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Biochemistry

परिवेशी तापमान और ७७ K पर जैविक नमूनों में इलेक्ट्रॉन Paramagnetic अनुनाद का उपयोग

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58461
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) स्पेक्ट्रोस्कोपी मुक्त कण को मापने के लिए एक अस्पष्ट विधि है । चुनिंदा स्पिन जांच का उपयोग अलग सेलुलर डिब्बों में मुक्त कण का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । हम EPR माप के लिए उपचार, भंडारण, और स्थानांतरित करने की सुविधा है कि जैविक नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक व्यावहारिक, कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

अलग सेलुलर और ऊतक डिब्बों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का सटीक और विशिष्ट पता लगाने जैविक सेटिंग्स में redox विनियमित संकेतन के अध्ययन के लिए आवश्यक है । इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (EPR) ही प्रत्यक्ष विधि को स्पष्ट रूप से मुक्त कण का आकलन है । इसका लाभ यह है कि यह एक उच्च विशिष्टता के साथ विशिष्ट प्रजातियों के शारीरिक स्तर का पता लगाता है, लेकिन यह विशेष प्रौद्योगिकी की आवश्यकता होती है, सावधान नमूना तैयारी, और उचित नियंत्रण डेटा की सटीक व्याख्या सुनिश्चित करने के लिए. चक्रीय hydroxylamine स्पिन जांच सुपरऑक्साइड या अंय कण के साथ चुनिंदा एक nitroxide संकेत है कि EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा quantified किया जा सकता है उत्पंन प्रतिक्रिया । सेल-पारगंय स्पिन जांच और mitochondria में तेजी से जमा करने के लिए डिजाइन की गई स्पिन जांचें विभिन्न सेलुलर डिब्बों में सुपरऑक्साइड एकाग्रता के निर्धारण के लिए अनुमति देती हैं ।

प्रसंस्कृत कोशिकाओं में, सेल पारगंय का उपयोग 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CMH) के साथ और बिना सेल-अभेद्य सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) का इलाज, या सेल का उपयोग-पारगंय खूंटी-वतन, के लिए अनुमति देता है cytosolic सुपरऑक्साइड से extracellular का विभेद । द mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2, 2, 6, 6-tetramethyl-piperidine, 1-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio) acetamido] piperidinium dichloride (मिळो-टेम्पो-एच) की माप के लिए अनुमति देता है mitochondrial ROS (मुख्य रूप से सुपरऑक्साइड) ।

स्पिन जांच और EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी को भी वीवो मॉडल में लागू किया जा सकता है । सुपरऑक्साइड ऐसे रक्त और वायुकोशीय द्रव के रूप में extracellular तरल पदार्थ में पता लगाया जा सकता है, साथ ही ऊतकों जैसे फेफड़ों के ऊतकों । कई तरीकों की प्रक्रिया और EPR माप के लिए ऊतक की दुकान और 1-hydroxy-3-carboxy-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CPH) विवो मेंस्पिन जांच देने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । जबकि माप कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जा सकता है, इन विट्रो में से प्राप्त नमूनों और vivo मॉडल में भी संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c और ७७ K पर EPR द्वारा विश्लेषण. नमूने विशेष टयूबिंग में संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c और ७७ K पर चलाने के लिए एक व्यावहारिक, कुशल, और reproducible विधि है कि भंडारण और स्थानांतरित नमूनों की सुविधा को सक्षम करने के लिए ।

Introduction

जबकि ऑक्सीडेटिव तनाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उपाय सभी अंग प्रणालियों में विविध रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के एक छोटे आधे जीवन और उच्च जेट के कारण चुनौतीपूर्ण है । एक इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) तकनीक मुक्त कण का पता लगाने के लिए सबसे अस्पष्ट तरीका है । स्पिन जांच अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच पर लाभ है । हालांकि फ्लोरोसेंट जांच अपेक्षाकृत सस्ती और आसानी से उपयोग कर रहे है और तेजी से, ROS के प्रति संवेदनशील का पता लगाने, वे गंभीर artifactual संकेतों की वजह से सीमाएं हैं, एक ROS सांद्रता की गणना करने में असमर्थता, और विशिष्टता 1 की एक सामांय कमी .

