Summary
Tilgang til næringsstoffer, bakterieflora metabolitter og medisiner til sirkulasjon styres av gut-blod barrieren (GBB). Vi beskriver en direkte metode for å måle på GBB permeabilitet i vivo, som, i motsetning til vanlige indirekte metoder, nesten ikke påvirkes av leveren og nyre funksjoner.
Abstract
Gut-blod barrieren (GBB) styrer tidens næringsstoffer, bakteriell metabolitter og narkotika fra intestinal lumen i blodet. GBB integritet er forstyrret i mage, hjerte og metabolske sykdommer, som kan føre til enklere tilgang av biologisk aktive forbindelser, for eksempel tarmen bakterielle metabolitter, i blodet. Dermed kan permeabilitet av GBB være en markør for både tarm og extraintestinal. Videre kan økte utbredelsen av bakteriell metabolitter påvirke driften av hele organismen.
Brukte metodene for å studere GBB permeabilitet er utført ex vivo. Nøyaktigheten av disse metodene er begrenset, fordi funksjon av GBB avhenger av intestinal blodstrøm. På den annen side, brukte i vivo metoder kan være partisk av leveren og nyre ytelse, som disse metodene er basert på vurdering av urin eller / og perifert blodkonsentrasjoner av eksogene markører. Her presenterer vi en direkte måling av GBB permeabilitet i rotter ved hjelp av en i vivo metode basert på portalen blod prøvetaking, som bevarer intestinal blodstrøm og nesten ikke påvirkes av funksjonen lever og nyre.
Polyuretan katetre settes inn i portalen blodåre og mindreverdig vena cava like over hepatisk vener samløpet. Blod samples ved baseline og etter administrasjon av en valgt markør i en ønsket del av fordøyelsessystemet. Her presenterer vi flere programmer av metoden inkludert (1) evaluering av kolon permeabilitet til TMA, tarmen bakterielle metabolitten, (2) vurdering leveren klaring av TMA og (3) evaluering av en gut-portal blod-lever-perifere blod sti av tarmen bakterier-avledet kort-kjeden fettsyrer. Videre kan protokollen også bli brukt for intestinal absorpsjon og leveren metabolismen av narkotika eller målinger av portalen blodtrykk.
Introduction
Gut-blod barrieren (GBB), også kjent som intestinal barriere, er et komplekst flerlags system som skiller gut lumen fra blodet for å begrense passering av skadelige forbindelser samtidig som absorpsjon av næringsstoffer1. Det består av tre hoveddeler lag: Slim laget, epitel og lamina propria.
Mange faktorer kan påvirke GBB integritet og funksjon2. Det har vist at GBB er forstyrret i både mage og extraintestinal sykdommer, inkludert hjerte og metabolske sykdommer3, som kan føre til en økt tidens tarmen bakterielle metabolitter til blodet4. En økt penetrasjon av tarmen bakterielle metabolitter kan påvirke driften av hele organismen. Nyere studier viser for eksempel en betydelig innvirkning på bakteriell metabolitter, som indoler, H2S, kort-kjeden fettsyrer (SCFA) og trimethylamine N-oksid, på sirkulasjonssystemet funksjoner5,6,7 ,8,9. Til slutt, har det blitt foreslått at en økt GBB permeabilitet kan tjene som en markør av hjerte og metabolske sykdommer som er forbundet med morfologiske og funksjonelle endringer i tarmen10. Derfor kan sporing gut-portal blod-lever-systemisk blodstrøm veien av bakteriell metabolitter være av interesse for både grunnleggende og klinisk fag.
Vanligvis benyttet eksperimentelle metoder for vurdering av GBB permeabilitet er utført i vitro benytter resected intestinal segmenter, fragmenter av mucosa, eller kunstig membraner11,12. Nøyaktigheten av disse metodene er kompromittert av det faktum at riktig funksjon av GBB krever konstant intestinal blodstrøm. På den annen side, er metodene tilgjengelig i vivo basert på evalueringen av urin eller perifert blodkonsentrasjoner av eksogene markører13. Men perifert blod- og urinprøver konsentrasjon av eksogene forbindelser er påvirket av nyrefunksjon, dvs glomerular filtrering rate og rørformede utskillelse samt leveren metabolisme, dvs. første pass metabolisme. Begge parameterne kan variere betydelig mellom studien fag uavhengig av funksjonen GBB.
