Summary
وهنا يصف لنا أسلوب في فيفو ميكرودياليسيس لتحليل الإصدار اسبارتاتي والغلوتامات في الحصين البطني من الفئران الصرع وغير صرع، في تركيبة مع تسجيلات التخطيط الدماغي. قد ترتبط تركيزات خارج الخلية اسبارتاتي وغلوتامات مع المراحل المختلفة للمرض.
Abstract
ميكرودياليسيس هو تقنية راسخة في علم الأعصاب التي ترتبط تغييرات المواد الفعالة عصبيا نشرها في الفضاء المخ المتداخلة مع السلوك و/أو نتائج محددة لعلم الأمراض (مثل المضبوطات للصرع). عند دراسة الصرع، غالباً ما يقترن تقنية ميكرودياليسيس مع قصيرة الأجل أو طويلة الأجل حتى الفيديو-المخ (EEG) رصد لتقييم تواتر الاستيلاء عفوية وشدته، والتقدم وتجميع. ميكرودياليسيس-التخطيط الدماغي مجتمعة يرتكز على استخدام عدة أساليب وأدوات. وهنا، أجرينا في فيفو ميكرودياليسيس والفيديو المستمر-EEG تسجيل لمراقبة تدفق غلوتامات واسبارتاتي على مر الزمن، في مراحل مختلفة من التاريخ الطبيعي للصرع في نموذج الفئران. ويسمح هذا النهج الموحد الاقتران من التغييرات في الإصدار العصبي بمراحل معينة من تطور المرض والتقدم. أن تركيز الأحماض الأمينية في دياليساتي تحددها اللوني السائل. هنا، يمكننا وصف الأساليب والخطوط العريضة التي ينبغي أن تتخذ التدابير الوقائية الرئيسية واحد خلال في فيفو ميكرودياليسيس-EEG، مع إيلاء اهتمام خاص لعملية جراحية ستيريوتاكسيك، وحفز البوتاسيوم القاعدية وعالية أثناء ميكرودياليسيس، عمق الكهربائي EEG تسجيل وتحليل عالية الأداء اللوني السائل اسبارتاتي والغلوتامات في دياليساتي. وهذا النهج قد تكون مناسبة لاختبار مجموعة متنوعة من المخدرات أو الأمراض الناجمة عن تغيرات التركيزات الفسيولوجية اسبارتاتي والغلوتامات في الدماغ. رهنا بتوافر المقايسة التحليلية المناسبة، قد زيادة استخدامه لاختبار مختلف الجزيئات القابلة للذوبان عند استخدام تسجيل EEG في نفس الوقت.
Introduction
إلى التبصير بضعف وظيفي لوساطة غلوتامات ضادات وجابايرجيك كبيرة المثبطة أسفر عن المضبوطات عفوية في صرع الفص الصدغي (TLE)، نحن بانتظام رصد تركيزات خارج الخلية GABA1 وبعد ذلك طبعا مستويات الغلوتامات والاسبارتيت2 من ميكرودياليسيس في الحصين البطني من الفئران في نقاط زمنية مختلفة من هذا المرض الطبيعية، أيخلال التنمية والتقدم للصرع. ونحن استغل الطراز pilocarpine TLE في الفئران، الذي يحاكي هذا المرض بشكل دقيق جداً من حيث التغيرات السلوكية والكهربية ونسيجية3،4 ونحن يرتبط تركيز dialysate الأمينية الأحماض بمراحلها المختلفة: المرحلة الحادة بعد الإهانة ابيليبتوجينيك، في مرحلة الكمون، وقت الاستيلاء العفوية الأولى و6،75،فاس المزمنة. تأطير مراحل المرض كان مكن رصد EEG الفيديو الطويلة الأجل ودقة التخطيط الدماغي والسريرية توصيف المضبوطات عفوية. تطبيق تقنية ميكرودياليسيس المرتبطة برصد EEG الفيديو طويل الأجل يسمح لنا باقتراح فرضيات آليا لأمراض الأعصاب TLE. وباختصار، يتيح الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة الاقتران من التعديلات الكيميائية العصبية داخل منطقة محددة بالدماغ مع التنمية والتقدم للصرع في نموذج حيوان.
الأجهزة المزدوجة، تتكون من عمق القطب محاذياً قنية ميكرودياليسيس، كثيرا ما تستخدم في الدراسات البحثية الصرع حيث ينبغي أن ترتبط التغيرات في الناقلات العصبية، ونواتج الأيض، أو ركائز الطاقة لنشاط الخلايا العصبية. في الغالبية العظمى من الحالات، وهو يستخدم في التصرف بحرية الحيوانات، ولكن يمكن أن تجري أيضا بطريقة مماثلة في البشر، مثلاً، في دراسة معمقة من العقاقير المقاومة مرضى الصرع تمر بعمق مسرى التحقيق قبل الجراحة8. يمكن تنفيذ تسجيل EEG، وجمع دياليساتي على حدة (مثلاً، زرع مسرى في واحد في نصف الكرة وميكرودياليسيس التحقيق في نصف الكرة الغربي الأخرى أو حتى أداء في ميكرودياليسيس في مجموعة واحدة من الحيوانات أثناء أداء التخطيط الدماغي الوحيد في مجموعة أخرى من الحيوانات). على الرغم من ذلك، اقتران أقطاب كهربائية إلى تحقيقات قد مزايا متعددة: أنه يبسط عملية جراحية ستيريوتاكسيك، ويحد من تلف الأنسجة إلى واحد فقط في نصف الكرة (بينما تترك الأخرى، سليمة، كعنصر تحكم لدراسات نسيجية)، وهوموجينيزيس نتائج هذه تم الحصول عليها من نفس المنطقة الدماغ والحيوان نفسه.
من ناحية أخرى، يتطلب إعداد الجهاز قطب كهربائي مسبار ميكرودياليسيس إلى جانب الوقت والمهارات إذا كان الصنع. واحد يمكن أن تنفق مبالغ مالية مرتفعة نسبيا إذا تم شراؤها من السوق. وعلاوة على ذلك، عندما يسبر ميكرودياليسيس (نصائح المسبار هي عادة 200-400 ميكرون في القطر و 7-12 ملم طويلة)9، واقطاب EEG (نصائح القطب عادة من 300-500 ميكرون في القطر، وطويل بما يكفي للوصول إلى هيكل الدماغ لفائدة10) بالإضافة إلى، يمثل الجهاز المحمل كائن ضخمة وثقيلة نسبيا على جانب واحد من الرأس، والتي مزعجة للحيوانات وعرضه لأن تضيع خاصة عندما كان متصلاً بمضخة غسيل الكلي ونظام تسجيل EEG الثابت من الأسلاك. هذا الجانب أكثر صلة بالصرع الحيوانات التي يصعب التعامل معها والتكيف أقل لدورات ميكرودياليسيس. التقنيات الجراحية المناسبة والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية المناسبة يمكن أن ينتج يزرع طويلة الأمد التي تسبب أدنى إزعاج الحيوان وينبغي اتباعها لتجارب EEG ميكرودياليسيس كومبيناتوري، ،من1011 12.
مزايا وقيود تقنية ميكرودياليسيس قد استعرضت بالتفصيل العديد من علماء الأعصاب. ميزته الأساسية خلال في فيفو نضح تقنيات أخرى (مثلاً، دفع وجذب تدفق سريع أو نضح كأس القشرية) هو قطره صغيرة من التحقيق الذي يغطي منطقة دقيقة نسبيا لفائدة13،14، 15. ثانيا، يقوم الغشاء ميكرودياليسيس حاجز مادي بين الأنسجة وبيرفوساتي؛ ولذلك، المواد الوزن الجزيئي العالية لا عبور ولا تتداخل مع تحليل16،17. وعلاوة على ذلك، حماية الأنسجة من تدفق المضطرب بيرفوساتي18. ميزة هامة أخرى هي إمكانية تعديل تدفق بيرفوساتي لتحقيق أقصى قدر من التركيز أكثر في بيرفوساتي (أيعملية ميكرودياليسيس ويمكن أيضا تعريف رياضيا ويمكن تعديلها تسفر عن ارتفاع 19من تركيزات أكثر في العينة). وأخيراً، قد تستعمل التقنية ضخ الأدوية أو المواد عقاقيري النشط في الأنسجة للفائدة وتحديد أثرها في موقع تدخل20. من ناحية أخرى، قد ميكرودياليسيس وقت قرار محدودة (عادة أكثر من 1 دقيقة بسبب الوقت اللازم لجمع العينات) بالمقارنة مع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية أو البيولوجية؛ هو أسلوب الغازية التي تسبب تلف الأنسجة؛ أنه يعرض للخطر التوازن الكيميائية العصبية داخل الفضاء حول الغشاء بسبب الانحدار تركيز مستمر لجميع المواد القابلة للذوبان الذي يدخل بيرفوساتي جنبا إلى جنب مع أكثر الفائدة. وأخيراً، تقنية ميكرودياليسيس يتأثر عالية بحدود التقنيات التحليلية المستخدمة للتقدير الكمي للمواد في بيرفوساتي9،،من2122،23 . كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) بعد derivatization مع أورثوفثالديالديهيدي لتحليل العينات البيولوجية غلوتامات واسبارتاتي قد تم التحقق من صحتها جيدا24،،من2526 , 27 ومناقشة واسعة النطاق خارج نطاق هذه المخطوطة، ولكن سيتم وصف البيانات المنتجة باستخدام هذه الطريقة بالتفصيل.