जैविक अध्ययन के लिए EPR के उपयोग की सुविधा के लिए, स्पिन जांच की एक किस्म है कि तार्किक प्रासंगिक मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीओ2, पीएच, और redox राज्यों2,3 की एक सीमा को मापने कर सकते है संश्लेषित किया गया है 4,5,6,7. स्पिन जाल भी कम रहने वाले कण और फार्म का लंबे समय से रहने वाले adducts है, जो8EPR द्वारा पता लगाने की सुविधा को पकड़ने के लिए विकसित किया गया है । दोनों वर्गों (स्पिन जांच और स्पिन जाल) फायदे और सीमाएं हैं । एक आमतौर पर स्पिन की जांच की कक्षा का इस्तेमाल चक्रीय hydroxylamines, जो EPR मूक और कम के साथ प्रतिक्रिया कर रहे है एक स्थिर nitroxide फार्म के कण रहते हैं । चक्रीय hydroxylamines सुपरऑक्साइड १०० बार स्पिन जाल से अधिक तेजी के साथ प्रतिक्रिया, उन्हें सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए सक्षम करने, लेकिन वे विशिष्टता की कमी है और कट्टरपंथी प्रजातियों या स्रोत की पहचान करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण और अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता nitroxide संकेत के लिए जिंमेदार है । जबकि स्पिन जाल प्रदर्शित विशिष्टता, फंसे प्रजातियों के आधार पर अलग वर्णक्रमीय पैटर्न के साथ, वे सुपरऑक्साइड स्पिन फँसाने के लिए धीमी गति से कैनेटीक्स है और कट्टरपंथी adducts के biodegradation के लिए प्रवण हैं । स्पिन ट्रैपिंग के लिए आवेदन अच्छी तरह से किया गया है बायोमेडिकल रिसर्च9,10,11,12,13में प्रलेखित ।

इस परियोजना का लक्ष्य है प्रयोग डिजाइन करने के लिए व्यावहारिक EPR तरीकों को प्रदर्शित करना और नमूनों की तैयारी के लिए सुपरऑक्साइड में अलग सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच का उपयोग करने के लिए और vivoमें अलग ऊतक डिब्बों में । कई पांडुलिपियों इन लक्ष्यों के लिए प्रासंगिक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है, सेल का उपयोग कर-पारगंय, सेल-अभेद्य, और mitochondrial लक्षित स्पिन जांच इन विट्रो में अलग सेलुलर डिब्बों और माउस मॉडलों में विश्लेषण के लिए प्रक्रिया ऊतक लक्ष्य 14 , 15. हम सुपरऑक्साइड को मापने के लिए एक दृष्टिकोण को मान्य करके साहित्य के इस शरीर पर निर्माण करते हैं एक 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CMH) इन विट्रो में विभिन्न सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच सटीक सुनिश्चित करने के लिए माप, परिणाम तिरछा हो सकता है कि संभावित तकनीकी समस्याओं पर प्रकाश डाला । हम भी CMH स्पिन जांच का उपयोग कर रक्त, bronchoalveolar लेवेज द्रव, और फेफड़ों के ऊतकों में EPR माप प्रदर्शन करने के लिए तरीके प्रदान करते हैं । इन अध्ययनों से ऊतकों को संसाधित करने के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना करते हैं और साथ ही एक अन्य स्पिन जांच, CPH, चूहों में कटाई के ऊतकों से पहले एक विधि पेश करते हैं । अंत में, हम एक व्यावहारिक विधि को polytetrafluoroethylene में नमूनों की दुकान (PTFE) टयूबिंग का भंडारण और EPR मापन से पहले नमूनों के हस्तांतरण के लिए अनुमति देने के लिए विकसित ७७ K ।