Dette dokumentet beskriver en direkte måling av GBB permeabilitet i rotter ved hjelp av portalen blodprøve. Denne i vivo metoden bevarer intestinal blodstrømmen og er nesten ikke påvirket av lever og nyre funksjon. Beskrevet tilnærmingen brukes ikke vanligvis, muligens på grunn av metodologiske problemer. Vi beskriver i detalj catheterization portalen blodåre og mindreverdig vena cava like over hepatic blodåre samløpet. Blod prøvetaking fra portalen blodåre og mindreverdig vena cava tillater evaluering av GBB permeabilitet og lever rydding og sporing av gut-portal blod-lever-systemisk blodstrøm sti molekyler steder som tarmen bakterielle metabolitter eller medisiner. Vi presenterer også flere programmer av metoden som ble testet i vårt laboratorium. Disse omfatter evaluering av kolon permeabilitet til TMA, tarmen bakterielle metabolitten, evaluering av leveren klarering av TMA og evaluering av en gut-portal blod-lever-systemisk blodstrøm sti av SCFA.
For å evaluere gut-blod barrieren permeabilitet, følgende protokollen skal følges, i rekkefølge: 1 (innsetting av linjen for intraintestinal administrasjoner), 3 (portalen blodåre catheterization), 4 (portalen blodåre blod prøvetaking ), 6 (administrasjon av en gut permeabilitet markør), 4.
For å evaluere leveren minerydding og en gut-portal blod-lever-systemisk blodstrøm sti, følgende protokollen skal følges, i rekkefølge: 1 (innsetting av linjen for intraintestinal administrasjoner), 2 (underlegen vena cava catheterization), 3 (portalen blodåre catheterization), 4 (portalen blodåre blod prøvetaking), 5 (underlegen vena cava blod prøvetaking), 6 (administrasjon av en gut permeabilitet markør), 4, 5, 7 ( beregning av leveren klaring).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble utført på Wistar Kyoto hannrotter i henhold til direktivet 2010/63 EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål og ble godkjent av de lokale bioetiske komiteen i Warszawa.
1. innsetting av linjen for Intraintestinal administrasjon
Merk: Her foreslår vi intracolonic administrasjonen av en markør ved hjelp av et kateter. Det kan endres etter peroral administrering eller gavage på ulike nivåer av fordøyelseskanalen f.eks mage eller tolvfingertarmen. Husk å bruke engangs kirurgisk klær, inkludert kirurgiske kappe, hette og hansker, og sikre for å følge forholdsregler knyttet til skarpe verktøy som brukes i kirurgi (nåler, etc.) under prosedyrer 1-6.
- Rask dyr over natten før prosedyren. Utfør alle prosedyrer under narkose, dvs. oppnås ved injeksjon av uretan 1,5 g/kg bw IP vurdere riktig anesthetization ved mangel på palpebral og hornhinnen reflekser og tå-klype og hale-klype.
- Bruke en pediatric Foley kateter (10F eller 8F) som en colonic kateter. Merk kateter for å angi delen som skal settes inn i tykktarmen (ca 8 cm).
- Sjekk anal området og avføring innholdet i endetarmen før du setter kateter inn i tykktarmen. Hvis krakk, tømme endetarmen ved masserer endetarmen området.
- Sette et smøremiddel (f.eks glyserin eller petrolatum) langs kateter. Fukt anus og omegn med smøremiddel.
- Sett inn kateter med en guide ledningen ca 8 cm gjennom eksterne anal sphincter. Gjør langsom forover-bakover og sirkulære bevegelser.
Merk: Hold på å sjekke plasseringen av kateter av mave-palpere stund setter inn kateter.
2. dårligere Vena Cava Catheterization
- Barbere pels i lysken. Vekselvis rense huden med alkohol og povidon jod 3 ganger og dekker lysken med kirurgisk gardiner.