عند القيام بشكل سليم ودون إدخال تعديلات على تكوين بيرفوساتي، ميكرودياليسيس يمكن أن توفر معلومات موثوقة حول المستويات القاعدية لإطلاق سراح العصبي. الجزء الأكبر من المستويات القاعدية ومن المرجح نتيجة لامتداد الإرسال من نهايات9. لأنه في كثير من الأحيان عينات بسيطة من العصبي في مساحة إضافية متشابك لا يكفي لتحقيق الأهداف المتمثلة في التحقيق، تقنية ميكرودياليسيس يمكن أن تستخدم أيضا لتحفيز الخلايا العصبية أو لحرمانهم من الأهمية أيونات الفسيولوجية مثل ك+ Ca2 +، أو من أجل استحضار أو منع الإفراج عن العصبي.
غالباً ما يستخدم عالية ك+ التحفيز في بيولوجيا الأعصاب لتحفيز نشاط الخلايا العصبية ليس فقط في الحيوانات مستيقظا ولكن أيضا في الثقافات الابتدائية وأورجانوتيبيك. تعرض نظام صحي العصبي المركزي للحلول مع تركيزات عالية من ك+ (40-100 ملم) تثير افلوكس من العصبية28. يمكن أن يتعرض هذا قدرة الخلايا العصبية على توفير إصدار إضافية استجابة لارتفاع ك+ في الحيوانات الصرع1 في29،أمراض الأعصاب الأخرى30. وبالمثل، Ca2 + الحرمان (التي تم الحصول عليها من بيرفوسينج Ca2 + الحلول مجاناً) يستخدم لوضع الكالسيوم تعتمد على إطلاق سراح معظم أجهزة الإرسال العصبية التي تقاس ميكرودياليسيس. ويعتقد عموما أن Ca2 + تعتمد الإصدار منشأ الخلايا العصبية، بينما تنشأ Ca2 + الإصدار المستقل من إطلاق، ولكن العديد من الدراسات أثارت الجدل حول معنى Ca2 +-قياسات حساسة مثل غلوتامات أو GABA9: وهكذا، إذا كان ذلك ممكناً، فمن المستحسن أن دعم الدراسات ميكرودياليسيس بالدراسات ميكروسينسور، وهذه الأخيرة أعلى القرار المكانية والأقطاب يسمح للحصول على أقرب إلى نهايات31.
فيما يتعلق بالدراسات ميكرودياليسيس في الحيوانات الصرع، من المهم التأكيد على أن البيانات التي تم الحصول عليها من معظم هذه تعتمد على رصد الفيديو أو الفيديو-EEG للمضبوطات، أيحدوث عابرة من علامات أو أعراض غير طبيعية بسبب المفرطة أو متزامن مع نشاط الخلايا العصبية في الدماغ32. وهناك بعض التفاصيل من مضبوطات اليكتروجرافيك في التعامل مع pilocarpine الحيوانات التي ينبغي النظر فيها عند إعداد التجربة. مضبوطات عفوية يتبعها كساد النشاط مع كثرة التخطيط الدماغي المسامير إينتيريكتال3 وتحدث في مجموعات،من3334. شام يشغلها غير صرع الحيوانات قد يحمل نشاط مثل الاستيلاء على35 ولذلك ينبغي أن تكون معايير التقييم تسجيلات التخطيط الدماغي موحدة36 ، وإذا كان ذلك ممكناً، ينبغي أن يكون توقيت الدورات ميكرودياليسيس محددة تحديداً جيدا. وأخيراً، ونحن نوصي بشدة وفقا للمبادئ والمعايير المنهجية لرصد EEG الفيديو في مكافحة القوارض الكبار حددها خبراء الجامعة الدولية ضد الصرع وجمعية الصرع الأمريكية في تقاريرها الأخيرة جداً37 ،38.
وهنا يصف لنا ميكرودياليسيس الغلوتامات واسبارتاتي جنبا إلى جنب مع تسجيلات الفيديو-EEG طويلة الأجل في الحيوانات الصرع وتحليلها في دياليساتي واسطة [هبلك]. وسوف نؤكد على الخطوات الحاسمة من البروتوكول أن المرء يجب العناية لنتيجة أفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الإجراءات التجريبية بجامعة فيرارا رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة ووزارة الصحة الإيطالية (إذن: مارك 246/2012-ب) وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في "المجتمعات الأوروبية" مجلس التوجيه من 24 نوفمبر 1986 (86/609/EEC). ويعدل هذا البروتوكول على وجه التحديد لتصميم غلوتامات واسبارتاتي في دياليساتيس الدماغ الفئران التي تم الحصول عليها تحت السيطرة EEG لدورات ميكرودياليسيس في الفئران الصرع وغير صرع. يمكن استبدال العديد من المواد الموصوفة هنا بسهولة مع تلك التي يستخدمها أحد في المختبر لتسجيلات التخطيط الدماغي أو ميكرودياليسيس.
1-جمعية الجهاز ميكرودياليسيس مسبار قطب كهربائي
- استخدم 3-القناة الملتوية اثنين قطب كهربائي (مع على الأقل 20 ملم قطع طول مسرى التسجيل و 10 سم طويلة التأريض الكهربائي) وزوجين من إلى قنية دليل لإعداد الجهاز. انظر أمثلة على القنية القطب والدليل 3-قناة لغسيل الكلي في الشكل 1A-1B.
- إزالة (الشكل 1) وإدراج (الشكل 1) قنية دليل المعادن في قنية بلاستيكية وهمية عدة مرات قبل الاستخدام من أجل تخفيف إزالة في الوقت الراهن التبديل للتحقيق ميكرودياليسيس في الحيوان.
- ثني الأسلاك الملتوية لتسجيل القطب مرتين (1E الرقم-1F) من أجل محاذاة الأسلاك مع قنية وهمية للدليل وقطع طرف قطب كهربائي (الشكل 1) لتكون أطول من طرف قنية دليل (الرقم 0.5 مم ح 1) باستخدام الفرجار الرقمية.
- يكون على استعداد سيركليت السليكون طويلة 1 مم (نقلت 2 مم، سمك 0.3 مم؛ 1I الشكل) وإدراج تلميح قنية دليل وغيض من أقطاب الملتوية في سيركليت السليكون باستخدام الملقط (الرقم 1J). الإصلاح على سفح الدليل رمي قنية مع الغراء البوليمر للعمل السريع أو الراتنج (الشكل 1 K). انظر على سبيل المثال الأجهزة المكتملة في الشكل 1 L و الرقم 2A.
- تعقيم الجهاز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم ليتعرض 4 حاء بدوره على الجهاز أربع مرات في ذلك كل من الجانبين للضوء ح 1.
ملاحظة: قد جمعت العديد من المجسات أقطاب وميكرودياليسيس المصنوعة بطريقة مماثلة. الرأس من فوق الزرع وصف للفئران بالأبعاد التالية: 7 مم عرض × عمق 5 مم × طول 10 ملم من الجزء العلوي رمي أخمص القدمين؛ تلميح زرع حوالي 11 مم في الطول، 600 ميكرون في القطر، وجميع الأجهزة أوزان حوالي 330-360 ملغ. الجهاز قد يكون استخدامها مرتين أو ثلاث مرات إذا تركت (ط) مدة كافية للقطب الأرضي في الجمجمة أثناء الجراحة لاستخدام المقبل و (ثانيا) عندما يتم قتل الحيوان، والجهاز تعافي جنبا إلى جنب مع الأسمنت الأسنان ويترك في الأسيتون أوفيرنيغ t، تلك التي قد تكون مصنفة الأسمنت ميكانيكيا، والجهاز غسلها وتعقيمها مرة أخرى.
2-ستيريوتاكسيك جراحة
- استخدام ستيريوتاكسيك الجهاز ومسبار كليب حامل (الشكل 2) لغرس الجهاز بعد بالمعايير المعاصرة لعملية جراحية معقمة وخالية من الألم39،،من4041.
- تخدير الفئران سبراغ داولي الكبار مع خليط الكيتامين/xylazine (43 مغ/كغ و 7 مغ/كغ، والقائمة) وإصلاحه على الإطار ستيريوتاكسيك. إضافة التخدير إيسوفلوراني (1.4 في المائة في الهواء؛ 1.2 مل/دقيقة) لحقن الكيتامين/xylazine الأولية كما أنها تسمح بالتحكم في عمق التخدير في الوقت. يحلق الفراء على رأس الحيوان.
- مسحه على سطح جلد الرأس بالحل القائم على اليود تليها الإيثانول 70% لإعداده لعملية جراحية معقمة39.
- زرع الجهاز القنية-القطب دليل على استعداد في الأسبقية (1.1-1.5) إلى الحصين البطني حق استخدام الإحداثيات التالية: شريط الآنف 5.0 ملم، (أ) – 3.4 ملم، ل + + + 4.5 مم، ف مم 6.5 إلى بريجما1،2. اتباع أساليب قياسية للعمليات الجراحية ستيريوتاكسيك10،،من1112.
- التأكد من أنها لا تشمل ترسيخ مسامير. عند تركيب على جهاز ستيريوتاكسيك، فهم الجهاز للرأس قنية دليل كهذا قد تكون محاذاة بسهولة لصاحب التحقيق.
- ربط الجهاز بالجمجمة مع مالا يقل عن أربعة مسامير غير القابل للصدأ الشد لهم في عظم الجمجمة (1 المسمار في المسمار الأيسر و 1 في لوحات الحق أمامي العظام والمسمار 1 إلى يسار الجدارية والمسمار 1 في لوحات إينتيرباريتال العظام). إضافة قطره غراء الأنسجة لمواصلة إصلاح كل المسمار إلى عظم الجمجمة.