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Protocol

सभी पशु अध्ययन कोलोराडो डेनवर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. Diethylenetriaminepentaacetic एसिड (DTPA) शेयर (१५० mM)
    1. DTPA के २.९५ ग्राम (३९३.३५ g/मोल पानी के 10 मिलीलीटर जोड़ें) ।
    2. DTPA भंग करने के लिए, 1 मीटर NaOH dropwise जोड़ें और ७.० के एक पीएच के लिए ले आओ ।
    3. १५० मिमी की एक अंतिम DTPA एकाग्रता के लिए पानी के साथ ५० मिलीलीटर के लिए मात्रा लाओ, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) (५० मिमी, पीएच ७.४)
    1. सोडियम क्लोराइड (NaCl) (५८.४४ g/मोल; २९.२२ ग्राम/100 एमएल) के 5 मीटर तैयार करें ।
    2. पोटेशियम फॉस्फेट के 1 मीटर तैयार dibasic एच2पीओ4 (१७४.१८ g/मोल/१७.४२ g/100 mL)
    3. पोटेशियम फॉस्फेट monobasic KH2पीओ4 (१३६.१ g/मोल; १३.६१ ग्राम/100 एमएल) के 1 मीटर तैयार करें । 1 मीटर पोटेशियम फास्फेट dibasic की ४.२४ मिलीलीटर और ०.७६० मिलीलीटर की १ एम पोटेशियम फॉस्फेट monobasic के साथ ५ एम NaCl की ३ मिलीलीटर मिक्स करें. पीएच की जांच करें ।
    4. मात्रा को १०० मिलीलीटर पानी के साथ ले आओ ।
    5. कमरे के तापमान पर स्टोर (आरटी) अल्पकालिक (दिन) के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के लिए (सप्ताह) भंडारण ।
  3. Krebs-Henseleit बफर (KHB) युक्त १०० µ m DTPA
    1. ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में, १५० mM DTPA शेयर समाधान के ३३.३ µ एल जोड़ें ।
    2. Krebs-Henseleit बफर (KHB) के साथ एक ५० मिलीलीटर की मात्रा को लाओ ।
    3. प्रत्येक दिन DTPA के साथ ताजा बफर तैयार करें और इसे आरटी पर रखें ।
  4. Tris-EDTA बफर युक्त सुक्रोज
    1. तैयार ०.५ M Tris शेयर: Tris बेस के १५.१४ g भंग (१२१.१४ ग्राम/) के १५० मिलीलीटर पानी में । एचसीएल का प्रयोग, ७.८ के लिए पीएच समायोजित और २५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में लाने के लिए ।
    2. सुक्रोज के २१.४ जी भंग (३४२.२९ g/मॉल; अंतिम एकाग्रता = ०.२५ मिमी) में १५० मिलीलीटर पानी की ।
    3. 10 मिमी अंतिम Tris एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सुक्रोज को Tris स्टॉक के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. 1 मिमी अंतिम एकाग्रता हासिल करने के लिए Tris-सुक्रोज के ०.५ मिलीलीटर को ०.५ मीटर EDTA स्टॉक में जोड़ें ।
    5. पीएच की जांच करें और इसे समायोजित करने के लिए ७.४ ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी और दुकान के साथ २५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में लाने के लिए ।
  5. गोजातीय एरिथ्रोसाइट घन/Zn सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) शेयर (३०,००० U/एमएल)
    1. पंजाब के 1 एमएल में वतन के ३०,००० यू का पुनर्गठन (लगभग ५.७ मिलीग्राम, वतन बहुत की गतिविधि पर निर्भर करता है) ।
    2. मिश्रण अच्छी तरह से, aliquot, और कम अवधि के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (6-12 महीने) और लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस ।