- Prøv å føle pulsen på femoral arterien og kuttet huden langs for lengden av ca 2.0 cm i der pulsen er håndgripelig.
- Dissekere fascia og musklene å visualisere nevrovaskulære bunten.
- Dissekere femur venen fra nevrovaskulære bunten: første nerver, deretter femoral arterien, og deretter venen.
Merk: Vær forsiktig under Disseksjon av nevrovaskulære bunten, siden liten grener av femur venen kan lett bli skadet, produsere blødning. - Sett to ligaturer på femur venen. Kan ikke knytte knop ennå. Fange endene av den proksimale ligaturen med en nål holder.
- Trekk forsiktig ligatur ender med innehaveren oppover for å lukke den proksimale delen av venen. Vent til venen fylles med blod og knytte distale knute.
- Lag et lite innsnitt (ca 1 mm) venen mellom knute og proksimale ligatur, bruker Mikrokirurgiske saks. Sett inn kateter med pinsett eller nålen med buet slutten.
Merk: Punktering venen og bruke bended spissen av nålen som en guide for kateter. Løsne den proksimale ligaturen stund setter inn kateter. Sett inn kateter 6 7.0 cm. - Sikre kateter i femur stemning med to enkelt kirurgisk knop. Knytte den proksimale ligaturen også.
- Sjekk patency av kateter ved forsøk på å trekke blod med en sprøyte. Skyll kateter med 0,3 mL heparinized saltkildene (100 enheter/mL).
- Lukk kirurgisk såret med to lag enkelt masker.
3. portalen blodåre Catheterization
Figur 1 : Portal kateter. Portalen kateter består av en nål OD: 0,9 mm med en lengde på ca 25.0 mm [A], en fleksibel polyuretan kateter OD: 0.025", lengde om 100,0 mm [B], en fleksibel polyetylen spissen av kateter OD: 0.040", ca 15,0 mm lang [C], en plug [D]. , og en ligatur 3/0 med en lengde på 100,0 mm [E]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Forberede den portalen kateter ifølge figur 1.
- Sett inn det kutte slutten av p (OD: 9 mm) inn i polyuretan kateter OD: 0.025".
- Tie ligatur 3/0 i krysset av p og kateter.
Merk: Kontroller at den lengre del av ligatur er minst 6 cm lang. - Sett enden av kateter OD: 0.025" i polyetylen kateter OD: 0.040".
- Lukk kateter med en metall- eller plastplate plugg.
- Midtlinjen laparotomy
- Barbere pels i magen, vekselvis rense huden med alkohol og povidon jod 3 ganger og dekker området med kirurgisk gardiner.
- Kuttet huden langs fra xiphoid av sternum til navlen.
- Kuttet musklene i bukveggen langs hvite.
- Utvid kuttet rostrally i Y figuren slik at xiphoid brusken er mellom to kutt.
- Portalen blodåre disseksjon
- Fukte de kirurgiske Pensle med saltvann.
- Exteriorize cecum, stigende og transverse kolon og tynntarmen løkken. Sette tarmen til venstre å avsløre roten av mesentery.
Merk: Dekk tarmen med gasbind fuktet med en fysiologiske saltvann å beskytte tarmen tørker. - For å avsløre portalen blodåre, Flytt forsiktig hepatic lobes til sidene eller oppover mot membranen med fuktet vattpinner.
- Lokalisere delen i portalen blodåre som ikke er dekket med mesentery (i den hepatisk hilum, cirka 5 mm lang) og passerer ligatur 3/0 (15 cm lang) under portalen blodåre.
Merk: For å beskytte vev skade mens plassere ligatur, fukt ligatur med en fysiologisk saltløsning. - Klemme endene av ligatur med tang og trekk det forsiktig å stabilisere fartøyet.
- Innsetting og stabilisering av kateter
- Gå lenger del av portalen kateter ligatur under delen gratis i portalen blodåre, og trekk den slik at kateter ligger bare portalen blodåre.
- Sett inn nålen i øvre hvem venen 3 mm under krysset øvre hvem stemning og portalen blodåre. Holde nålen i 30° vinkel, og etter inn i venen, redusere vinkelen og fremme nålen nesten horisontalt, parallelt med portalen blodåre.