- وتغطي نصف المواضيع المسمار مع الأسمنت ميثاكريليك. تعزيز ربط الأسمنت بجعل الأخاديد الضحلة في العظام لزيادة الالتزام.
- حالما يتم وضع غيض الجهاز إلى أنسجة المخ، تطور السلك الكهربائي الأرضي حوالي 3 ترسيخ مسامير. تغطي كل محمل مسامير والجهاز مع الأسمنت الأسنان12،،من4243.
- مراقبة الحيوانات أثناء الجراحة، وحوالي 1 ساعة بعد ذلك حتى تستقيم ويتحرك القفص. الاحتفاظ بها على لوحة الاحترار لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. السماح للفئران لاسترداد لمدة 7 أيام على الأقل بعد زرع جهاز.
- مراقبة الحيوانات على الأقل مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام بعد عملية جراحية لعلامات الألم أو المعاناة. تعطي الحيوانات مع كريم مضاد حيوي (مع الجنتامايسين 0.1 ٪) القريبة من الموقع قطعي لمنع العدوى ومسكن (ترامادول 5 مغ/كغ، والقائمة) لمدة 3 أيام لمنع الألم بعد الجراحة.
3-الفص الصدغي الصرع التعريفي Pilocarpine والإحالة للحيوانات للمجموعات التجريبية
- وبعد أسبوع انتعاش بعد الجراحة، تعيين الحيوانات عشوائياً إلى مجموعات: (ط) مراقبة الحيوانات تلقي الحيوانات المركبة والصرع (ثانيا) التي ستقوم بتلقي بيلوكاربيني. استخدام عدد أكبر نسبيا من الحيوانات للمجموعة الصرع منذ ليس كل من بيلوكاربيني تدار الفئران سوف يصابون بالمرض.
- حقن جرعة من ميثيلسكوبولاميني (1 مغ/كغ، والليبي) و 30 دقيقة، وبعد حقنه واحدة من بيلوكاربيني (350 مغ/كغ، والقائمة) للحث على مركز epilepticus (جنوب شرق). حقن ميثيلسكوبولاميني والمركبة (المالحة) على الفئران التحكم. استخدام المحاقن 1 مل مع 25 غ إبرة لجميع الإدارات القائمة.
- التحقق بصريا من الحيوانات لتبدأ لديها السلوكية المضبوطات (نقل فيبريسا خلال 5 دقائق، الإيماء رأسه، استنساخ أطرافه) وفي حدود 25 دقيقة لاستنساخ باستمرار جميع الجسم (جنوب شرق).
- اعتقال 2 SE ح بعد بداية لوفيات حوالي 25% وفترة كامنة يعني حوالي 10 أيام بإدارة ديازيبام (20 مغ/كغ، والقائمة). مراقبة وتسجيل أي ضبط السلوك بداية فورا بعد الحقن بيلوكاربيني وتستمر على الأقل 6 ح بعد ذلك.
- إعطاء المحلول الملحي الحيوانات (1 مل، القائمة) باستخدام المحاقن 1 مل مع حل ز 25 إبرة والسكروز (1 مل، ص. ب.) باستخدام 1 مل المحاقن والإبر ز 17 تغذية مرنة لمدة 2-3 أيام بعد سراج الدين لتعزيز انتعاش الجسم وفقدان الوزن.
- استبعاد الحيوانات التي لا تحقق وزن الجسم الأولية خلال الأسبوع الأول بعد بيلوكاربيني سراج الدين من الدراسة (باستثناء مجموعة الحاد قتل 24 ساعة بعد سراج الدين، التي لا يمكن فيها متابعة وزن الجسم ما).
- تعيين وظيفة-SE الحيوانات عشوائياً إلى مختلف المجموعات التجريبية (الشكل 3): الحاد المرحلة (ميكرودياليسيس التي يجري فيها 24 ساعة بعد SE)، الكمون (7-9 أيام بعد SE) ومصادرة العفوية الأولى (حوالي 11 يوما بعد SE) (الفترة المزمنة يبدأ حوالي 22-24 يوما بعد سراج الدين، أي حوالي 10 أيام بعد الاستيلاء على الأولى). مراقبة الحيوانات لحدوث الاختلاجات عفوية.
ملاحظة: استخدام تضمين/استبعاد المعايير التالية لتجارب أخرى في الفئران الصرع: تطوير SE التشنجية داخل ح 1 بعد بيلوكاربيني الإدارة؛ زيادة الوزن في الأسبوع الأول بعد سراج الدين وتحديد المواقع الصحيحة للتحقيق ميكرودياليسيس والقطب.
4-الصرع السلوك الرصد والتحليل
- مراقبة طويلة الأمد للسلوك الصرع
- ضع الحيوانات في أقفاص تنظيف المنزل حوالي 6 ح بعد pilocarpine الإدارة (أيفي نهاية الملاحظة المباشرة من الباحثين)، وبدء مراقبة الفيديو ح 24.
- مواصلة الفيديو ح 24 رصد حتى يوم 5، واستخدام نظام مراقبة فيديو رقمية.
- ابتداء من يوم 5، الاتصال على الفئران في أقفاص مستطيلة على الصفحة الرئيسية لنظام تسجيل EEG المربوطة، ومواصلة رصد ح 24 الفيديو.
- مجموعة المعلمات على مكبر للصوت المتمركزة خارج قفص فاراداي (معامل التضخيم مجموعة في كل قناة ووفقا لخصوصية إشارة EEG كل حيوان واحد) والبدء التخطيط الدماغي اكتساب مراقبة إشارة EEG التي تنتجها لا صلة لها الكابلات. استخدام العينات معدل 200 هرتز والمنخفضة تمرير تصفية مجموعة إلى 0.5 هرتز.
- قم بتوصيل الحيوان الكابلات عقد رئيس الحيوان بين اثنين من أصابعه امتدت من جهة والشد أسفل الموصلات لرمي قطب كهربائي باستخدام اليد الحرة الأخرى. بدء اكتساب.
تنبيه: تأكد من أن الإشارة خالية من القطع الأثرية. القطع الأثرية المشتركة هي طفرات تتجاوز كثيرا النطاق. - يوم واحد قبل التجربة ميكرودياليسيس، نقل الحيوانات في نظام التخطيط الدماغي المربوطة مجهزة باسطوانات شبكي ميكرودياليسيس. قم بفصل الحيوانات من التخطيط الدماغي الربط النظام في قفص المنزل الشد الموصلات من مسرى دون كبح جماح الحيوان. ضع الحيوان في اسطوانات شبكي عالية.
- رصد سلوك الصرع يوميا قبل وأثناء الدورة ميكرودياليسيس
- التبديل على مكبر للصوت المتمركزة خارج قفص فاراداي. فتح برنامج التخطيط الدماغي. بدء اكتساب EEG مراقبة إشارة EEG تنتجها الكابلات غير مرتبطة.
- قم بتوصيل الحيوان إلى نظام تسجيل EEG المربوطة عقد رئيس الحيوان بين اثنين من أصابعه امتدت من جهة والشد أسفل الموصلات لرمي قطب كهربائي باستخدام اليد الحرة الأخرى. تعيين عامل تضخيم (كسب) على كل قناة من مكبر للصوت وفقا لإشارة القطب حيوان واحد حتى إشارة EEG في الجدول. اسمحوا الحيوان استكشاف القفص الجديد (اسطوانة) على الأقل 1 ح تحت المراقبة المباشرة للباحث.
- ملاحظة: تجربة 24 ساعة قبل ميكرودياليسيس، ويتم تخديره الفئران بإيجاز مع إيسوفلوراني لتبديل cannulas دليل للتحقيق ميكرودياليسيس. الاستفادة من هذه اللحظة عندما يتم تخديره من توصيلها إلى نظام تسجيل EEG.
- قم بتقصير أو إطالة كابل متدلية وفقا للسلع الأساسية للحيوان. تأكد من أن الكبلات لا تتداخل مع حركات الحيوان والموقف الكذب.
- الاختيار لتأطير الصورة الصحيحة لكاميرات الفيديو. بدء تسجيل الفيديو-EEG.
- تحديد نشاط التخطيط الدماغي والمضبوطات
- استخدام برمجيات لاعب لمشاهدة أشرطة الفيديو. التمرير الفيلم 8 مرات أسرع من اللعب الوقت الحقيقي ويتفرد المضبوطات المعمم (انظر الحيوان إلى الخلف مع رمع فوريليمب أو الحيوان تربية والوقوع مع رمع فوريليمب). تبطئ الفيديو وملاحظة الوقت الدقيق من البداية والنهاية للاستيلاء على السلوكية.
- عملية البيانات حسب إحصاء عدد المضبوطات المعمم الملاحظ في ح 24 من سجلات الفيديو والتعبير عنها فيما يتعلق بالاستيلاء على تواتر ومدة يعني قيم جميع المضبوطات التي لوحظت في 24 ساعة.
- تعريف مضبوطات EEG كفترات النشاط الانتيابي من الترددات العالية (> 5 هرتز) تميزت > زيادة السعة 3-fold على خط الأساس مع تطور وتيرة سبايك الذي يستمر لمدة أدناها 3 s2،44 أو 28من مماثلة. استخدام برامج التخطيط الدماغي لمعالجة تسجيلات التخطيط الدماغي الخام. تقسيم آثار التخطيط الدماغي إلى كسور ح 1. نسخ الكسور EEG التتبع ملف للتحليل التلقائي سبايك البرمجيات.
