Summary
En este estudio, modificamos un método experimental existente para obtener resultados reproducibles más, mediante el establecimiento de un modelo de ratón de arteria cerebral media oclusión (MCAO). La administración oral de Glycyrrhizae Radix et Extracto de metanol de rizoma (GR) (GRex), tras la inducción de la carrera, redujo significativamente el volumen de infarto total en relación con el grupo control no tratado.
Abstract
Isquemia seguida de reperfusión del flujo sanguíneo cerebral después de un derrame cerebral conduce a la muerte de las células nerviosas y la pérdida de tejido cerebral. El modelo animal más utilizado para el estudio de tiempos es el modelo de oclusión (MCAO) de la arteria cerebral media. Estudios anteriores han reportado tamaños diferentes infarto incluso cuando la misma especie animal experimental se utilizó en condiciones similares de MCAO. Por lo tanto, hemos desarrollado un método experimental mejorado para hacer frente a esta discrepancia. Ratones fueron sometidos a MCAO usando un filamento como el material de la obstrucción para imitar las condiciones de movimiento humano y grueso filamento fue optimizado para crear más volumen de infarto reproducible. Extracción de ratones tratados con un metanol de Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex) tras inducción de movimiento mostró un volumen de infarto total significativamente disminuida y aumento en el número de supervivientes de las células en relación con el grupo control no tratado. Esto modificó el protocolo experimental con éxito y reproducible había demostrado el efecto beneficioso de GRex en accidente cerebrovascular isquémico.
Introduction
Daño cerebral causado por isquemia y reperfusión del flujo sanguíneo cerebral conduce a la muerte de las células nerviosas y la pérdida de tejido cerebral. Este tipo de daño cerebral continúa aumentando con la creciente prevalencia de enfermedades cerebrovasculares debido a la propagación de enfermedades metabólicas como obesidad, hipertensión y diabetes mellitus1,2. El número absoluto de pacientes mayores con ictus ha aumentado en todo el mundo, y el costo de la atención médica de estos pacientes, que a menudo se quedan con discapacidades a largo plazo, es una carga social importante. Por lo tanto, discapacidad secundaria debe mitigarse lo más posible para reducir la carga económica1,2.
El modelo más utilizado de roedor del infarto cerebral es el modelo de oclusión (MCAO) de arteria cerebral media (MCA), en el que el MCA se ocluye con un filamento de sutura quirúrgico silicio para bloquear el flujo sanguíneo, causando accidente cerebrovascular isquémico3, 4. usando un filamento como el material de la obstrucción permite el control del tiempo de oclusión y permanencia mediante la manipulación de la duración de la inserción del filamento intra-luminales.
Estudios anteriores han demostrado que incluso cuando se utiliza el mismo modelo MCAO roedor, el volumen total del infarto cerebral varía entre experimentos, causando baja reproducibilidad de los estudios. Para mejorar la reproducibilidad, hemos optimizado el grueso de la menta de filamentos utilizado en el experimento. Los resultados de un estudio preliminar del período isquémico cerebral y el infarto inducido demostrada que un período isquémico de más de 60 min permitió la región volumétrica del dañan tejido cerebral para ser observados y cuantificados.
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), también conocido como regaliz, consiste en el secado raíces y rizomas de Glycyrrhiza uralensis y g. glabra. Se ha utilizado en la medicina tradicional China y coreana para los varios propósitos incluyendo como un aditivo alimenticio y medicinal5,6,7.
En un anterior estudio8, pre-tratamiento con el extracto de metanol GR (GRex) demostrado un efecto anti-apoptotic en ratones MCAO, incluyendo prevención significativa de la disminución en la expresión de la proteína de linfoma de células B 2 (Bcl-2) y Bcl extra grande (Bcl-xL). Este estudio se llevó a cabo para mejorar la reproducibilidad del modelo de ratón MCAO convencional evaluando su eficiencia en la determinación de si el tratamiento postinfarto con GRex efectivamente reduce el volumen de infarto en daño cerebral inducido por MCAO.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Nacional de Pusan (número de aprobación, PNU-2016-1087). Una visión gráfica de este estudio se muestra en la figura 1.