  6. वतन समाधान काम (१००० यू/
    1. ३०,००० यू/एमएल वतन शेयर के एक 30 µ एल aliquot बाँझ पंजाबियों के ८७० µ एल में स्थानांतरण ।
    2. बर्फ पर समाधान रखें, और इसे ताजा का उपयोग करें ।
  7. Phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) शेयर (5 मि.)
    1. DMSO (अंतिम एकाग्रता = 5 मिमी) के ३२५ µ एल में पमा (६१६.८३ g/मॉल) के 1 मिलीग्राम भंग ।
    2. Aliquot a 5 mM पमा समाधान गर्ने र यह दुकान-२० ° c ।
  8. पमा काम गर्ने समाधान (१२५ µ m)
    1. 5 mM पमा शेयर के 10 µ l aliquot को पतला करना बाँझ पंजाबियों के ३९० µ l में ।
    2. बर्फ पर समाधान रखें और इसे ताजा उपयोग करें ।
    3. पमा के लिए वाहन नियंत्रण के लिए, पंजाब के ३९० µ l में DMSO के 10 µ l का उपयोग करें ।
  9. Diphenyliodonium क्लोराइड (डिप) (२.५ mM)
    1. भंग ३.२ डुबकी के एमजी (३१६.५७ ग्राम/) 4 मिलीलीटर में एक २.५ mM स्टॉक प्राप्त करने के लिए ।
    2. समाधान तैयार है और इसे ताजा उपयोग करें ।
  10. Deferoxamine mesylate नमक (DFO) (20 मि. ली.)
    1. भंग ४.५ DFO के एमजी (६५६.७९ ग्राम/) ३४० µ एल में एक 20 मिमी स्टॉक प्राप्त करने के लिए ।
    2. समाधान तैयार है और इसे ताजा उपयोग करें ।
  11. antimycin ए (एए) स्टॉक (5 मिमी) की तैयारी
    1. को भंग ५.४ ए. ए. (५३२ g/मॉल) के 2 इथेनॉल के मिलीलीटर में (अंतिम एकाग्रता = 5 मिमी) ।
    2. Aliquot-20 डिग्री सेल्सियस पर कांच की शीशियों और स्टोर में स्टॉक को कम करें ।
  12. स्पिन जांच की तैयारी
    1. बुलबुला ५० मिमी फॉस्फेट बफर से भंग ऑक्सीजन को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ १०० µ मीटर DTPA युक्त बफ़र.
    2. -20 ° c फ्रीजर से स्पिन जांच निकालें और कंटेनर आरटी (10-15 मिनट) के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. बाहर वजन २.४ मिलीग्राम 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine · एचसीएल (CMH) (२३७.८ ग्राम/
    4. 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए deoxygenated फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर में CMH भंग.
    5. बाहर वजन 5 मिलीग्राम 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2, २, ६, ६-tetramethylpiperidine, १-hydroxy-२, २, ६, ६-tetramethyl-४-[२-(triphenylphosphonio) acetamido] piperidinium dichloride (मिळो-टेम्पो-एच) (५२९.१ ग्राम/
    6. ९.५ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए deoxygenated फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर में-टेम्पो-एच भंग ।
    7. बाहर वजन ४.९ मिलीग्राम 1-hydroxy-3-carboxy-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine · एचसीएल (CPH) (२२३.७ ग्राम/
    8. 22 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए deoxygenated फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर में CPH भंग.
    9. Aliquot और स्टोर पर-८० ° c (फ्रीज-गल अनुशंसित नहीं है) ।