- تحليل بيانات نشاط التخطيط الدماغي استخدام برامج التخطيط الدماغي والمعلمات المعرفة مسبقاً (4.3.3.). إجراء جميع التحليلات الفيديو في اثنين من المحققين المستقلين مكفوفي لمجموعة الحيوانات تم تحليلها. وفي حالة الاختلاف، جعلها تعيد النظر في البيانات معا للتوصل إلى توافق في آراء45.
5-ميكرودياليسيس
- في المختبر الانتعاش مسبار
- إعداد التحقيق للاستخدام الأولى وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، في الأكمام الواقية في التعامل.
- تشغيل التجربة في ثلاث نسخ: إعداد ثلاثة أنابيب الاختبار 1.5 مل تحميلها مع 1 مل من محلول للمسابقة التي تحتوي على خليط المعايير (2.5 ميكرون من غلوتامات) و 2.5 ميكرون من اسبارتاتي. وضع أنابيب الاختبار تحميل 1.5 مل ثلاثة في مجموعة سخان كتلة إلى 37 درجة مئوية ووضعه على محرض.
ملاحظة: استخدام نفس الحلول القياسية معايرات اللوني. - ختم أنابيب الاختبار 1.5 مل مع الفيلم البارافين وثقب أنه بالملقط حادة جعل حفرة من حوالي 1 ملم في القطر.
- يأخذ التحقيق وأدخله في الثقب في الفيلم البارافين. تزج الغشاء على الأقل 2 ملم تحت مستوى الحل. إصلاح مزيد التحقيق إلى 1.5 مل أنبوبة الاختبار بالفيلم البارافين.
تنبيه: التأكد من أن هذه المعلومة لا تلمس جدران أنبوب اختبار 1.5 مل. - قم بتوصيل مدخل مسبار المحاقن التي شنت على ضخ المضخة باستخدام محولات FEP-الأنابيب والأنابيب. اختيارياً، يتحمل غرامة استخدام أنابيب البوليثين 0.28 ملم OD معرف ومم 0.61 ومحولات الأنابيب الملونة (محولات أنابيب أحمر وأزرق) للاتصالات.
- بدء تشغيل المضخة في 2 ميليلتر/دقيقة واسمحوا السائل تظهر على طرف منفذ. قم بتوصيل منفذ مسبار مل 0.2 جمع أنبوب اختبار باستخدام محولات FEP-الأنابيب والأنابيب.
ملاحظة: استخدام أنابيب FEP لكافة الاتصالات. قص الطول المطلوب من الأنابيب باستخدام شفرة حلاقة. استخدام محولات أنابيب من لون مختلف لمدخل ومخرج للتحقيق. واسمحوا مضخة تشغيل ل 60 دقيقة الاختيار للتسريبات وفقاعات الهواء. هذه يجب أن لا تكون موجودة. - تعيين المضخة لتدفق معدل 2 ميليلتر الدقيقة والبدء في جمع العينات على الجانب منفذ الأنابيب.
- جمع ثلاث عينات بيرفوساتي 30 دقيقة وثلاث عينات متساوية الحجم من الحل في أنبوبة الاختبار 1.5 مل. أخذ العينات متساوية الحجم من أنبوبة الاختبار 1.5 مل كل 30 دقيقة باستخدام ميكروسيرينجي مغمورة في المحلول القياسي في أنبوبة الاختبار 1.5 مل.
- تكرار التجربة (5.1.1-5.1.8) إقامة المضخة لتدفق معدل 3 ميليلتر/دقيقة (5.1.7) أن يكون تحقيق انتعاش مقارنة عند استخدام معدلات تدفق نضح مختلفة اثنين.
- عند الانتهاء، تتوقف المضخة وشطف الأنبوب بماء مقطر، الإيثانول 70% ودفع الهواء في ذلك. تخزين المسبار في قنينة مملوءة بالماء المقطر نظيفة. أشطف التحقيق بعناية قبل بيرفوسينج في 2 ميليلتر/دقيقة بالماء المقطر قبل التخزين.
- تحليل تركيز غلوتامات والاسبارتيت في العينات اللوني (انظر التفاصيل أدناه؛ 6.3).
- حساب الاسترداد استخدام المعادلة التالية:
الاسترداد (%) = (جبيرفوساتي /جدياليسيد الحل) x 100.
- دورات ميكرودياليسيس في الانتقال بحرية الفئران
- الإجراءات التحضيرية: التحقيق في الإدراج، والاختبار، وضخ ضخ إعداد وبدء
- إعداد تحقيقات ميكرودياليسيس لاستخدام الأولى وفقا لدليل المستخدم الصانع وملئها بالحل في المسابقة. قطع حوالي 10 سم قطعة طويلة من أنابيب FEP وتوصيلها إلى cannulas مدخل ومخرج للتحقيق باستخدام أنابيب المحولات ذات ألوان مختلفة.
- تأكد من أن الأنبوب اللمسات المحولات مع لا قتلى الفضاء في كافة الاتصالات.
- 5.2.1.3-تخدير 24 ساعة قبل التجربة ميكرودياليسيس، بإيجاز الحيوان مع إيسوفلوراني (5% في الهواء) في دائرة التعريفي لحين راقد. إزالة قنية وهمية من دليل استخدام الملقط وعقد رئيس الحيوان بشدة. إدراج التحقيق ميكرودياليسيس، تتمتع بغشاء دياليزينج، في دليل قنية وشركة cannulas ميكرودياليسيس إدراجها في دليل على بواسطة نمذجة الطين.
تنبيه: لا تدع المسبار اللمس جدران الأكمام مسبار الواقية عند استخراج. - وضع الحيوان في الاسطوانة شبكي والسماح لها باستكشاف أجواء جديدة. الاتصال بنظام تسجيل EEG المربوطة الحيوان كما هو موضح أعلاه (اتبع النقاط 4-2-2 و 4.2.3).
- اتبع يقظة والانتقال بحرية حركة الفئران وتوصيل مدخل المسبار المحاقن 2.5 مل مع يتثلم ز 22 إبرة تحتوي على الحل في المسابقة باستخدام محولات الأنابيب. دفع الحل للمسابقة داخل التحقيق إخراج 1 مل من محلول للمسابقة في 10 s دفع المكبس من 2.5 مل حقنه بشكل مستمر. تحقق من وجود قطره السائل التي تظهر على المنفذ. التحقيق الآن جاهزة للاستخدام.
- تملأ المحاقن 2.5 مل متصلة بأنابيب FEP بمحولات الأنابيب مع الحل للمسابقة وجبل لهم على مضخة التسريب. بدء تشغيل المضخة في 2 ميليلتر/دقيقة. السماح لها بتشغيل بين عشية وضحاها.
ملاحظة: استخدام الطول المطلوب من جميع FEP-أنابيب ولكن حساب حجم أنابيب الميت أن تعرف متى ينبغي أن تبدأ في تنشيط ك+ عالية وربط بيانات القياس الكمي بالتغيرات الكيميائية العصبية في دماغ الحيوان. استخدام فقاعة الهواء التي تم إنشاؤها في الأنبوب تحت تدفق العمل لحساب هذه المرة.
- جمع عينات من خلال تحفيز EEG تسجيل والبوتاسيوم
- تحقق من عدم وجود المضبوطات في ح 3 السابقة لبدء جمع العينات (تسجيلات الفيديو-EEG)، ومواصلة رصد النشاط الاستيلاء أثناء ميكرودياليسيس.
- إيقاف المضخة حمل المحاقن مقني FEP-أنابيب يملأ مع الحل للمسابقة. جبل على مضخة مجموعة أخرى من المحاقن 2.5 مل ك+ الحل متصلة أنابيب FEP مع أنابيب المحولات يملأ مع في المسابقة تم التعديل في محلول يحتوي على 100 ملم.
- بدء تشغيل المضخة في الدقيقة 2 ميليلتر والسماح لها بتشغيل. لزيادة سرعة ملء الأنبوب، تعيين المضخة في 5 ميليلتر/دقيقة للوقت لملء. التحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام. التأكد من أن الأنابيب اللمسات المحولات مع لا قتلى الفضاء في كافة الاتصالات.
- اختبار التحقيق إذا كانت جاهزة للاستخدام في الحيوان كما هو موضح أعلاه (5.2.1.5).
ملاحظة: إذا كان لسبب ما لا يعمل المسبار، تغييره. لهذه الحالات، تبقى بضعة تحقيقات ميكرودياليسيس المعدة جاهزة للاستخدام قرب محطة ميكرودياليسيس-EEG. قطع الكابلات EEG الحيوان وتخدير بإيجاز مع إيسوفلوراني إذا لزم الأمر لتحقيق التغيير. - قم بتوصيل FEP-أنابيب الحقن يملأ مع الحل للمسابقة إلى قنية مدخل للتحقيق في كل الحيوانات وانتظر ظهور انخفاض السائل على طرف المنفذ.
- قم بتوصيل منفذ المسبار أنابيب FEP، الأمر الذي يؤدي إلى جمع في أنبوبة الاختبار. إدراج FEP-الأنابيب في أنبوبة الاختبار مغلقة 0.2 مل مع غطاء مثقب. ضمان بقاء الأنبوب في المكان عن طريق تحديد مع قطعة من الطين النمذجة.
- الاستمرار في تشغيل المضخة في الدقيقة 2 ميليلتر لمدة 60 دقيقة دون جمع العينات حجته في النظام (العينة صفر).
