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Medicine

창 자-혈액 장벽 및 간 대사 Microbiota 제품의 평가 위한 Vivo에서 방법

Published: October 20, 2018 doi: 10.3791/58456

Summary

영양소, microbiota 대사와 순환에 의약품의 액세스 창 자-혈액 장벽 (GBB)에 의해 제어 됩니다. 우리는 GBB 침투성에서 vivo에서, 일반적으로 사용 되는 간접 방법, 달리는 거의 영향을 받지 않습니다 간 및 신장 기능을 측정 하기 위한 직접적인 방법을 설명 합니다.

Abstract

창 자-혈액 장벽 (GBB) 혈 류 장 루멘에서 영양분, 세균 대사 산물과 약물의 흐름을 제어합니다. GBB 무결성 혈 류 창 자 세균 대사 산물 등 생물학적 활성 화합물의 쉽게 액세스 될 수 있습니다 위, 심혈 관 및 대사 질환에 교란 된다. 따라서,는 GBB의 침투성 장 및 extraintestinal 질병의 마커를 있을 수 있습니다. 또한, 세균 대사 산물의 증가 침투 수 있습니다 전체 유기 체의 기능에 영향을.

GBB 침투성 공부에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법 수행 비보 전있습니다. 이러한 방법의 정확성은 창 자 혈액의 흐름에 따라는 GBB의 기능 때문에 제한. 다른 한편으로, 일반적으로 사용 되 비보에 방법 편 파 수 있습니다 간 및 신장 성능, 그 메서드는 소변의 평가 기반으로 또는 / 및 exogenous 마커의 주변 혈액 농도. 여기, 우리 장 혈액 흐름을 유지 하 고 간, 신장 기능 영향을 거의 받지 않습니다 메서드를 사용 하는 비보에 포털 혈액 샘플링에 따라 쥐에서 GBB 침투성의 직접 측정을 제시.

폴리우레탄 카 포털 정 맥에 삽입 하 고는 키 모 보다 열 등 한 베 나 정 맥 혈관 합류. 기준선에 및 위장의 원하는 부분에 선택한 마커의 관리 후 혈액 샘플링 됩니다. 여기, 선물이 TMA, 창 자 세균 대사 산물, TMA의 간 정리의 평가 (2) 및 (3) 평가의 직감 직감 포털 혈액-간-주변 혈액 통로의 콜론 침투성의 평가 (1)를 포함 하는 방법의 몇 가지 응용 프로그램 박테리아에서 파생 된 짧은 사슬 지방산입니다. 또한, 프로토콜 장내 흡수와 약물의 간 대사를 추적 또는 포털 혈압의 측정을 위해 사용할 수도 있습니다.

Introduction

창 자-혈액 장벽 (GBB)로 알려진 장 배리어 영양소1의 흡수를 허용 하는 동안 유해한 화합물의 통행을 제한 하기 위하여 혈 류에서 창 자 루멘을 분리 하는 복잡 한 멀티 레이어 시스템입니다. 그것은 이루어져 있다 3 개 주요 레이어: 점액 레이어, 상피와 lamina propria.

수많은 요인 GBB 무결성 및 기능2영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 보였다 GBB 위장과 extraintestinal 질환, 심혈 관 및 대사 질환3, 혈 류4직감 세균 대사 산물의 증가 흐름으로 이어질 수 있는 포함 하 여 교란 된다. 창 자 세균 대사 산물의 증가 침투 전체 유기 체의 기능에 영향을 수 있습니다. 최근 연구 결과 순환 시스템 기능5,6,7 indoles, H2S, 짧은 사슬 지방산 (SCFA), trimethylamine N 산화물 등의 세균성 대사 산물의 상당한 영향을 표시 하는 예를 들어 ,89. 마지막으로, 그것 증가 GBB 침투성 형태학 및 기능 변경 창10과 관련 된 심혈 관 및 대사 질환의 마커로 봉사 수 있습니다 제안 되었습니다. 따라서, 세균 대사 산물의 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 추적 모두 기본 및 임상 과학에 대 한 관심이 있을 수 있습니다.