1. preparación y administración de GRex
Nota: El GR utilizado en este estudio fue adquirido a una compañía farmacéutica comercial.
- 200 g de GR en 2.000 mL de metanol e incubar a temperatura ambiente (25 ° C) durante 5 días.
- La mezcla con papel de filtro con 0,26 mm de espesor y 5 μm tamaño de poro del filtro y retire el sobrenadante. Agregar 1000 mL de metanol al residuo GR y filtro nuevo.
- Combinar los dos sobrenadantes, filtrar con papel de filtro, concentrado bajo vacío y luego el residuo para producir GRex por congelación.
- Disolver el GRex en dimetil sulfóxido (DMSO), diluir con solución salina fisiológica 0,9% y filtrar con un filtro de jeringa de 0.45 μm. A continuación, ajuste la concentración final de DMSO a < 5%.
- Administrar GRex (300 mg/kg de peso corporal) 1 h después de la reperfusión de MCAO vía oral por sonda nasogástrica. Administrar el DMSO diluido en suero fisiológico (10 mL/kg de peso corporal) sólo a los grupos normales y grupos de control, respectivamente.
Nota: La concentración de GRex utilizado en este experimento se determinó según la concentración que se activa a través de nuestro anterior estudio8.
2. ratón modelo de MCAO
- Ratones C57BL/6 machos de uso de 6 semanas de edad y 22-25 g. de peso todos los animales con libre acceso a chow estándar y agua y la casa en un ambiente con temperatura controlada (22 ± 1 ° C) y un ciclo de 12 h luz/oscuridad.
- Dividir los ratones en grupos de seis ratones cada uno, que deben consistir en simulada funciona normal, el control y grupos de tratamiento de GRex.
- Realizar cirugía MCAO (modificación del método de Koizumi et al. 9) sobre el control y los grupos de tratamiento GRex utilizando un microscopio estéreo.
- Inducir la anestesia inhalatoria en los ratones con 2% de isoflurano en 70% N2O y 30% O2. Anestesia se considera suficiente cuando el ratón se convierte en insensible a la estimulación mecánica aplicada a su cola. Mantener la temperatura corporal de los ratones a 36,5 ± 0.5 ° C usando un cuerpo temperatura-tenencia manta conectada a un termómetro.
- Quitar todo el pelo en el pecho y cuello de los ratones por el afeitado seguido por el uso de crema depilatoria, desinfecta el sitio quirúrgico de la piel con betadine scrub alternando con alcohol por dos veces y luego realizar una incisión de aproximadamente 2 cm largo con quirúrgico hoja en el centro del cuello. Aislar cuidadosamente la arteria carótida común izquierda (LCCA), arteria carótida externa y la rama de la arteria carótida interna de los tejidos conectivos circundantes.
- Ligar la arteria carótida externa y la arteria carótida común con una sutura quirúrgica (sutura de seda 4-0, medio enganche nudo) para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo en la arteria carótida interna durante la operación.
- Insertar una sutura de nylon de silicio (monofilamento de 8-0, 11 mm de largo) a través de la arteria carótida interna en el origen de la MCA izquierdo. Ajustar el espesor de la pieza de silicio del filamento a una gama de 0.10-0.12 mm.
- Medir la disminución del flujo sanguíneo cerebral relativo (rCBF) en el MCA usando un flujómetro Doppler láser. MCAO se confirmará cuando se mantiene el rCBF en < 20% de los valores de condición descanso durante todo el período isquémico.
- Fijar el filamento insertado a los vasos sanguíneos para 2 h mientras se ocluye la arteria cerebral y luego retirar cuidadosamente el filamento para restaurar el flujo de sangre de 22 h de la reperfusión. La sutura de la piel por costura en los 5 lugares (nudo de dos medios nudos, sutura de seda 3-0) y permita que cada ratón para despertar de la anestesia.
- En el grupo normal, realizar una operación simulada siguiendo el mismo procedimiento anteriormente (hasta 2.4), con las siguientes excepciones. Ligar la arteria carótida común y la sutura del músculo Incisa y piel.
3. medición del volumen de tejido cerebral dañado
- Después de la eutanasia de los ratones para la medición de daño cerebral con la inhalación de CO2 , impuesto el ratón cerebros 24 h después del inicio de MCAO usando tijeras quirúrgicas de iris y ángulo de pinzas.