- جمع 5 عينات dialysate على التوالي 30 دقيقة (60 ميليلتر حجم كل منهما) تحت ظروف خط الأساس (التروية مع الحل الطبيعي دجالة). تخزين العينات في الثلج.
- حساب الوقت الذي يستغرقه السائل لتمرير من المضخة في رأس الحيوان (هذا يعتمد على حجم القتلى من الأنابيب، أي، وقت فقاعة هواء) والتبديل أنابيب FEP أن يذهب من الحقن التي تحتوي على الحل الطبيعي دجالة بالحقن التي تحتوي على تعديل الحل (100 مم ك+) المسابقة في هذا الوقت دون توقف المضخة. التحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام. واسمحوا مضخة تشغيل لمدة 10 دقائق.
تنبيه: في 10 دقيقة من ارتفاع ك+ التحفيز، تميل الحيوانات لنقل أنفسهم محمومة، وعادة ما يقدم عدد كبير من الكلاب الرطب يهز (التحكم والخروج من الاستيلاء على مجموعة الحيوانات) أو السلوكية نوبات (الصرع الحيوانات)، حتى يكون جاهزاً التدخل من أجل حماية الأنابيب والكابلات من التواء. - بعد 10 دقيقة، تبديل الأنابيب من الحقن التي تحتوي على 100 مم ك+ في المسابقة الحل إلى الحل الطبيعي دجالة والسماح بتشغيل المضخة. عدم إيقاف تشغيل المضخة خلال التغييرات الحل حيث أنه سوف يكون هناك قطره من السائل في نهاية الأنبوب يكون متصلاً بالخط.
- من اللحظة التي دياليساتي يحتوي على البوتاسيوم عالية، أي، بعد جمع الموازنة بعد الخامسة dialysate، جمع الكسور دياليساتي كل 10 دقائق (20 ميليلتر) حاء 1 3 جمع عينات dialysate 30 دقيقة إضافية، ووقف مضخة. تخزين العينات في الثلج.
- تخزين العينات في-80 درجة مئوية بعد التجربة حتى التحليل [هبلك].
- تكرار التجربة ميكرودياليسيس لمدة 3 أيام على التوالي، باستثناء الحادة (24 ساعة) والمجموعة الاستيلاء الأولى، التي ميكرودياليسيس واحدة فقط تنعقد الدورة 24 ساعة بعد سراج الدين أو في غضون 24 ساعة بعد استيلاء العفوية الأولى (الشكل 3).
- وعند الانتهاء من كل تجربة، euthanize الحيوان بجرعة مخدر زائدة وإزالة الدماغ لتحقق موضع التحقيق وقطب كهربائي.
- الإجراءات التحضيرية: التحقيق في الإدراج، والاختبار، وضخ ضخ إعداد وبدء
- إجراءات الوظيفة-ميكرودياليسيس
- شطف المسابر المستخدمة ميكرودياليسيس مع الماء المقطر وتخزينها في قنينة مملوءة بالمياه المقطرة النقية حتى الاستخدام التالي.
ملاحظة: الأغشية التي يعاد استخدامها وقد زادت النفاذية؛ تحقق من استرداد التحقيق قبل استعماله المتكرر. - أشطف ميكرودياليسيس كامل بإعداد (الأنابيب والموصلات والمحاقن) مع الماء المقطر تليها إيثانول 70%. استبدال الإيثانول بالهواء وتخزين المجموعة في بيئة معقمة.
- تقسيم العينات dialysate القاعدية إلى 20 ميليلتر الكسور واستخدام جزء واحد فقط من 20 ميليلتر للأحماض الأمينية القاعدية تركيز التحليل. تخزين حجم العينة المتبقية لتحليل إضافي أو المؤكدة في-80 درجة مئوية.
- إصلاح العقول في الفورمالين 10% والحفاظ عليها ب تضمين البارافين1. التاج الفرع العقول إلى شرائح ووصمة عار لهم والهيماتوكسيلين ويوزين. دراسة العقل المدبر للتحقيق الصحيح والقطب الموضع1،2.
ملاحظة: إصلاح العقول في تبريد 2-ميثيلبوتاني وتخزينها في-80 درجة مئوية. استخدام أي الأخرى ثبت تلطيخ على قطاعات النسيج العصبي الذي يسمح لتصور المسالك المسبار وقطب كهربائي.
- شطف المسابر المستخدمة ميكرودياليسيس مع الماء المقطر وتخزينها في قنينة مملوءة بالمياه المقطرة النقية حتى الاستخدام التالي.
6-الكروماتوغرافي تحليل غلوتامات واسبارتاتي
- إعداد ديريفاتيزينج عامل
- مزيج من وحدات كل منها 20:1 (v/v) كاشف أورثوفثالديالديهيدي (أوبا) و 2-mercaptoethanol (5-ME) في القنينة. أغلق القنينة حاجز ضيق كاب والهواء باستخدام.
تنبيه: تعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. - دوامة الحل المعدة ووضعه في أوتوسامبلير في منصب لوكيل ديريفاتيزينج.
- مزيج من وحدات كل منها 20:1 (v/v) كاشف أورثوفثالديالديهيدي (أوبا) و 2-mercaptoethanol (5-ME) في القنينة. أغلق القنينة حاجز ضيق كاب والهواء باستخدام.
- إعداد عينات دياليساتي
- وضع إدراج الزجاج مع الربيع أسفل القنينة أوتوسامبلير البنى 2 مل. إعداد في القنينات لجميع العينات المقاسة في دفعة واحدة.
- أخذ عينات الغسيل الكلوي ميليلتر 20 من الثلاجة-80 درجة مئوية والسماح لهم بالذوبان. إزالة 1 ميليلتر من الحل وإضافة 1 ميليلتر من المعايير الداخلية (ق. أ) ل هوموسيريني (50 ميكرومتر) إلى 19 ميليلتر للعينة، ومن ثم العينة تحتوي على 2.5 ميكرون من هو. "الماصة؛" 20 ميكروليتر من عينة الغسيل الكلوي في إدراج الزجاج في قنينة وختم أنه مع حاجز هواء ضيقة.
- ضع قارورة تحتوي على العينات في أوتوسامبلير استخدام البرمجيات الكروماتوغرافي لتسمية هذه العينات في مواقفها.
- التحليل الكروماتوغرافي العينات لتحديد تركيز غلوتامات والاسبارتيت
- تشغيل التحليلات على النظام اللوني السائل مع الكشف عن سبيكتروفلوروميتريك. الكشف عن الأحماض الأمينية بعد 2 دقيقة قبل العمود derivatization مع 20 ميكروليتر من أورثوفثالديالديهيدي/5-mercaptoethanol 20:1 (v/v) إضافة إلى 20 ميكروليتر من عينة.
- إعداد النظام لتحليل الأحماض الأمينية. قم بالتبديل في أوتوسامبلير، المضخة، في ديجاسير، الكاشف ووحدة التحكم جنبا إلى جنب مع جهاز الكمبيوتر.
- تزج سحب في زجاجات تحتوي على المرحلة المتنقلة وتطهير قنوات المضخة الكروماتوغرافي التي ستستخدم للتحليل.
- ابدأ بزيادة تدفق المرحلة المتنقلة التحقق من الضغط على العمود (مثلاً، في بداية 0.2 مل/دقيقة وزيادة التدفق ل 0.2 مل/دقيقة إضافية كل 5 دقائق حتى تحقيق تدفق العمل). السماح للنظام تشغيل العمل في التدفق 0.8 مل/دقيقة على الأقل 1 ح حجته في العمود.
تنبيه: الضغط غير مستقر يدل على وجود الهواء في النظام. وينبغي أن لا يتجاوز الضغط 25 الآلام والكروب الذهنية. - تعيين المكسب وحساسية عالية وموجات الإثارة والانبعاثات على الكاشف إلى 345/455 نانومتر على التوالي. إعادة تعيين إشارة كاشف (أوتوزيرو).
- باستخدام البرمجيات الكروماتوغرافي، إرسال الطريقة للصك. الآن، ينبغي أن يكون اللوني جاهزة لقياس.
- فصل العينات dialysate، ارتفعت معيار عينات dialysate، فضلا عن معايير (0.25 ميكرومتر – 2.5 ميكرون اسبارتاتي والغلوتامات في الحل في المسابقة) في العمود الكروماتوغرافي المناسبة. معايرة أسلوب الكروماتوغرافي وإقامة حدود الكشف والتحديد الكمي قبل أي تحليل عينات الغسيل الكلوي.
- تنشيط تحليل واحد أو إنشاء تسلسل للعينات تحليلها باستخدام البرمجيات اللوني وتشغيل التسلسل.
تنبيه: تشغيل نموذج فارغ واحد أو أكثر وعينات قياسية مختلفة ضمن سلسلة عينات دياليساتي من أجل التحكم في دقة الأسلوب. - حالما يتم الحصول تشروماتوجرامس، تحليل لهم مع البرمجيات اللوني. تحقق إدماج قمم الفائدة في هذه المؤامرة المعايرة. استخدام منطقة الارتفاع أو ذروة الذروة للقياس الكمي.
- بمجرد الانتهاء من تسجيل العينة ملء العمود والنظام مع مذيب عضوي (مثلاً، الاسيتو الانيتريل 50% في الماء عالي النقاوة) لمنع نموها الشيخوخة والعفن في ذلك.