Merk: Sette inn nålen for lang ca 6-7 mm. Stabiliserende ligatur burde forsiktig stramme portalen blodåre stund setter inn kateter. - Bruke 1-2 dråper vev lim på stedet der nålen settes. Fjerne av vattpinner som dekker leveren.
- Sett tarmen tilbake i bukhulen.
- Fukt tarmen med en varmet opp saltvann og dekke det med fuktet sterilt gasbind.
- Sjekk patency av kateter og skyll kateter med 0,3 mL heparinized saltkildene (100 enheter/mL).
Merk: Venøst blod spontant backflows i kateter.
- Slutten av operasjonen
- Etter 5 minutter, sjekk fargen på tarmen og peristaltiske bevegelser, sørg for at riktig hvem blodstrømmen opprettholdes.
- Lukk bukhulen med 3 masker: vegg peritoneum med det indre laget av bukveggen musklene - en kontinuerlig, absorberbare Sutur; gjenværende muskler av bukveggen - en kontinuerlig, absorberbare Sutur; huden og subkutant vev - enkelt, ikke-absorberbare suturer.
Merk: Exteriorize den distale del av kateter rundt navlen.
4. portalen blodåre blod prøvetaking
- Eksempel portalen blodåre blod til tider i henhold til bestemte testing protokollen brukes; se tabell 1.
| Kort-protokollen | Lang-protokollen |
| t0 -planlagte (før intracolonic administrasjon) | t0 -planlagte (før intracolonic administrasjon) |
| t1 -5 min etter intracolonic administrasjon | t1 -30 min etter intracolonic administrasjon |
| t2 -30 min etter intracolonic administrasjon | t2 -60 minutter etter intracolonic administrasjon |
Tabell 1: Portal blod Prøvetaking protokoller for gut permeabilitet vurdering.
Merk: Tiden mellom etterfølgende blodprøve avhenger i hovedsak av biotilgjengeligheten av testet stoffer og stedet for administrasjon (tykktarm, mage, osv.).
- Åpne portalen kateter pluggen og la blodet flyte fritt.
- Bruk sprøyten (vol. 2 mL) og stump p OD: 0,9 mm. samle mer enn 0,7 mL blod.
- Skyll kateter med 0,3 mL heparinized saltoppløsning (100 enheter/mL) og lukke kateter pluggen.
5. dårligere Vena Cava blod prøvetaking
- Eksempel dårligere vena cava blod til tider i henhold til bestemte testing protokollen brukes; se tabell 2.
| Portalen blodåre | Dårligere vena cava |
| t0 -planlagte (før intracolonic administrasjon) | t0 -planlagte (før intracolonic administrasjon) |
| t1 -30 min etter intracolonic administrasjon | t1 -30 min etter intracolonic administrasjon |
Tabell 2: Protokoll blod prøvetaking for leveren klaring måling og sporing gut-portal blod-lever-systemisk blodstrøm veien.
- Åpne dårligere vena cava kateter pluggen og la blodet flyte fritt.
- Samle mer enn 0,7 mL blod bruker sprøyter (vol. 2 mL) og brutt p OD: 0,9 mm.
- Skyll kateter med 0,2-0,3 mL heparinized saltvann (100 enheter/mL) og lukke kateter pluggen.
6. administrasjon av en Gut permeabilitet markør
- Fjern guidekabelen og økning av colonic kateter ballongen, med tilstrekkelig volum sterilt vann (vanligvis 1 mL men sjekk faktiske ballong størrelse før innsetting).
Merk: Ballong diameter bør ikke overstige 1 cm. - Plass rotte hodet ned (helling 15%) å minimere risikoen for utstrømming av administrerte løsningen fra kolon.
- Sakte administrere testet stoffet (f.eks trimethylamine, 100 mg/kg bw) bruker en drenering-port i colonic kateter.
Merk: Ikke overstige mengden 0,75 mL av administrert løsning og fôring hastigheten på 0,5 mL/min å hindre utstrømming av administrerte løsningen fra anus. - Etter 10 min deflate kateter ballongen.