- Después de quitar la cabeza con unas tijeras, hacer una incisión en la piel de la línea media de la cabeza a voltear la piel del cráneo.
- Romper los huesos parietales con pinzas angulares, pelar apagado dura materia al mismo tiempo y luego aislar el cerebro cuidadosamente desde el cráneo.
- Corte el tejido suprimido en secciones (1 mm de espesor) utilizando una matriz de cerebro de ratón y entonces la mancha las secciones de 17 min en una solución de 2% de cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC).
- Fijar las secciones en formalina al 10% durante al menos 2 h y luego fotografiar con una cámara digital. TTC se observará a teñir el tejido viable rojo mientras que las áreas necróticas será blanco.
- Analizar y cuantificar el área de infarto cerebral de cada sección con ImageJ.
4. hematoxilina y eosina (H & E) y cresil violeta tinción de cortes histológicos
- Eutanasia a los ratones para el estudio histológico por la inhalación de CO2 y perfusión les transcardially con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de 10 mL de paraformaldehído al 4% (PFA). Aislar el cerebro usando el mismo procedimiento de arriba (3.1) y sumergir el cerebro en 10 mL de sacarosa al 30% durante la noche.
- Incrustar el tejido cerebral en la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto y corte coronal en secciones de 15 μm de espesor con un criostato. Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio, seguidos por la coloración con hematoxilina y eosina (H & E) o violeta de cresilo.
- Sumerja el portaobjetos en etanol al 80% durante 1 min seguido por la coloración de hematoxilina en solución durante 5 minutos.
- Sumerja los portaobjetos en alcohol ácido al 1% dos veces, sumergir en una solución saturada de carbonato de litio durante 30 s, lavar con agua del grifo por 30 s y entonces contratinción en solución de eosina para 30 s.
- Enjuague los portaobjetos en agua del grifo, remojo en 95% y etanol absoluto consecutivamente.
- Deje secar al aire los portaobjetos, claro en el xileno durante al menos 10 minutos y luego Monte el cubreobjetos con medio de montaje.
- Coloque el portaobjetos sobre un portaobjetos calentador durante al menos 1 h, seguido por inmersión en etanol al 50% diluido con cloroformo durante la noche.
- Los portaobjetos con violeta de cresilo 0.1% durante 10 min en un horno seco de 40 º C de la mancha.
- Sumerja en etanol al 95% por 30 min y luego deshidratar en etanol absoluto por 2 veces.
- Claro 2 veces en xileno durante 5 minutos, y luego montar con medio de montaje después de secado al aire.
- Utilizando un microscopio, observar los cambios histológicos ocurridos después de lesión del cerebro inducida por MCAO.
5. estadístico análisis
- Expresan los resultados experimentales como medio ± desviación estándar y determinar la significación estadística entre los grupos usando un unidireccional análisis de varianza (ANOVA) seguido de análisis post hoc de Tukey usando un software de análisis de datos.
- Establecer la significación estadística a un p-valor < 0.05.
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Representative Results
En el grupo normal operado simulado, infarto cerebral no se observa mientras que en el grupo control, se observó una gama relativamente amplia de áreas dañadas. En los ratones administrado GRex 300 mg/kg en el grupo de modelos MCAO, una reducción estadísticamente significativa en el área dañada se observa (figura 2).
Los cambios histológicos son investigados por tinción de secciones del cerebro isquémico con H & E o cresil violeta. Tinción H & E proporciona información estructural y funcional información sobre células10, mientras que la coloración violeta de cresilo se utiliza para estimar el número total de neuronas hippocampal11. Así, H & E o cresil violeta intensidad, medida usando el software ImageJ (figura 3A), proporciona un índice de supervivencia de la célula. H & E y cresil violeta intensidades de la coloración significativamente disminuyen en el grupo control en relación con el grupo normal (figura 3B, 3 C). El grupo tratado GRex muestra mayor integridad histológica, lo que implica menos muerte celular neuronal, que el grupo control (figura 3C). Estos resultados indican que el GRex tiene efectos neuroprotectores potentes contra lesión cerebral isquemia/reperfusión-inducida.