GBB 침투성의 평가 대 한 일반적으로 이용한 실험 방법 수행 있다 생체 외에서 절제 장 세그먼트, 점 막, 또는 인공 막11,12의 파편을 사용 하 여. 그 방법의 정확도 GBB의 적절 한 작동 하는 것이 지속적인 장 혈에서는 사실에 의해 손상 됩니다. 다른 한편으로, 사용할 수 있는 비보에 방법 소변의 평가 또는 외 인 마커13의 주변 혈액 농도에 근거한 다. 그러나, 간 대사 뿐만 아니라 신장 기능, 즉, 사 여과 속도 관 배설에 의해 외 인 화합물의 주변 혈액과 소변 농도 영향을, 즉, 물질 대사를 먼저 통과. 두 매개 변수는 GBB 함수 별도로 연구 주제 사이 크게 달라질 수 있습니다.

이 종이 포털 혈액 샘플링을 사용 하 여 쥐에서 GBB 침투성의 직접 측정을 설명 합니다. 이 비보에 메서드 장 혈액 흐름을 유지 하 고 간 및 신장 기능에 의해 영향을 거의 받지 않습니다. 설명한 방법은 사용 되지 않습니다 일반적으로, 아마도 일부 방법론 어려움 때문에. 우리는 문맥 및 간 정 맥 합류 보다 열 등 한 베 나 정 맥 도관 법 자세히 설명합니다. 문맥 및 열 등 한 베 나 정 맥에서 혈액 샘플링 GBB 침투성 및 간 허가의 평가 뿐만 아니라 분자의, 창 자 세균 대사 산물 또는 의약품 등의 용기-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로의 추적을 허용 한다. 우리는 또한 우리의 실험실에서 테스트 하는 방법의 몇 가지 응용 프로그램을 제시. TMA, 직감 세균 대사 산물, TMA의 간 정리의 평가 및 평가 SCFA의 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로의 콜론 침투성의 평가 포함 됩니다.

창 자-혈액 장벽 침투성을 평가 하려면 다음 프로토콜 단계 따라야 한다, 순서 대로: 1 (intraintestinal 행정에 대 한 라인의 삽입), 3 (포털 정 맥 도관 법), 4 (문맥 혈액 샘플링 ), 6 (창 자 침투성 표식 관리), 4.

간 통관 및 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 평가 하려면 다음 프로토콜 단계 따라야 한다, 순서 대로: 1 (intraintestinal 행정에 대 한 라인의 삽입), 2 (열 등 한 베 나 카바 도관 법), 3 (포털 정 맥 도관 법), 4 (문맥 혈액 샘플링), 5 (열 등 한 베 나 정 맥 혈액 샘플링), 6 (창 자 침투성 표식 관리), 4, 5, 7 ( 간 정리의 계산).

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Protocol

실험 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 관한 지침 2010/63 EU에 따르면 남성 Wistar 교토 쥐에 수행 하 고 난 바르샤바에서 로컬 Bioethical 위원회에 의해 승인 했다.

1. 삽입 Intraintestinal 관리에 대 한 라인의

참고: 여기 카 테 터를 사용 하 여 마커의 intracolonic 관리를 제안 한다. 그것은 구강 관리 또는 gavage 소화 관 위 또는 십이지의 다양 한 수준에서 수정할 수 있습니다. 일회용 수술 복, 수술 가운, 후드와 장갑를 포함 하 여 사용 하 고 절차 1-6 동안 수술 (바늘, )에 사용 된 날카로운 도구에 관련 된 안전 조치에 따라 확인을 기억 하십시오.

  1. 빠른 동물 수술 전에 하룻밤. 일반 마 취, 즉, 우 레 탄 1.5 g/kg bw i.p. 평가 적절 한 anesthetization의 주입에 의해 취득 하는 종 및 각 막 반사의 부족에 의해 고 발가락-핀치 및 꼬리 핀치 메서드에서 동안 모든 절차를 수행 합니다.
  2. 소아 폴 리 카 테 터 10 층 (8 층)를 사용 하 여 저 승 카 테 터로. 콜론 (약 8 cm)에 삽입 될 부분을 나타내기 위해 카 테 터를 표시 합니다.
  3. 콜론으로 카 테 터를 삽입 하기 전에 항문 지역 및 직장에서의 자 콘텐츠를 확인 합니다. 자 있으면 직장 영역을 마사지 하 여 항문을 빈.
  4. 카 테 터를 따라 윤활제 (예: 글 리세 린 또는 바 셀 린)를 넣어. 항문 및 윤 활 유에와 함께 그 주변을 축 축 하 게.
  5. 외부 항문 괄약근을 통해 가이드 와이어 약 8 cm와 카 테 터를 삽입 합니다. 천천히 앞으로 뒤로 및 원형 움직임을 확인 합니다.
    참고: 카 테 터를 삽입 하는 동안 복 부 촉진 하 여 카 테 터의 위치 확인에 유지 합니다.