- Eksempel blod fra den underlegne vena cava og portalen blodåre i henhold til bestemte testing protokollen brukes; se tabell 1 og tabell 2.
- Euthanize dyr via godkjent metode.
7. beregning av leveren klaring
- Express leveren fortolling, forstås som hepatic utvinning, forskjellen mellom portalen blod konsentrasjonen og mindreverdig vena cava blodet konsentrasjon eller forholdet mellom dårligere vena cava til portalen blod konsentrasjonen, (1 - (underlegen vena cava konsentrasjon / portalen blodåre konsentrasjon)).
8. evaluering av Test stoff konsentrasjon n blodprøvene
- Avhengig av testen stoff og testmetodikk, underlagt prøven til riktig laboratorium prosedyrer (sentrifugering, osv.). I de foreslåtte protokollene evaluere vi TMA/TMAO og SCFA konsentrasjon bruke flytende kromatografi kombinert med trippel-quadrupole massespektrometri. Du Finn en detaljert beskrivelse av metoden i supplerende materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har vellykket målt GBB permeabilitet og lever rydding av TMA i rotter. Vi har vist at Hypertensiv rotter har en økt kolon permeabilitet til TMA i forhold til normotensive rotter (figur 2)4. I en annen studie fant vi at høyt inntak av salt ikke påvirker GBB permeabilitet og lever rydding av TMA (Figur 3)14.
Måle konsentrasjonen av SCFA avføring, portalen blod og perifert blod, sporet vi banen av molekyler fra tarmen til perifert blod. Eksemplarisk resultatene for disse eksperimentene er presentert i tabell 3.
Figur 2 : Hypertensjon-assosiert endringer i gut-blod barrieren permeabilitet. Intracolonic administrasjonen av TMA produsert en betydelig økning i portalen blod TMA i hver gruppe (n = 12 for hver gruppe). Økningen i portalen blod TMA i gruppen Hypertensiv (SHR) var betydelig høyere enn i normotensive (WKY) gruppe. Vi brukte lang protokollen bestående av blod prøvetaking 30 minutter og 60 minutter etter TMA administrasjon (IC TMA). Verdiene er betyr, + SE, *p < 0,05 vs grunnlinjen, #p < 0,05 WKY vs SHR. Dette tallet har blitt endret fra Jaworska et al. 4 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Gut-blod barriere permeabilitet og lever klaring etter høyt inntak av salt. (A) Intracolonic administrasjon av TMA produsert en betydelig økning i portalen blod TMA. Størrelsen på økningen var mellom gruppene (n = 7 for hver gruppe). Vi brukte en forenklet protokoll, tar blodprøver på planlagte (0) og 15 minutter etter administrasjon av TMA (IC TMA). (B) TMA leveren klaring var likt mellom gruppene ved baseline og 15 min etter intracolonic administrasjon av TMA. Verdiene er betyr, + SE. *p < 0,05 vs grunnlinjen. Dette tallet har blitt endret fra Bielinska et al. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| SCFA | Krakk konsentrasjon (µM) | Portalen blodet konsentrasjon (µM) | Perifert blod konsentrasjonen (µM) |
| AA - eddiksyre (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155.34 | 149.89 ± 31.74 |
| IPA - propionsyre syre (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55.50 | 5.36 ± 3,25 |
| IBA-isobutyric syre (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4.51 ± 1.60 | 1.14 ± 1,16 |
| BA - butyric acid (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6.43 ± 4.18 |
| 2MeB-2-methylbutyric acid (C5) | 80.90 ± 59.86 | 2,02 ± 0,88 | 1.14 ± 1.42 |
| IVA-isovaleric syre (C5) | 109.10 ± 56.05 | 2,59 ± 1.07 | 0,90 ± 1,22 |
| VA - valeric syre (C5) | 281.9 ± 158.20 | 8.55 ± 3.56 | 0,72 ± 1.02 |
| ICA-isocaproic syre / 4-methylvaleric syre (C6) | 5.9 ± 2,95 | 0,61 ± 0,15 | 1.76 ± 0.87 |
| CA - caproic syre (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11,19 ± 4.94 | 1,12 ± 0.93 |
Tabell 3: SCFA konsentrasjon i avføring og portal blod perifert blod (n = 7).