Figura 1 . Esquema de la arteria cerebral media oclusión (MCAO) modelo y tratamiento con el extracto de metanol de Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex). Ratones fueron tratados con 300 mg/kg de GRex 1 h después de la reperfusión MCAO, que se mantuvo por 2 h. ratones fueron sacrificaron 24 horas después de comenzado el MCAO, y entonces las rebanadas de cerebro cosechados fueron almacenadas en un congelador para ensayo de proteína o teñidas con solución TTC para infarto medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Imágenes representativas de las secciones (A) cerebro mostrando los efectos del metanol Extracto de Glycyrrhizae Radix et tratamiento de rizoma (GRex) en la oclusión de la arteria cerebral posterior media (MCAO)-inducida por volúmenes de infarto cerebral y (B) un tratamiento con 300 mg/kg GRex 1 h después de reperfusión MCAO suprime significativamente los volúmenes de infarto. Los resultados se presentan como medios ± SDs. ## #p < grupo normal vs 0,001 ** p < 0,01 vs controlan de grupo; n = 6 por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Imágenes representativas de (A) hematoxilina y eosina (H & E)- y secciones de cerebro teñidos de violeta de cresilo y (B, C) color de intensidades, que se utilizaron para evaluar los efectos del extracto de metanol de Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex) en los cerebros de medio obstrucción de la arteria cerebral (MCAO)-lesionado de ratones. Daños histológicos de integridad y tejido en cerebros de ratón fueron evaluados usando (B) H & E o (C) la reperfusión post MCAO 1 h la coloración violeta de cresilo. Tinción de H & secciones manchadas E roja indica daños nucleares. Las neuronas teñidas con violeta de cresilo se tiñeron de púrpura. El grupo trata en GRex mostró mejor integridad histológica que hizo el grupo de control, indicando menos muerte celular neuronal. un, H & E tinción; b, cresil violeta teñido; c y d, ampliaciones de a y b, respectivamente. Resultados son medios ± SDs. ## #p < 0.001, y * p < 0,05 vs normales y grupos de control; n = 6 por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con la creciente prevalencia de enfermedades metabólicas como la hipertensión crónica, diabetes e hiperlipidemia, que son factores de riesgo para el accidente cerebrovascular, el tratamiento y prevención de accidentes cerebrovasculares han convertido en una importante área de investigación médica12, 13. los déficits en el lenguaje y el movimiento después de un accidente cerebrovascular se correlacionan fuertemente con el grado de daño cerebral de tejido14 y resultar en una pobre calidad de vida para los pacientes y sus familias15. Es importante usar un modelo animal apropiado de tiempos que implica los mismos cambios patológicos que ocurren en la enfermedad humana para estudiar la eficacia de los tratamientos farmacológicos. El modelo MCAO imita trazos trombótica por obstrucción de los vasos arteriales cerebrales. Se utiliza comúnmente debido a que es mínimamente invasiva y relativamente reproducible16,17,18,19.
Sin embargo, una comparación de la zona de infarto cerebral inducido del descanso mismo tiempo reportado por varios investigadores, revela que el volumen de infarto total varía entre los estudios. Llegamos a la conclusión que esto era debido a las diferencias en los materiales de oclusión utilizados y el procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, aunque el modelo de roedores de MCAO se considera altamente reproducible, no resulta siempre posible obtener dicha reproducibilidad. Por lo tanto, hemos optimizado el grueso de los filamentos utilizado en modelo de MCAO de ratón a través de un estudio preliminar y previo informe8.
El resultado más distintivo de nuestro estudio preliminar en comparación con la de otros estudios es que la coloración de la TTC no reveló ningún infarto cerebral cuando se indujo la isquemia de 60 minutos (datos no mostrados). Incluso después de 90 y 120 min de MCAO en los ratones, el resultado mostró un volumen de infarto inferior que el de otros estudios de investigación. Una limitación de este estudio es que aún no hemos determinado la causa exacta de estos resultados; sin embargo, estamos planeando explorar este fenómeno en otros estudios.