2. 열 등 한 베 나 정 맥 도관 법

  1. 사 타 구니에 모피를 면도. 또는 3 번 알코올과 povidone 요오드와 함께 피부를 소독 하 고 외과 커튼으로 사 타 구니 영역을 커버 합니다.
  2. 대 퇴 동맥에서 맥 박을 느낄 하 고 맥 박을 만져 서 장소에 약 2.0 c m의 길이 대 한 경도 피부를 잘라 하려고 합니다.
  3. 근 막과 근육 혈관 번들 시각화를 해 부.
  4. 대 퇴 정 맥 혈관 번들에서 해 부: 첫 번째 신경, 후 대 퇴 동맥 그리고 정 맥.
    참고: 대 퇴 정 맥의 작은 가지 쉽게 손상 될 수 있습니다, 출혈 생산 이후 neurovascular 뭉치의 해 부 기간 동안 주의 해야 합니다.
  5. 대 퇴 정 맥에 2 개의 합자를 넣어. 매듭을 아직 연결 하지 않습니다. 바늘 홀더를 가진 인접 합자의 끝을 잡아.
  6. 정 맥의 근 위 부분을 위쪽으로 보유자와 합자 끝 조심 스럽게 빼냅니다. 정 맥은 혈액으로 가득 될 때까지 기다려야 하 고 원심 매듭.
  7. 작은 절 개를 만들기 (ca. 1 m m) 매듭 및 인접 합자 사이 정 맥에 microsurgical가 위를 사용 하 여. 끝이 굽은 핀셋 이나 바늘을 사용 하 여 카 테 터를 삽입 합니다.
    참고: 정 맥 펑크 고 테에 대 한 가이드로 바늘의 구부려 진 끝을 사용 합니다. 카 테 터를 삽입 하는 동안 인접 합자를 풉니다. 6-7.0 cm에 대 한 카 테 터를 삽입 합니다.
  8. 두 개의 단일 수술 매듭을 가진 대 퇴 정 맥에 카 테 터를 보호 합니다. 뿐만 아니라 인접 합자 넥타이.
  9. 주사기로 피를 뽑아서 하 여 카 테 터의 patency를 확인 하십시오. Heparinized 염 분 (100 단위/mL)의 0.3 mL와 함께 테 린스.
  10. 하나의 바늘의 2 개의 층으로 수술 상처를 닫습니다.