- إيقاف تشغيل النظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحقيق الانتعاش
وكان الانتعاش يعني (أي محتوى الأحماض الأمينية يعني في بيرفوساتي كنسبة مئوية من المحتوى الموجود في وحدة تخزين متساوية من الحل القنينة) ± 15.49 0.42% بمعدل تدفق 2 ميكروليتر/min و ± 6.32 0.64 في 3 ميكروليتر/دقيقة الغلوتامات و 14.89 ± 0.36 في المائة بمعدل تدفق 2 ميكروليتر/min و ± 10.13 0.51 في 3 ميكروليتر/دقيقة اسبارتاتي عند استخدام المسبار غشاء كوبروفاني. في حالة استخدام المسبار غشاء ﺍﻟﺍﻛﺭﻳﻟﻭﻧﻳﺗﺭﺍﻟ، كان الانتعاش يعني ± 13.67 0.42% بمعدل تدفق 2 ميكروليتر/min و 6.55 ± 1.07 في 3 ميكروليتر/دقيقة غلوتامات و 14.29% 0.62 ± بمعدل تدفق 2 ميكروليتر/min و 8.49 ± 0.15 في 3 ميكروليتر/دقيقة اسبارتاتي (4A الرقم-4B). كما أنه يمكن رؤيتها بوضوح في الشكل 4A، معدل التدفق أبطأ (2 ميكروليتر/دقيقة) يعزز أداء كلا المسابير دياليزينج. للتجارب التالية المسبار غشاء هبت كوبروفاني perfused في تدفق معدل 2 ميكروليتر/دقيقة قد اختيرت، بسبب انتعاش يعني كان أعلى (حتى إذا لم يكن كبيرا) هذا معدل تدفق لتحليلها على حد سواء، ونظرا لاستمرارية تجريبية (هذه المسابر واستخدمت لتحليل غابا في الأسبقية1).
التنمية المضبوطات وتطور المرض بعد مركز epilepticus
السلوكية ورصد EEG للمضبوطات، تقييمها، جرى في جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة للتأكد من تنمية وتطور المرض TLE في هذه.
سراج الدين التشنجية القوية، التي توقفت بعد 3 ح استخدام الديازيبام، حدث 25±5 دقيقة بعد حقن بيلوكاربيني. بعد ذلك، دخلت جميع الحيوانات حالة كمون التي كانوا على ما يبدو جيدا وكانوا باستمرار رصد للتحقق من حدوث أي ضبطيات عفوية في أول أيام 9 أو تحديد مصادرة العفوية الأولى، على التوالي للفيديو-EEG زمن الوصول والاستيلاء على المجموعة الأولى. ضبط عفوية أول حدث 11.3 ± 0.6 يوما سراج الدين (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 21). بعد ذلك، المضبوطات حدثت في مجموعات، وتفاقم في الوقت المناسب. شهدت الفئران الصرع في أواخر المرحلة المزمنة (55-62 يوما بعد SE) 3.3±1.2 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 12) المعمم مضبوطات يوميا. وكان هناك تطور واضح لهذا المرض. كثيرة، ولكن ليس كل التخطيط الدماغي المضبوطات، تتفق مع نشاط الضبط السلوكي. يظهر الشكل 5B نشاط مسجل صرعية الانتيابي الذي لوحظ حوالي 500 مللي قبل وأثناء ضبط السلوكية. يظهر الشكل 5A آثار التحكم في الفئران غير صرع.
الممثل القيم القاعدية للأحماض الأمينية الموجودة في بيرفوساتي ميكرودياليسيس والبوتاسيوم وحفز الإفراج عن الغلوتامات
وكان تركيز غلوتامات القاعدية وجد في الفئران الصرع المزمن (0.87 ± 0.06 ميكرومتر) أعلى بكثير مما في مراقبة الحيوانات (0.59 ± 0.03 ميكرون؛ ف < 0.05 مقابل الضوابط؛ وأحادي الاتجاه ANOVA والمخصص بعد دونيت اختبار). كان هناك لا فرق معتد به إحصائيا بين الحيوانات غير صرع (0.30 ± 0.05 ميكرومتر) في ك القاعدية أو عالية+ أثارت اسبارتاتي تركيزات والصرع المزمن (0.31 ± 0.04 ميكرومتر). انظر المادة الأصلية لتفاصيل2. الدراسات مستويات الغلوتامات في مكافحة الفئران تتماشى مع تلك التي عثر عليها قبل الآخرين في مماثلة القاعدية المبلغ عنها (أيعن 0.75 ميكرون عند استخدام تدفق 2 ميليلتر/دقيقة وأغشية من الطول الفعلي 2 مم)46،47،48 ،،من4950،51،،من5253. ومع ذلك، العديد من العوامل المختلفة يمكن أن تؤثر نتائج ميكرودياليسيس، على سبيل المثال طول فعالة للتحقيق والغشاء قطع.
عالية ك+--أثارت إصدار إضافية من الغلوتامات لحوالي 30 دقيقة في مكافحة الفئران وحوالي 60 دقيقة في الفئران الصرع المزمن (الشكل 6). انظر المادة الأصلية لتفاصيل2. كما يمكن أن يتضح من مسار الوقت يصور، كان القرار الوقت 10 دقيقة من ميكرودياليسيس كافية لالتقاط الفروق في الإفراج عن الغلوتامات الموجودة في كلتا المجموعتين من الحيوانات.
[هبلك] المعايرة وحدود
البيانات حسبت على أساس منحنيات المعايرة التي تم الحصول عليها مع الحلول القياسية غلوتامات واسبارتاتي والداخلية القياسية لهوموسيريني. وأعرب عن تركيز غلوتامات العصبية واسبارتاتي في perfusates في القيم المطلقة (µmol/L). شيد كل قطعة المعايرة بواسطة تحليل الحلول غلوتامات واسبارتاتي على أربعة مستويات تركيز (replicates خمسة في كل مستوى). وحسبت معاملات الانحدار لمؤامرات المعايرة: y = كس + س، حيث x نسبة التركز، اسبارتاتي أو الغلوتامات للأم-هوموسيريني (ق. أ) و y نسبة الذروة-المنطقة المقابلة اسبارتاتي أو الغلوتامات للأم-هوموسيريني ( هو). وتم حساب معامل التحديد (ص2). إمكانية تطبيق أسلوب [هبلك] كان في الحدود؛ تم تحديد الحد الأدنى للتقدير الكمي كأدنى تركيز في منحنى المعايرة القياسية والحد الأعلى للقياس الكمي كأعلى تركيز المستخدمة لتحليلها من الأحماض الأمينية للمعايرة، على التوالي. وحسبت أيضا الحد من الكشف عن (اللد). بعض من هذه القيم هي المبينة في الجدول 1. Chromatogram نموذج من نماذج فارغة، معايير الغسيل الكلوي العينة وجمع العينات التي تم الحصول عليها مع الأسلوب المبين أعلاه تظهر في الشكل 7.
التحقيق التعريب
تم زرع مسبار ميكرودياليسيس وتسجيل القطب في الحصين حق البطني وتم التحقق من موضعها الصحيح. وأدرجت في التحليل فقط تلك الحيوانات حيث غرس كان أقصى في 500 ميكرومتر بعيدة عن الإحداثيات استقرت (انظر الشكل 8).