| Teste stoff | Mulig |
| Bakteriell metabolitter: trimethylamine (TMA), korte kjeden fettsyrer (SCFA), hydrogensulfid, etc. |
GBB permeabilitet studier Spore en gut-portal blod-lever-systemisk blodstrøm sti Hepatic klaring studier |
| Klassisk permeabilitet markører: FITC-dekstran, polysakkarider, PEG, etc. |
GBB permeabilitet studier |
| Narkotika | absorpsjon og lever klaring studier |
Tabell 4: Eksemplarisk test stoffer med mulige anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne direkte, i vivometoden av måler GBB permeabilitet opprettholder closetophysiological forhold i tarmsystemet (bevarer intestinal blodstrøm), og er nesten ikke påvirket av lever og nyre funksjon.
Det kritiske trinnet av denne teknikken er den portalen kateter innsetting. Dette må gjøres forsiktig og besluttsomt samtidig. En mild, kort blødning kan oppstå fra det riktig utført punktering av portalen blodåre; men stopper det når nålen settes inn i skipet. Vedvarende blødning angir at portalen blodåre er perforert. For å lette kateter innsetting, skal portalen blodåre være godt eksponert. Etter exteriorizing tarmen, når hvem roten er godt eksponert, øvre hvem venen skal vises (hvem stemning trer cranially i portalen blodåre). Portalen blodåre er vanligvis dekket av hepatic lobes, som må flyttes til sidene. Riktig stabilisering av portalen kateter er også avgjørende for en vellykket prosedyre, siden den kateter bevegelse kan produsere portalen blodåre brudd og blødninger, spesielt i lengre eksperimenter. Ytterligere stabilisering av kateter kan oppnås ved å feste kateter til mesentery ved stikkende den til en mesentery med vev lim eller bruke to enkelt masker (tråden 6/0). Etter stengetid bukhulen for å sikre plasseringen av kateter, kan en veske-streng Sutur brukes på kateter.
Det er flere mindre problemer som kan oppstå under eksperimentet. Etter catheterization i femur venen, hvis det venøst blodet ikke ikke tilbakestrømming i kateter, Prøv følgende løsninger: tømme kateter med heparinized saltvann, forsiktig trekke kateter 1-2 mm fra blodåre, fjerne kirurgisk knuter og knytte en ny en, trekke kateter ut og sette inn eller erstatte med en ny kateter. Husk å bekrefte riktig plassering av kateter etter eksperimentet. Kateter skal settes i 6-7 cm, avhengig av dyret, å plassere proksimale kateter i de underlegne vena cava like over hepatic blodåre samløpet. Når det gjelder kolon catheterization, hvis du har problemer med å fremme kateter du kan injisere 0,3 til 0.5 mL av saltvann eller la kateter i tykktarmen for 5-10 minutter og prøv igjen. Ikke bruk makt stund setter inn et kateter for å unngå perforering av tarmen.
I våre studier, har vi brukt en gut bakterier-avledet molekyl, trimethylamine (TMA), som en markør av kolon GBB permeabilitet, som TMA er produsert av colonic bakterier. Men mange andre stoffer, herunder klassiske permeabilitet indikatorer som FITC-dekstran eller sukker, kan brukes også (se Tabell 4). Når du forbereder en løsning av testen stoffet, ta hensyn til sin irriterende effekt på tarmen og velg riktig konsentrasjonen av stoffet. Ytterligere laboratorium prosedyrer for blodprøvene må justeres til den valgte markøren.
I vår protokollen foreslår vi intracolonic administrasjonen av en markør; men kan det endres etter peroral administrering eller gavage på ulike nivåer av fordøyelseskanalen. Hastighet på peristalsis og mulig interaksjon med enzymer og magesyre bør tas i betraktning under administrere en markøren i øvre deler av gastrointestinaltraktus f.eks mage eller tolvfingertarmen. Følgelig tid av blod sampling etter administrasjon av merketråd må justeres.