3. 포털 정 맥 도관 법

Figure 1
그림 1 : 포털 테. 포털 카 테 테 르 바늘 OD의 구성: 약 25.0 m m [A], 유연한 폴리우레탄 테 OD의 길이가 0.9 m m: 0.025", 길이 약 100.0 m m [B], 테 OD의 유연한 폴 리 에틸렌 팁: 0.040", 약 15.0 m m 긴 [C], 플러그 [D 그리고 길이 100.0 m m [E]의 합자 3/0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 그림 1에 따라 포털 카 테 터를 준비 합니다.
    1. 바늘의 컷 끝 (OD: 9 m m) OD 폴리우레탄 테로: 0.025".
    2. 합자 3/0 바늘 및 카 테 터의 교차점에 넥타이.
      참고: 합자의 긴 부분 길이 6 m 이상 인지 확인 합니다.
    3. 카 테 테 르 세의 끝: 0.025"폴 리 에틸렌 테 세로: 0.040".
    4. 금속 또는 플라스틱 플러그와 카 테 터를 닫습니다.
  2. 중간 개복 술
    1. 복 부에 모피를 면도, 또는 3 번, 알코올과 povidone 요오드와 함께 피부를 소독 하 고 외과 커튼으로 지역을 커버 합니다.
    2. 배꼽에는 흉 골의 칼에서 경도 피부를 잘라.
    3. 흰색 라인을 따라 복 부 벽의 근육을 잘라.
    4. xiphoid 연골 두 컷 사이 Y 형태로 rostrally 컷을 확장 합니다.
  3. 포털 정 맥 절 개
    1. 식 염 수로 수술 면봉 축
    2. 맹, 오름차순 가로 결 장 및 작은 창 자 루프 exteriorize 창 자는 mesentery의 루트를 노출 하는 왼쪽 위에.
      참고: 건조에서 내장을 보호 하기 위해 생리 식 염 수를 적신 거 즈로 내장을 커버.
    3. 포털 정 맥 노출, 양쪽 또는 위쪽 moistened 면봉으로 횡 경 막 쪽으로 신중 하 게 간장 돌출부를 이동 합니다.
    4. (간장 hilum, 길이가 약 5 mm)에서 mesentery로 처리 되지 않는 포털 정 맥의 일부를 지역화 하 고 포털 정 맥에서 합자 3/0 (15 ㎝ 길이)를 전달 합니다.
      참고: 합자를 배치 하면서 조직 손상 으로부터 보호, 축 축 하 게 생리 염 분 해결책으로 합자.
    5. 집게와 합자의 끝을 클램프 하 고 배를 안정 시키기 위해 부드럽게 그것을 조이십시오.
  4. 삽입 및 카 테 터의 안정화
    1. 포털 정 맥의 무료 부분 아래 포털 테의 합자의 긴 부분을 통과 하 고 테 포털 정 맥 바로 옆에 위치 하 고 그렇게 그것을 당겨.
    2. 위 mesenteric 정 맥 위 mesenteric 정 맥 및 포털 정 맥의 교차점 아래 3 m m로 바늘을 삽입 합니다. 30 ° 각도로 하 고, 정 맥으로 입력 한 후 바늘을 잡고, 각도 줄일 고 포털 정 맥을 동시에 거의 수평으로 바늘을 사전.
      주: 약 6-7 m m의 길이 대 한 바늘을 삽입. 안정화 합자 부드럽게 카 테 터를 삽입 하는 동안 포털 정 맥을 강화 한다.
    3. 바늘이 삽입 하는 곳에 조직 접착제의 1-2 방울을 적용 합니다. 간 커버 면봉을 제거 합니다.
    4. 복 부 구멍으로 내장을 다시 넣어.
    5. 데워 염으로 내장을 축 축 하 고 moistened 멸 균 거 즈로 그것을 커버.
    6. 카 테 터의 patency 확인 하 고 린스 heparinized 염 분 (100 단위/mL)의 0.3 mL와 테.
      참고: 정 맥 혈액 테에서 자발적으로 backflows.
  5. 수술의 결말
    1. 5 분 후, 내장 및 연동 운동 색상 검사, 적절 한 mesenteric 혈액 흐름 유지 됩니다 있는지 확인 하십시오.
    2. 3 바늘으로 복 부 캐비티를 닫습니다: 연속, 흡수 되기 쉬운 봉합 사;-복 벽 근육의 내부 층으로 복 벽 복 부 벽-연속, 흡수 되기 쉬운 봉합 사;의 나머지 근육 피부와 피하 조직-단일, 비 흡수 봉합.
      참고: 배꼽 주변 카 테 터의 원심 부분을 Exteriorize.

4. 문맥 혈액 샘플링

  1. 때때로 사용; 특정 테스트 프로토콜에 따라 샘플 포털 정 맥 혈액 표 1을 참조 하십시오.
짧은 프로토콜 긴 프로토콜
t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리) t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리)
t1 -intracolonic 관리 후 5 분 t1 -intracolonic 관리 후 30 분
t2 -intracolonic 관리 후 30 분 t2 -intracolonic 관리 후 60 분

표 1: 포털 혈액 샘플링 프로토콜 창 자 침투성 평가 대 한.

참고: 연속 혈액 샘플링 사이의 시간 주로 시험된 물질의 생체 이용률과 관리 (결 장, 위, )의 사이트에 따라 달라 집니다.