رقم 1. خطوة بخطوة إعداد الجهاز ليكون مزروع. (أ) 3-قناة قطب كهربائي مع 10 سم طويلة أسس قطب كهربائي في الأكمام الواقية في قنية اليسار ودليل ميكرودياليسيس على اليمين المطلوبة لتجميع الجهاز. (ب)-قنية العارية القطب والدليل بالتفصيل. الخطوة الأولى هي لإزالة (ج) وإدراج (د) قنية دليل المعادن من وإلى البلاستيك وهمية عدة مرات لتسهيل الإفراج عن زرع مرة واحدة في رأس الحيوان. والخطوة الثانية أن ينحني مرتين الملتوية مسرى التسجيل يكون الانحياز للغسيل الكلوي دليل قنية (ه، و). (ز ينبغي خفض نصيحة قطب كهربائي) أن تكون أطول من طرف قنية دليل معدنية 0.5 مم. (ح) التحقق من دقة القص باستخدام الفرجار الرقمية. وفي وقت لاحق، حوالي 1 مم circlet السليكون طويلة يجب استخدام لإصلاح المحاذاة لقطب كهربائي لتوجيه القدم قنية (ط). (ي) صورة تبين كيفية عصابة مسرى وتوجيه رمح القنية. الخطوة الأخيرة وضع قطره من الراتنج أو الصمغ على رمي قنية دليل تحديد سيركليت السيليكون لأنها (K). (ل) تجميع الجهاز جاهزة التعقيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. صور لأنواع مختلفة من الأجهزة ميكرودياليسيس-EEG في الفئران المستخدمة (A) وصورة فوتوغرافية لصاحب مقطع مسبار (ب) تستخدم لزرع هذه الأجهزة- (أ) قنية دليل (باللون الأخضر) يتم استبداله قنية ميكرودياليسيس عادة 24 ساعة قبل التجربة. موصل كهربائي للجهاز (اليسار الأولى استخدمت للتسجيلات الموصوفة في هذه المخطوطة) يسمح الحجز على الأسلاك التي تجري الإشارة الكهربائية لمعدات جمع مكبر للصوت والبيانات. الجهاز متصل جراحيا في الجمجمة من الفئران تخديره وتسجيلات يمكن الحصول عليها في وقت لاحق دون أن تسبب الألم أو عدم الراحة في التصرف بحرية الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. تصميم تجريبي- الأسبوع أمام مركز epilepticus (جنوب شرق) التعريفي، الفئران مزروع مع الجهاز. سراج الدين هو فعل pilocarpine والحيوانات (إذا لم دياليزيد وقتلوا في 24 ساعة بعد سراج الدين؛ الفئران من مجموعة الحادة) بالفيديو رصد لمدة 5 أيام (الخط الأزرق)، ثم الفيديو-التخطيط الدماغي رصد لتقييم تواتر الاستيلاء ومدتها في اقفاصها المنزل (الخط الأخضر). للتجربة ميكرودياليسيس، رصد عنصر التحكم غير صرع الصرع وكل الفئران يتم نقلها إلى التخطيط الدماغي آخر إعداد مزودة بأقفاص اسطوانة في 24 ساعة قبل الدورة ميكرودياليسيس ولا يزال الفيديو-EEG (الخط الأخضر الخفيفة). وتمثل الخطوط الحمراء الرأسية دورات الغسيل الكلوي في نقاط زمنية مختلفة لتطوير مرض الصرع. خطوط حمراء أفقية تمثل مجموعات مختلفة من الحيوانات الصرع (وكل منهما غير صرع الحيوانات)، حيث يشير السهم إلى آخر يوم من ميكرودياليسيس ويوم وفاة الحيوان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. الانتعاش في المختبر من اثنين الغسيل الكلوي المسابير. يعني الانتعاش في المختبر (%) اسبارتاتي وغلوتامات استخدام اثنين المسابير ميكرودياليسيس المتاحة تجارياً مختلفة (سواء هبت غشاء دياليزينج طويلة 1 مم) في (أ) 2 ميكروليتر/دقيقة ومعدل التدفق ميليلتر (ب) 3/دقيقة. البيانات هي ± يعني تشغيل SEM 3 تجارب مستقلة في تريبليكاتيس. لا توجد فروق معتد بها إحصائيا بين كفاءة مختلف المسابر (الطالب مزاوج اختبار t, p < 0.05). باستخدام معدل 2 ميكروليتر/دقيقة تدفق الانتعاش غلوتامات زادت نسبة 5 في المائة بالمقارنة مع معدل التدفق ميليلتر في الدقيقة 3، وبالتالي أبطأ معدل تدفق استخدمت للتجارب ميكرودياليسيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. تسجيلات التخطيط الدماغي توضيحية من الحصين البطني الأنشطة باراوكسيستيك كما يتبين في المرحلة المزمنة في الفئران التحكم والصرع. (أ) اثنين من آثار الممثل المسجلة في اثنين من الفئران غير صرع تعامل المالحة. (ب) آثار مسجلة في الفئران صرع اثنين. تصريفات صرعية تتوافق مع الفئة 3 مضبوطات السلوكية في هذه الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. الوقت-بالطبع تأثير التحفيز البوتاسيوم في الإفراج عن الغلوتامات من الحصين الفئران. أداء الممثل نتيجة للتجربة ميكرودياليسيس في التحكم 6 (الدوائر المفتوحة) والفئران الصرع المزمن 6 (دوائر سوداء). الرسم البياني يوضح التغيرات الزمنية غلوتامات dialysate التركيز أثناء التجارب ميكرودياليسيس وخلال تحفيز ك+ ارتفاع 100 ملم. يتم الإشارة إلى وقت التحفيز ك+ عالية (10 دقيقة) شريط أسود في أسفل الرسم البياني. البيانات هي وسائل ± SEM الحيوانات 6 كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7. شكل توضيحي تشروماتوجرامس. تتم تسمية قمم المعروفة. وردي التتبع: تشروماتوجرام حل للمسابقة دون الأمينات المضافة عمدا بعد أوبا/5-لي derivatization (نموذج فارغ). الأزرق تتبع: chromatogram عينة دياليساتي بعد derivatization عرض قمم الأحماض الأمينية: اسبارتاتي (تيآر مين 4.80)، غلوتامات (تيآر مين 6.75) والجلوتامين (تيآر 9.19 دقيقة) والذروة هو L-هوموسيريني (2.5 ميكرون، الاحتفاظ بالوقت، تي R دقيقة 9.83). تتبع الأحمر: Chromatogram مستوى اسبارتاتي (2.5 ميكرومتر) والغلوتامات (2.5 ميكرومتر) في الحل للمسابقة. الخلفية الأزرق السماوي والأصفر للمدرجات صورة للجوال المرحلة ألف (أزور) والنقالة المرحلة الجزء ب (أصفر) المستخدمة شطف تحليلها. مستطيل أحمر أشارت إلى منطقة (تيآر 10.41 دقيقة وكذلك) يظهر قمم أوبا تدهور منتجات ومواد غير معروفة. وكانت جميع حقن كميات 20 ميليلتر. تم فصل المشتقات بمعدل تدفق 0.8 مل/دقيقة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 8. صورة تمثيلية لموضع التحقيق القطب مجتمعة داخل الحصين البطني. (أ) صورة يظهر ذعر تركتها نصيحة الجهاز بالتفصيل (السهم الأسود). (ب) التخطيطي توضيح مواقف نصيحة القطب-التحقيق داخل الحصين البطني مزروع الفئران 12. المربعات الصلبة (بعض التداخل) تشير إلى نصائح القطب مسبار المترجمة بشكل صحيح. الساحات المفتوحة تشير إلى نصائح القطب مسبار مترجمة بشكل غير صحيح في الحيوانات التي تستبعد من الدراسة (n = 3). تم تجهيز شرائح المخ الاكليلية التي تحتوي على إجراء تحقيقات وتسجيل المواقع بعد تجارب للتحليل النسيجي. تظهر الأرقام أعلاه الرسم التوضيحي المسافة من بريجما (وفقا Pellegrino et al. عام 1979 أطلس الدماغ الفئران؛ وشريط الآنف + 5.0 ملم، تنسق المستخدمة:-3.40 مم، L + 5.4 مم؛ ف + 7.5 ملم من دوراً). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| أكثر | ج (μmol/لتر) | ك | q | r2 | اللد (pmol/l) |
| غلوتامات | 0.25-2.5 | 5.215 | 1043.79 | 0.999 | 19.4 بالمئة |
| اسبارتاتي | 0.25-2.5 | 2.258 | 1994.72 | 0.998 | 31.7 |
الجدول 1. خصائص القياس الكمي [هبلك] الطريقة المستخدمة لتحديد الأحماض الأمينية. الحصول على تركيز مجموعة من المعايير (ج)، المنحدر (k)، واعتراض (q)، ومعامل التحديد (ص2) والحد من الكشف عن (اللد) تصف المعايرة المؤامرات مع الحلول القياسية غلوتامات واسبارتاتي (0.25، 0.5، 1.0 و 2.5 ميكرون ) والداخلية القياسية لهوموسيريني (2.5 ميكرومتر) باستخدام الأسلوب [هبلك] وصف مع الكشف عن سبيكتروفلوروميتريك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن في هذا العمل، يظهر كيف يمكن أن يتم تسجيل الفيديو-EEG مستمر مقرونا ميكرودياليسيس في نموذج تجريبي ل TLE. وتستخدم تقنيات تسجيل الفيديو-EEG لتشخيص المراحل المختلفة لتطور المرض في الحيوانات بشكل صحيح ويتم استخدام تقنية ميكرودياليسيس لوصف التغييرات في الإصدار الغلوتامات التي تحدث في الوقت المناسب (لا تغييرات تم إيجاد اسبارتاتي في دراسة نشرت سابقا2). نوصي بشدة باستخدام الجهاز/زرع واحد للقيام بها في كل الحيوانات على حد سواء للأسباب الواردة في المقدمة.
كلما كان ذلك متاحاً، ينبغي أن يكون راديوتيليميتري المفضل للأنظمة المربوطة لتسجيل التخطيط الدماغي المزمن كما أنه يقلل من التدخلات مع السلوك ويقلل خطر الضرر والشدة ل الحيوانات54. ومع ذلك، تسجيل EEG المربوطة تكلفة أقل بكثير من القياس عن بعد.
في المختبر، ونحن استخدام موصلات إلى EEG تسجيل النظام وأنابيب ميكرودياليسيس في نفس الوقت، مثل أن يتم إرفاق الأسلاك والغلايات ليدور مختلفة اثنين. هذه هي القضية الأكثر أهمية لهذه التجارب: الأسلاك والأنابيب تميل إلى عبور متكرر بسبب حركات الحيوان. ولذلك، نحن نستخدم موصلات وأنابيب طويلة بما يكفي للسماح للحيوان مطاردة الذيل الخاص به (سلوك الذي عادة ما يلاحظ مع حفز البوتاسيوم) أو تسقط ولفه أثناء نوبات الصرع المعمم. فمن المستحسن أن شركة أخرى cannulas ميكرودياليسيس إدراجها في دليل على بواسطة نمذجة الطين، بغية تعزيز اتصالها مع الدليل (في بعض الأحيان، ميكرودياليسيس cannulas هي صدم ضد جدران القفص خلال النوبات المعممة، وقد slip قبالة). من ناحية أخرى، فإنه من المستحسن أن تبقى أنابيب قصيرة قدر الإمكان، التقليل إلى أدنى حد من التأخير بين الكيميائية العصبية ووقت جمع. هذا مهم خاصة عندما يتم جمع فترات قصيرة. وبصفة عامة، ينبغي أن تكون أنابيب ميكرودياليسيس الطول الكافي والقدرة على ضمان أن الوقت أخذ العينات لا تتجاوز الفترة الزمنية بين مأخذ الغسيل الكلوي وجمع. ولوحظ أن الذوائب تميل إلى منتشر بين بعض المقابس أكثر إذا كان الوقت الميت أنابيب متفوقة على معدل أخذ العينات55. ولذلك، ينبغي أن خفضت إلى أقصى حد ممكن الوقت الميت تجريبية/حجم أنابيب ميكرودياليسيس وتحدد بدقة من أجل ربط بيانات الكيمياء العصبية مع سلوك الحيوان. وأخيراً، من المهم ملاحظة أن يدور واقطاب يقترن القنية لدراسات التخطيط الدماغي وميكرودياليسيس مجتمعة متوفرة تجارياً. ولذلك، كلما كان ذلك ممكناً، إعداد نظام التخطيط الدماغي مع خيار للقيام بتجارب ميكرودياليسيس.
