultado mais distintivo de nosso estudo preliminar em comparação com a de outros estudos é que mancha o TTC não revelou qualquer infarto cerebral quando a isquemia foi induzida por 60 min (dados não mostrados). Mesmo seguindo 90 e 120 min de MCAO nos ratos, nosso resultado mostrou um menor volume de infarto do que a de outros estudos de investigação. Uma limitação deste estudo é que nós ainda não determinado a causa exata dos resultados; no entanto, estamos planejando explorar este fenómeno em outros estudos.
Numerosos estudos têm relatado recentemente que o GR ou seus componentes têm atividades farmacológicas, incluindo efeitos antitumorais, antimicrobianos e anti-inflamatórios20,21,22. Um estudo anterior relatou que pré-tratamento GRex efetivamente inibiu a ativação da caspase-9 por estrogenos a expressão da proteína Bcl-2 e Bcl-xL8. No entanto, tratamentos preventivos para acidente vascular cerebral são menos clinicamente relevantes que tratamento de acidente vascular cerebral.
Neste estudo, que foi baseado em um estudo anterior8 avaliou a eficácia de pós-tratamento GRex em um modelo do rato MCAO. Como descrito na seção resultados representativos, pós-tratamento GRex mostrou efeitos benéficos em reduzir o volume total de infarto e atenuar danos a estruturas celulares em cranioencefálico MCAO-induzida em camundongos. Os mecanismos de ação específicos de GRex na lesão cerebral pós-isquêmica falta neste estudo, mas os protocolos experimentais utilizados neste estudo com sucesso demonstram os efeitos deste remédio herbal imitando humanos efeitos de um acidente vascular cerebral.
Embora os resultados experimentais não são observados neste estudo, a pontuação de déficit neuronal (NDS) foi medido em nossa experiência preliminar e nenhuma diferença significativa foi observada entre o controle e os grupos tratados com GRex, que se presume ter sido devidamente para o tempo de observação curta em comparação com a gravidade do traço. Estamos planejando observar os efeitos do tratamento de GRex sobre o NDS durante um longo período após causando danos moderados.
Em conclusão, o efeito neuroprotetor do tratamento GRex em um modelo de mouse MCAO foi demonstrado neste estudo com boa reprodutibilidade. As proteínas envolvidas no mecanismo subjacente devem ser examinadas em estudos futuros.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Não aplicável.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Qualitative filter paper | Advantec | Filter paper No. 2 | Qualitative filter paper |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
| Syringe filter (0.45 µm) | Sigma | CLS431220 | Syringe filter (0.45 µm) |
| Stereo Microscope | Leica | M50 | Stereo Microscope |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | Stereo Microscope |
| Laser Doppler | Moor Instrument | moorVMS-LDF | Laser Doppler |
| Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System | Harvard Appratus | 34-1352 | Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Appratus | 55-7020 | Homeothermic Monitoring System |
| Digital Camera | Canon | Eos-M2 | Digital Camera |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Cryostat |
| Microscope | Carl Zeiss | Zeiss Axio | Microscope |
| Data Analysis | Systat Software Inc. | SigmaPlot version 12 | Data Analysis |
| Data Analysis | NIH Image | ImageJ | Data Analysis |
| Mouse diet | Doo Yeol Biotech | Standard rodent chow | Mouse diet |
| Isoflurane | JOONGWAE | A02104781 | Isoflurane |
| Isoflurane | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isoflurane |
| Silk suture (4-0 Black silk) | AILEE | SK47510 | Silk suture (4-0 Black silk) |
| Silk suture (3-0 White silk) | Baekjae | 57 | Silk suture (3-0 White silk) |
| Nylon suture (8-0 monofilament) | AILEE | NB825 | Nylon suture (8-0 monofilament) |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877-25G | 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) |
| Formalin (Formaldehyde solution) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalin (Formaldehyde solution) |
| Hematoxylin (Harris Hematoxylin) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoxylin (Harris Hematoxylin) |
| Eosin (1% Eosin Y Solution) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eosin (1% Eosin Y Solution) |
| Cresyl violet (acetate) | Sigma | C5042-10G | Cresyl violet (acetate) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Paraformaldehyde |
| Sucrose | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sucrose |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Scigen | 4583 | Optimum cutting temperature (OCT) compound |
| Disecting Knife | Fine Science Tools | 10055-12 | Disecting Knife |
| #4 Forcep | Fine Science Tools | 11241-30 | #4 Forcep |
| #5 Forcep | Fine Science Tools | 11254-20 | #5 Forcep |
| #6 Forcep | Fine Science Tools | 11260-20 | #6 Forcep |
| #7 Fine Forcep | Fine Science Tools | 11274-20 | #7 Fine Forcep |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | Surgical Scissors |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Extra Fine Bonn Scissors |
| Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors |
| Vessel Dilating Forcep | Fine Science Tools | 18153-11 | Vessel Dilating Forcep |
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