  1. 포털 카 테 터 플러그를 열고 혈액의 흐름을 자유롭게 하자.
  2. 사용 주사기 (vol. 2 mL) 및 무딘 바늘 OD: 0.9 m m. 더 이상 0.7 mL 혈액의 수집.
  3. Heparinized 염 (100 단위/mL)의 0.3 mL와 함께 테 린스 하 고 카 테 터 플러그를 닫습니다.

5. 열 등 한 베 나 정 맥 혈액 샘플링

  1. 때때로 사용; 특정 테스트 프로토콜에 따라 샘플 열 등 한 베 나 정 맥 혈액 표 2를 참조 하십시오.
문맥 열 등 한 베 나 카바
t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리) t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리)
t1 -intracolonic 관리 후 30 분 t1 -intracolonic 관리 후 30 분

표 2: 프로토콜 간 허가 측정을 위한 샘플링 및 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 추적 하는 혈액의.

  1. 열 등 한 베 나 정 맥 카 테 터 플러그를 열고 혈액의 흐름을 자유롭게 하자.
  2. 더 이상 0.7 mL 주사기를 사용 하 여 혈액의 수집 (vol. 2 mL) 깨진 바늘 OD: 0.9 m m.
  3. 0.2-0.3와 테 린스의 mL heparinized 염 분 (100 단위/mL)와 카 테 터 플러그를 닫습니다.

6입니다. 창 자 침투성 표식 관리

  1. 가이드 와이어를 제거 하 고 살 균 물 (보통 1 mL 하지만 삽입 하기 전에 체크 실제 풍선 크기)의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 저 승 카 테 테 르 풍선 팽창.
    참고: 풍선 직경 1 cm 넘지 말아야 한다.
  2. (약 15% 경사) 콜론에서 관리 솔루션의 유출의 위험을 최소화 하기 위해 아래 쥐 머리를 놓습니다.
  3. 천천히 테스트 물질을 관리 (예: trimethylamine, 100 mg/kg bw) 저 승 카 테 터에 배수 장치 포트를 사용 하 여.
    참고: 볼륨 관리 솔루션의 0.75 mL의 항문에서 관리 솔루션의 유출을 방지 하기 위해 0.5 mL/min의 이송 속도 초과 하지 마십시오.
  4. 10 분 후 풍선을 카 테 터를 빼 다.
  5. 열 등 한 베 나 카바와 사용; 특정 테스트 프로토콜에 따라 문맥에서 샘플 혈액 표 1과 표 2를참조 하십시오.
  6. 승인 된 방법을 통해 동물 안락사

7입니다. 간 정리의 계산

  1. 익스프레스 간 통관, 포털 혈액 농도 열 등 한 베 나 정 맥 혈액 농도 차이 의해 또는 포털 혈액 농도 (1-(열 등 한 베 나 정 맥 농도에 열 등 한 베 나 정 맥의 비율에 의해 간장 추출으로 이해 / 포털 정 맥 농도)).

8. 시험 물질 농도 n 혈액 샘플의 평가

  1. 테스트 물질 테스트 방법론에 따라, 적절 한 실험실 절차 (원심, 등등)에 샘플을 적용. 제안 된 프로토콜에서 우리 평가 TMA/TMAO SCFA 농도 트리플 4 극 자 질량 분석으로 결합 하는 액체 크로마토그래피를 사용 하 여. 보충 자료에는 방법에 대 한 자세한 설명을 찾아 주시기 바랍니다.

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Representative Results

우리는 성공적으로 GBB 침투성 및 간 허가 TMA의 쥐에서 측정 됩니다. 우리는 고혈압 쥐 normotensive 쥐 (그림 2)4에 비해 TMA 증가 콜론 침투성을 증명 하고있다. 또 다른 연구에서 우리는 높은 소금 섭취가 TMA (그림 3)14의 GBB 침투성 및 간 허가 영향을 주지 않습니다 발견.

변, 포털 혈액 및 말 초 혈액에서 SCFA의 농도 측정, 우리 주변 혈액에 창 자에서 분자의 경로 추적. 그 실험에 대 한 모범적인 결과 표 3에 표시 됩니다.