Numerosos estudios han informado recientemente que GR o sus componentes tienen actividades farmacológicas incluyendo efectos antitumorales, antimicrobianas y antiinflamatorias20,21,22. Un estudio previo informó que tratamiento previo GRex inhibe eficazmente la activación de la caspasa-9 por regular la expresión de la proteína Bcl-2 y Bcl-xL8. Sin embargo, tratamientos preventivos para el accidente cerebrovascular son clínicamente menos relevantes que el tratamiento posterior al accidente cerebrovascular.
En este estudio, que fue basado en un estudio anterior8 evaluó la efectividad del post-tratamiento GRex en un modelo de ratón MCAO. Como se describe en la sección de resultados representativos, post-tratamiento GRex mostraron efectos beneficiosos en reducir el volumen de infarto total y el mejoramiento de daños a las estructuras celulares en lesiones cerebrales de MCAO-inducida en ratones. Carece de los mecanismos de acción específicos de GRex en lesión cerebral isquémica posterior en este estudio, pero los protocolos experimentales utilizados en este estudio con éxito demostraron los efectos de este remedio herbario por mímico humanos efectos de un derrame cerebral.
Aunque los resultados experimentales no se observan en este estudio, la puntuación del déficit neuronal (NDS) se midió en nuestro experimento preliminar y no se observó diferencia significativa entre el control y los grupos tratados con GRex, que se presume que han sido debidamente el período de observación corto en comparación con la gravedad del accidente cerebrovascular. Estamos planeando observar los efectos del tratamiento de GRex en la NDS durante un largo periodo después de causar daños moderados.
En conclusión, el efecto neuroprotector del tratamiento GRex en un modelo murino MCAO se demostró en este estudio con buena reproducibilidad. Las proteínas implicadas en el mecanismo subyacente deben examinarse en futuros estudios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
No es aplicable.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Qualitative filter paper | Advantec | Filter paper No. 2 | Qualitative filter paper |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
| Syringe filter (0.45 µm) | Sigma | CLS431220 | Syringe filter (0.45 µm) |
| Stereo Microscope | Leica | M50 | Stereo Microscope |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | Stereo Microscope |
| Laser Doppler | Moor Instrument | moorVMS-LDF | Laser Doppler |
| Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System | Harvard Appratus | 34-1352 | Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Appratus | 55-7020 | Homeothermic Monitoring System |
| Digital Camera | Canon | Eos-M2 | Digital Camera |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Cryostat |
| Microscope | Carl Zeiss | Zeiss Axio | Microscope |
| Data Analysis | Systat Software Inc. | SigmaPlot version 12 | Data Analysis |
| Data Analysis | NIH Image | ImageJ | Data Analysis |
| Mouse diet | Doo Yeol Biotech | Standard rodent chow | Mouse diet |
| Isoflurane | JOONGWAE | A02104781 | Isoflurane |
| Isoflurane | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isoflurane |
| Silk suture (4-0 Black silk) | AILEE | SK47510 | Silk suture (4-0 Black silk) |
| Silk suture (3-0 White silk) | Baekjae | 57 | Silk suture (3-0 White silk) |
| Nylon suture (8-0 monofilament) | AILEE | NB825 | Nylon suture (8-0 monofilament) |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877-25G | 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) |
| Formalin (Formaldehyde solution) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalin (Formaldehyde solution) |
| Hematoxylin (Harris Hematoxylin) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoxylin (Harris Hematoxylin) |
| Eosin (1% Eosin Y Solution) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eosin (1% Eosin Y Solution) |
| Cresyl violet (acetate) | Sigma | C5042-10G | Cresyl violet (acetate) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Paraformaldehyde |
| Sucrose | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sucrose |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Scigen | 4583 | Optimum cutting temperature (OCT) compound |
| Disecting Knife | Fine Science Tools | 10055-12 | Disecting Knife |
| #4 Forcep | Fine Science Tools | 11241-30 | #4 Forcep |
| #5 Forcep | Fine Science Tools | 11254-20 | #5 Forcep |
| #6 Forcep | Fine Science Tools | 11260-20 | #6 Forcep |
| #7 Fine Forcep | Fine Science Tools | 11274-20 | #7 Fine Forcep |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | Surgical Scissors |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Extra Fine Bonn Scissors |
| Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors |
| Vessel Dilating Forcep | Fine Science Tools | 18153-11 | Vessel Dilating Forcep |
References
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