Det er flere begrensninger på presentert metoden, inkludert bivirkninger av anestesi og faste over natten, som kan både påvirke GBB funksjon. Det bør tas hensyn som prosedyren er terminal og innebærer blod prøvetaking under ikke fullt fysiologiske forhold. Men som nevnt før, har fortsatt mange fordeler over andre eksperimentelle metoder vurdere GBB permeabilitet, utført spesielt i vitro11. For eksempel måler en Ussing kammer konduktans og partikkel fluks gjennom tarmen epitelceller. Den største svakheten av denne teknikken ligger i sin overdreven forenkling. Det er vanskelig å beskrive det komplekse fysiologiske systemet intestinal mucosa med et lite antall mål på epitelcellelaget alene. Noen forskere bruker hele-tykkelse tarmen for Ussing kammeret studier, men denne fremgangsmåten er ledsaget av flere metodologiske komplikasjoner15. Videre er at metoden svekket av en begrenset levedyktigheten til vev isolert fra organismen. Noen i vitro metoder brukt i farmakokinetiske studier bruke kunstig membraner som modell av intestinal barriere12. Men reflekterer disse metodene, på samme måte som Ussing kammeret, ikke kompleksiteten av GBB struktur og funksjoner.
Det finnes også i vivo permeabilitet analyser tilgjengelig i eksperimentelle og kliniske studier. De er hovedsakelig basert på urin eller perifert blod prøvetaking etter muntlig eller colonic administrasjon av ulike markører13. Brukte sukker testen innebærer muntlig inntak av mono- og oligosaccharides, som ikke er metaboliseres i pattedyr organismen, f.eks mannitol og Laktulose. Metoden er ikke-invasiv og kan brukes i både eksperimentelle og klinisk bruk16,17; men er resultatene berørt av første-pass metabolisme og nyre leverfunksjon, som kan variere betydelig mellom studien fag. I motsetning til de ovennevnte indirekte metodene tillater samle blod fra portalen blodåre direkte evaluering av GBB permeabilitet12. Denne metoden er ikke avhengig av lever og nyre funksjon og bevarer nesten fysiologiske forhold i tarmen som er en viktig fordel over ex vivo eller i vitro metoder.
Teknikkene som beskrives i denne artikkelen også tillate en relativt nøyaktig leveren klaring evaluering, som blod samles fra portalen blodåre og mindreverdig vena cava like over hepatic blodåre samløpet. Hepatic utvinning representant resultatene presenteres i Figur 3 (for TMA) og tabell 3 (for SCFA). Våre data tyder på at tre viktigste SCFA, acetate, propionate og butyrate, er preget av ulike hepatic fortolling, som støttes av tidligere studier, der Bloemen et al. vist at intestinal utgivelsen av butyrate og propionate, men ikke acetate, er nesten equaled av hepatic opptak18. Derfor er presentert protokollen egnet for intestinal absorpsjon og leveren metabolismen av narkotika, som kan brukes i farmakokinetiske studier.
Teknikkene kan også tilpasses andre eksperimentelle formål. Catheterization av portalen blodåre kan brukes å måle portalen blodtrykk eller administrasjon av narkotika direkte til portalen vene, for å studere nedsatt sirkulasjon. For eksempel i våre tidligere arbeid administrert vi hydrogensulfid givere til portalen blodåre å vurdere sin innflytelse på nedsatt sirkulasjon og portal press19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet er støttet av departementet for vitenskap og høyere utdanning Polens, Diamond gir ingen: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
- Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).
- Keita, A. V., Soderholm, J. D. The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).
- Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).
- Jaworska, K., et al. Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite. PloS one. 12 (12), e0189310 (2017).
- Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).
- Tomasova, L., et al. Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).
- Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).
- Ufnal, M., et al. Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats. The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).
- Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats. Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).
- Ufnal, M., Pham, K. The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases? Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).
- Le Ferrec, E., et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).
- Bohets, H., et al. Strategies for absorption screening in drug discovery and development. Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).
- Grootjans, J., et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).
- Bielinska, K., et al. High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats. Nutrition. 54, 33-39 (2018).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Denno, D. M., et al. Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).
- Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins. Gut. 46 (4), 515-521 (2000).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).
- Huc, T., et al. Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats. Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).