Figure 2
그림 2 : 창 자-혈액 장벽 침투성에 고혈압 관련 변경. TMA의 Intracolonic 관리 생산 각 그룹에 포털 혈액 TMA에서에서 크게 증가 (n = 12 각 그룹에 대 한). 고혈압 (SHR) 그룹에서 포털 혈액 TMA에서에서 증가 했다 normotensive (WKY) 그룹에서 보다 훨씬 더 높은. TMA 관리 (IC TMA) 후 30 분 및 60 분을 샘플링 하는 혈액의 구성 된 긴 프로토콜 사용. 값은 수단, + SE, *p < 0.05 대 기준선, #p < 0.05 WKY 대 SHR. 이 그림 Jaworska 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 높은 소금 섭취 후 창 자-혈액 장벽 침투성 및 간 허가. (TMA의 A) Intracolonic 관리 포털 혈액 TMA에에서 상당한 증가 생산. 증가의 크기는 그룹 사이 유사 했다 (n = 7 각 그룹에 대 한). TMA (IC TMA)의 관리 후 기준선 (0) 및 15 분에서 혈액 샘플을 채 취하고 간단한 프로토콜을 사용 했습니다. (B) 간 TMA 클리어런스 TMA의 intracolonic 관리 후 기준선에 그룹 그리고 15 분 사이 유사 했다. 값은 수단, + SE. *p < 0.05 대 기준. 이 그림 Bielinska 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 14 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

SCFA 자 농도 (µ M) 포털 혈액 농도 (µ M) 말 초 혈액 농도 (µ M)
금주 모임-초 산 (C2) 15998.40 ± 4317.58 564.22 ± 155.34 149.89 ± 31.74
IPA-프로 산 (C3) 5390.70 ± 1016.19 138.25 ± 55.50 5.36 ± 3.25
IBA-isobutyric 산 (C4) 191.20 ± 123.87 4.51 ± 1.60 1.14 ± 1.16
학사-낙 산 (C4) 4159.80 ± 3141.68 143.14 ± 68.42 6.43 ± 4.18
2MeB-2 methylbutyric 산 (C5) 80.90 ± 59.86 2.02 ± 0.88 1.14 ± 1.42
IVA isovaleric 산 (C5) 109.10 ± 56.05 2.59 ± 1.07 0.90 ± 1.22
VA-valeric 산 (C5) 281.9 ± 158.20 8.55 ± 3.56 0.72 ± 1.02
ICA-isocaproic 산 / 4 methylvaleric 산 (C6) 5.9 ± 2.95 0.61 ± 0.15 1.76 ± 0.87
캘리포니아-카프 산 (C6) 287.00 ± 309.68 11.19 ± 4.94 1.12 ± 0.93

표 3: 자, 포털 혈액 및 말 초 혈액에서 SCFA 농도 (n = 7).

시험 물질 가능한 응용 프로그램
세균성 대사 산물:
trimethylamine (TMA), 짧은 사슬 지방산 (SCFA), 황화 수소, 등등.
GBB 침투성 연구
창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 추적
간 정리 연구
클래식 침투성 마커:
류, 못, FITC dextran 등.
GBB 침투성 연구
마약 흡수와 키 모 정리 연구

표 4: 가능한 응용 프로그램 모범 시험 물질.

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Discussion

설명 직접 vivo에서, GBB 침투성 측정 방법을 유지 closetophysiological 조건 위장 시스템 (장 혈액의 흐름을 유지), 그리고 간, 신장 기능 영향을 거의 받지 않습니다.

이 기술의 중요 한 단계는 포털 카 테 터의 삽입 이다. 이 수행 되어야 합니다 부드럽게 하 고 결정적으로 같은 시간에. 온화 하 고, 짧은 출혈이 문맥;의 올바르게 수행된 펑크에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 그릇에 바늘이 삽입 될 때 중지 됩니다. 지속적인 출혈 포털 정 맥 천공을 나타냅니다. 촉진 하기 위해 카 테 터 삽입, 포털 정 맥 잘 드러내 야 한다. 내장, exteriorizing 후 mesenteric 루트 잘 드러낼 때, 상단 mesenteric 정 맥도 볼 수 있어야 (mesenteric 정 맥은 문맥에 cranially 입력). 포털 정 맥 측으로 이동 하는 간 엽 일반적으로 적용 됩니다. 때문에 카 테 터의 움직임은 포털 정 맥 파열 및 출혈, 특히 긴 실험에서에서 생성 될 수 있습니다 또한, 포털 카 테 테 르의 적절 한 안정화 성공적인 절차에 대 한 결정적 이다. 카 테 터의 추가 안정화 조직 접착제로 mesentery에 집착 하 여 또는 두 개의 단일 스티치 (실 6/0)를 적용 하 여 mesentery에 카 테 터를 부착 하 여 얻을 수 있습니다. 카 테 터의 위치를 확보 하기 위해 복 부 구멍을 닫은 후 지갑 문자열 봉합 사 테에 적용할 수 있습니다.