توصيات بسيطة: (ط) قبل البدء في أي تجربة، تحقق من أن التخطيط الدماغي تسجيل النظام و/أو ميكرودياليسيس إعداد تعمل بشكل صحيح وإصلاحها أي مشكلة؛ ونحن نقترح أن وجود احتياطي واحد إعداد جاهزة (مضخة أخرى مع المحاقن التي شنت على والانتهاء من أنابيب يملأ مع حلول العمل) عند إجراء التجربة، يسبر فضلا عن عدد كاف من الاستعداد لاستخدام ميكرودياليسيس لتغيير تقسيم منها؛ (ثانيا) عند نقل الحيوانات في قفص عمل EEG-ميكرودياليسيس أنه من المفيد أن يكون شخص ثاني مساعدة والبدء في عمليات الشراء؛ (ثالثا) أن تأكد من أن العمود وأوتوسامبلير الذي تم التوصل إليه في درجات الحرارة المناسبة قبل اللوني؛ وبالإضافة إلى ذلك، استخدام المعايير وبناء قطع معايرة قبل أي عينات دياليساتي يتم حقنها في العمود الكروماتوغرافي؛ (v) كلما دعت الحاجة، في محاولة لوضع الكروماتوغرافي أو طريقة أخرى تحليلية لقياس التحاليل متعددة في نفس الوقت.
آثار التعديلات في كبيرة في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي (بما في ذلك الصرع) وكان هناك اهتمام كبير العقود التحديد الكمي لهذه التغييرات أثناء التقدم من صحي للنمط الظاهري مريضة. اليوم، سوى عدد قليل من تقنيات تسمح بقياس التغيرات في مستويات الناقل العصبي على مدى أيام أو شهور. ميكرودياليسيس واحدة من هذه التقنيات. في عدد كبير من الحالات، مثل الموضحة هنا، هو أداؤها في الانتقال بحرية الحيوانات ومقرونا بفحوصات تحليلية غير متصل التقليدية مثل كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) أو التفريد الشعرية (CE)، الذي يصل إلى 5-30 مين الأزمنة31،56. ومن الواضح أن هذه الفواصل الزمنية أخذ العينات لا تعكس العصبي السريع الديناميات على مقربة من سينابسيس، ولكن قد تكون ملائمة لبعض المدى الطويل ميكرودياليسيس التطبيقات (مثلالمرض أو الإنمائية أو دراسات تأثير المخدرات) التي تتطلب اقتران الكيميائية العصبية والتخطيط الدماغي والبيانات السلوكية. غير أن دراسات أخرى هي المعنية في المقام الأول مع قياس الوقت الحقيقي أو قريبة من التغييرات في الوقت الحقيقي في ناقل عصبي الإفراج عنهم. لهذه، يجب أن يكون الأسلوب ميكرودياليسيس المكرر زيادة سرعة أخذ العينات (وبالتالي تقليل حجم العينة). في الواقع، غالباً ما انتقد الأسلوب الكلاسيكي ميكرودياليسيس للفقراء الزمنية (بالدقائق) وقراره المكانية (التحقيق التقليدية أكبر بكثير من المشقوق متشابك)9،،من2156، 57. بيد أنها حساسية الأسلوب التحليلي الشامل بالإضافة إلى ميكرودياليسيس ما يحدد القرار وقت ميكرودياليسيس (أي، قرارها يكون مساوياً للوقت المطلوب ليكون عينة كافية الكشف عنها بواسطة تحليلي 56من تقنية). وهكذا، عندما ميكرودياليسيس تنتج كميات صغيرة من عينات، يجب زيادة حساسية تقنيات القياس الكمي. وحتى الآن، بعد هذه التحسينات في الأزمنة تقنية ميكرودياليسيس 3 خطوط مختلفة. واحدة من هذه هي ممثلة بتصغير أعمدة و/أو الكشف عن خلايا للأساليب الكلاسيكية [هبلك]؛ وهذه تسمى أوهبلك (الترا-performant [هبلك]) تقنيات وتسمح بتحقيق 1-10 دقيقة وقت القرار58،،من5960. نهج آخر أن زوجين من كلاسيكية [هبلك] إلى الطيف الكتلي (مللي ثانية) أو جنبا إلى جنب (MS/MS) لتحليل متعدد لأجهزة الإرسال العصبية في الدماغ دياليساتيس. مجتمعة [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد فحوصات حساسية ممتازة وتصل إلى حول 1-5 دقائق وقت القرار56،61،،من6263. يوجد خط ثالث لتحسين في إدخال تعديلات على التفريد الشعرية (CE). إذا حملت CE يستخدم الليزر الأسفار الكشف (م-ليفد)، وهي تمكن تحديد تركيزات سوبميكرومولار لمختلف أجهزة الإرسال العصبية في الكسور نانولتر الحصول على كل 5 دقائق55،64،65 أو حتى في فترات s 1056. ميزة واضحة الذي ينبثق من أوهبلكس أو النهج التحليلي CEs المتقدمة هو أنه قد فعل أخذ العينات في الانتقال بحرية الحيوانات، وعدم المساس بالتجارب التي يجب لاحظ السلوك العفوي وتحليلها. من ناحية أخرى، هناك طرق تسمح بأخذ عينات dialysate الدماغ في ميلي ثانية حتى مئات الأزمنة (مثلاً إنزيم مفاعل استناداً إلى فحوصات على الخط أو جمع قطرات من دياليساتي بالإضافة إلى تقنيات MS)، ولكن هذه عادة ما تستخدم في الحيوانات منضبطة66 أو تحت التخدير العام67،،من6869، لا يسمح للزوجين ميكرودياليسيس مع الدراسات السلوكية.
عند النظر في ضعف ثاني أهم ميكرودياليسيس، أي القرار المكانية منخفضة نسبيا بسبب أبعاد غشاء (غالباً حوالي 0.5 ملم في القطر وطويلة 1-4 مم)، وبديل يمكن ميكروبروبيس وضع مع انخفاض تدفق دفع سحب العينات. هذه المسابر تتكون من اثنين والسليكا الشعيرات الدموية (من 20 ميكرومتر معرف و OD 200 ميكرومتر) تنصهر جنبا بجنب ومغمد بأنابيب البوليمر. أثناء التجربة، هي perfused هذه الشعيرات الدموية في معدلات تدفق منخفضة جداً، حيث أن السائل هو انسحب شعري واحد، ويتم استرداد عينة من جهة أخرى بنفس معدل التدفق. لأخذ عينات يحدث فقط في طرف المسبار، القرار المكانية أكبر من المسبار ميكرودياليسيس70. الاحتمال الآخر للتبديل من المسابر المنمنمة إلى صفائف ميكروليكترودي (أجهزة استشعار العوامل البيولوجية) للتقييم العصبي في الوقت الحقيقي. التقنيات الكهروكيميائية المختلفة (تعتمد أساسا على فولتاميتري أو أمبيروميتري) تسمح بأخذ العينات أكثر قريبة جداً من المشبك (مقياس ميكرون) وفي أقل من 1 ثانية31،،من7071. هذه الأجهزة يمكن قياس تركيز تحليلها متعددة من مناطق متعددة في الدماغ. ومع ذلك، كما أنها تتطلب بعض التحسينات، على سبيل المثال لتجنب القطع الأثرية وتدهور سريع نسبيا.
في ضوء أحدث التطورات في فيفو رصد الكيميائية العصبية، يبدو من المرجح أنه سيتم الجمع بين أساليب أخذ العينات مختلفة الإرسال في جهاز استشعار واحد في المستقبل القريب. بدأ بالفعل العمل بشأن تحقيقات ميكروفابريكاتيد أخذ العينات، ونحن نعتقد أن إحراز مزيد من التقدم في تكنولوجيات ميكروفابريكيشن جنبا إلى جنب مع التقدم التحليلية سيزيد من تسهيل في فيفو التحقيق الرصد الكيميائية العصبية. في هذا الوقت، ومع ذلك، يظل ميكرودياليسيس التقليدية التي ترتبط بالتخطيط الدماغي وسيلة صالحة للعديد من تطبيقات علم الأعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر Anna بيناشي وباولو رونكون وايليونورا بالما لمساهمتها في المخطوطات المنشورة في الأسبقية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml - tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml - diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
References
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
- Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
- Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
- Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
- Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
- Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
- Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
- Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
- Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
- Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
- Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
- Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
- Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
- Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
- Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
- Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
- Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
- Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
- Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
- Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
- Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
- Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
- Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
- Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
- Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
- Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
- Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
- Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
- Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
- Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
- Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
- Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
- Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
- Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
- Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
- Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
- Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
- Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
- Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
- Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
- Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
- Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
- Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
- Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
- Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
- Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
- Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
- Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
- Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
- Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
- Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
- Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).