실험 기간 동안 발생할 수 있는 몇 가지 사소한 문제가 있다. 대 퇴 정 맥의 도관 법 후 정 맥 혈액 테에 역류 하지 않으면 다음 해결책을 시도해: heparinized 염 분으로 카 테 터를 플러시을 조심 스럽게 당기고 카 테 터는 정 맥에서 1-2 m m, 제거 수술 매듭 넥타이 새로운 한, 풀 테 고 다시, 또는 새로운 카 테 터를 바꿉니다. 실험 후 테의 적절 한 배치를 확인 하는 기억. 테는 간 정 맥 합류 보다 열 등 한 베 나 정 맥에 카 테 터의 근 위 팁을 배치 하는 동물의 크기에 따라 6-7 cm에 삽입 한다. 0.3-0.5를 삽입할 수 있습니다에 관해서 콜론 도관 법, 카 테 터를 전진에 대 한 문제가 있는 경우 식 염 수 또는. 5-10 분, 그리고 다시 시도 대 한 콜론에 테의 mL 힘을 사용 하지 않는 내장의 천공을 피하기 위해 카 테 터를 삽입 하는 동안.

우리의 연구에서 우리 창 자 박테리아 파생 분자, 콜론 GBB 침투성의 표식으로 trimethylamine (TMA)를 사용 하는 TMA는 결 장 박테리아에 의해 주로 생산. 그러나, FITC dextran 또는 설탕, 같은 고전적인 침투성 마커를 포함 하 여 다른 많은 물질 뿐만 사용할 수 있습니다 ( 표 4참조). 시험 물질의 솔루션을 준비할 때 장 점 막에 자극 효과 고려 하 고 적절 하 게 물질의 농도 선택 합니다. 혈액 샘플의 추가 실험실 절차 선택한 마커를 조정 해야 합니다.

우리는 마커의; intracolonic 관리를 제안 하는 우리의 프로토콜에 그러나, 그것은 구강 관리 또는 gavage 소화 관의 다양 한 수준에서 수정할 수 있습니다. 연동 및 효소와 위 산 가능한 상호 작용의 가변 속도 위장 위 또는 십이지의 상단 부분에 표시를 관리 하는 동안 계정에 취해야 한다. 따라서, 표시자의 관리 후 혈액 샘플링의 시간 조정 될 필요가 있다.

마 취의 부작용을 포함 하 여 금식 하룻밤, 그 둘 다 영향을 미칠 수 GBB 함수는 제시 방법의 몇 가지 제한이 있습니다. 그것은 취해야 한다 계정에 절차 터미널 하 고 완전히 생리 조건 동안 혈액 샘플링을 포함 한다. 그러나, 그것은 여전히 많은 이점이 다른 실험 방법 GBB 침투성을 평가 하기 전에 언급 했 듯이, 특히 생체 외에서11수행. 예를 들어 Ussing 챔버를 장 상피 세포를 통해 전도도 및 입자 플럭스를 측정합니다. 이 기술은의 주요 약점은 과도 한 단순화에 있다. 혼자 상피 세포 층에 적은 수의 측정을 사용 하 여 창 자 점 막의 복잡 한 생리 적 시스템을 설명 하는 것이 어렵습니다. 일부 연구 자들은 Ussing 챔버 연구, 전체 두께 소장을 사용 하지만이 절차는 여러 방법론 합병증15동반 된다. 또한, 방법의 정확도 조직의 유기 체에서 격리 제한 된 생존에 의해 손상 됩니다. 일부 체 외에서 사용 되는 방법 pharmacokinetic 연구에 인공 막12장 배리어 모델 사용 합니다. 그러나, Ussing 챔버와 유사 하 게 그 방법을 GBB 구조와 기능의 복잡성을 반영 하지 않습니다.

또한 실험 및 임상 연구에 사용할 수 있는 침투성 분석 vivo에서 있다. 그들은 주로 소변 또는 다양 한 마커13의 구두 또는 저 승 관리 후 말 초 혈액 샘플링 기반은. 널리 사용 되는 설탕 테스트 모노-및 oligosaccharides, 포유류 유기 체, 예를 들어 마 니 톨, lactulose 대사 하지의 구강 섭취를 포함 한다. 메서드를 사용 하면 비-침략 적 이며 모두 실험 및 임상 사용16,17;에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 결과 1 차 통과 간 대사와 신장 기능, 연구 과목 간에 크게 다를 수 있는 영향을. 위에서 언급 한 간접 방법을 달리 GBB 침투성12의 직접 평가 포털 정 맥에서 혈액을 수집 수 있습니다. 이 메서드와 간 및 신장 기능에 의존 하지 않습니다 거의 생체 외에서 또는 vivo 예 방법 중요 한 장점은 창 자에 생리 조건을 유지.

이 문서에 설명 된 기술을 또한 허용 비교적 정확한 간 정리 평가 대 한 문맥 및 간 정 맥 합류 보다 열 등 한 베 나 정 맥에서 혈액을 수집. 간장 추출에 대 한 대표적인 결과 그림 3 (TMA)와 표 3 (SCFA)에 표시 됩니다. 우리의 데이터 제안 세 가지 주요 SCFA, 아세테이트, propionate, 그리고 낙 산 염, 이전 연구에 의해 지원 되는 다른 간 허가 특징은 어디 Bloemen 외. 하지만 propionate, 낙 산 염의 그 장 릴리스를 표시 아세테이트, 거의 간 통풍 관18에 의해 같게 했다. 따라서, 제시 프로토콜은 장내 흡수 및 pharmacokinetic 연구에 사용 될 수 있는 약물의 간 대사를 추적 적합 합니다.

기술은 또한 다른 실험적인 목적을 조정할 수 있다. 포털 혈압을 측정 하거나 관리 포털에 직접 약물의 정 맥, 간 순환 연구 포털 정 맥의 도관 법을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 이전 작품에서는, 우리는 간 순환 및 포털 압력19에 미치는 영향을 평가 하기 위해 문맥을 황화 수소 기증자 관리.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

작품은 과학과 고 등 교육 공화국 폴란드의 지원, 다이아몬드 부여 no: DI2017 009247.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Needle OD: 9 mm Becton Dickinson  S.A. 301300
Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040"  Scientific Commodities, Inc. #BB520-40
Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025"  Scientific Commodities, Inc. #BB520-25
C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD   Cole-Parmer Instrument Co. 06424-59
Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F)  Sigmed 0000 80305
Surgical ligatures 3/0 Yavo Sp. Z o.o.  P48JE
Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 KRUUSE Polska Sp. Zo.o. 152336
Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive Loctite  1370127
Povidone iodine EGIS Pharmaceuticals PLC 4449 11
Heparin - Heparinium WZF  WZF Polfa S.A. 02BK0417 Dilute 10 times with physiological saline
Glycerin 86% Laboratorium Farmaceutyczne Avena 5.90999E+12 Serves as a lubricant in colon catheterization
Xylocaine 2% AstraZenca  9941342
Urethane Sigma-Aldrich (Merck)  U2500-500G
Trimethylamine solution 45% Sigma-Aldrich (Merck)  92262-1L
Syringes 2 mL B.Braun Melsungen AG 4606027V
Saline 250 mL Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. 15LL707WL
Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends Braun NS-010-115-PKM
Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " Braun KN-008-140-ZMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 Braun PO-001-007-ZMK
Micro Scissors type Vannas,  straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm Braun  NO-010-085-PMK
Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8"  Braun HO-128-130-PMK
Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2  Braun  IM-927-150-PZMK
Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp  Braun NO-052-110-PMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp Braun PO-022-001-PMK

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References

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Jaworska, K., Huc, T., Gawrys, M.,More

Jaworska, K., Huc, T., Gawrys, M., Onyszkiewicz, M., Samborowska, E., Ufnal, M. An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products. J. Vis. Exp. (140), e58456, doi:10.3791/58456 (2018).

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