2. इन विट्रो में सुपरऑक्साइड का पता लगाना

  1. कुल का पता लगाना, extracellular, और intracellular सुपरऑक्साइड में पमा-उत्तेजित कच्चे २६४.७ आरटी पर कोशिकाओं
    1. उचित अपूतित तकनीक के बाद, गल कच्चे २६४.७ कोशिकाओं और DMEM मीडिया में उंहें पारित 10% FBS (कम endotoxin मुक्त) और 1% antimycotic/एम्पीसिलीन में सह2 मशीन में ३७ ° c के साथ पूरक ।
    2. बीज कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में 1 x 106 कोशिकाओं/ठीक से एक दिन पहले उपचार करने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेटों में ।
    3. धीरे मीडिया को हटाने और KHB बफर के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने ।
    4. १०० µ एम DTPA युक्त प्रत्येक कुआं में KHB जोड़ें, और ५०० µ l की कुल मात्रा में निम्नलिखित के साथ व्यवहार करें:
    5. वेल्स के लिए वतन के साथ इलाज, 15 µ एल जोड़ें/वतन के ठीक समाधान काम (१००० u/एमएल; वतन के अंतिम एकाग्रता = 30 u/एमएल) और ३७ ° c पर 10 मिनट के लिए CMH और पमा के अलावा पहले की मशीन ।
    6. जोड़ें १२.५ µ 10 मिमी CMH स्टॉक (अंतिम एकाग्रता = ०.२५ मिमी) के एल/
    7. जोड़ ४० µ l/१२५ के µ m पमा काम गर्ने समाधान (अंतिम एकाग्रता = 10 µ m) या ४० µ l वाहन (stock 10 µ l की DMSO में ३९० µ l of पंजाब).
    8. एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस से कम ५० मिनट के लिए मशीन ।
    9. मशीन से प्लेटें निकालें और बर्फ पर तुरंत उंहें जगह है ।
    10. अलग, १.५ मिलीलीटर, लेबल ट्यूबों में प्रत्येक अच्छी तरह से बफर ले लीजिए । भर बर्फ पर रखो ।
    11. जोड़ें १०० µ ताजा KHB बफर के १०० µ एम DTPA युक्त, धीरे कोशिकाओं परिमार्जन, और pipetting द्वारा resuspend ऊपर और नीचे कई बार । सेल resuspension में बर्फ पर रखें ।
    12. नमूना चरणों में एकत्र 2.1.10 और 2.1.11 (५० µ एल) केशिका ट्यूबों में से प्रत्येक में लोड । सील दोनों सिरों और EPR चलाते हैं ।
      नोट: हमेशा एक ट्यूब या अच्छी तरह से (कोशिकाओं के बिना परीक्षण) बफर में जांच (एक ही एकाग्रता = ०.२५ मिमी), कोशिकाओं के रूप में एक ही स्थिति के तहत इलाज (एक ही गर्मी के समय और तापमान) एक नियंत्रण के रूप में, जांच की पृष्ठभूमि तीव्रता के बाद से तापमान है- और समय पर निर्भर है ।
    13. निम्न करने के लिए EPR प्राप्ति पैरामीटर सेट करें: माइक्रोवेव आवृत्ति = ९.६५ GHz; मध्य फ़ील्ड = ३४३२ G; मॉडुलन आयाम = २.० G; स्वीप चौड़ाई = ८० G; माइक्रोवेव पावर = १९.९ मेगावाट; स्कैन की कुल संख्या = 10; स्वीप समय = १२.११ s; और समय स्थिरांक = २०.४८ ms.
  2. रॉ २६४.७ कोशिकाओं में mitochondrial सुपरऑक्साइड का पता लगाने
    1. कदम 2.1.1 और 2.1.2 बीज कच्चे २६४.७ कोशिकाओं को एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए का पालन करें ।
    2. मीडिया निकालें और KHB बफ़र की 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
    3. जोड़ KHB के २०० µ l को १०० µ मीटर DTPA से प्रत्येक कुआं पर डालें ।
    4. जोड़ें ५.३ µ एल/९.५ mm मिळो-टेम्पो-एच शेयर (अंतिम एकाग्रता = ०.२५ mm) का कुआं
    5. आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    6. जोड़ें 1 µ l/antimycin एक (एए), इथेनॉल में 5 मिमी स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता = 25 µ m) ।
    7. एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस से कम ५० मिनट के लिए मशीन ।
    8. मशीन से प्लेटें निकालें और बर्फ पर तुरंत उंहें जगह है ।
    9. धीरे कोशिकाओं परिमार्जन और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा resuspend । बर्फ पर रखो ।
    10. एक केशिका ट्यूब में नमूना लोड । सील दोनों सिरों ।
    11. EPR सेटिंग के लिए पिछला अनुभाग देखें ।
  3. ७७ K पर कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में सुपरऑक्साइड का पता लगाने
    1. पहले से तैयार PTFE टयूबिंग में चरण 1.1.10 में एकत्र बफर प्लेस लंबाई में 1-2 इंच (3/16 "आयुध डिपो एक्स 1/8" आईडी) । सुनिश्चित करें कि PTFE टयूबिंग सीधे है तो यह आसानी से डाला जा सकता है और उंगली देवर से हटा दिया । PTFE टयूबिंग के एक छोर बंद करने के लिए एक रबर डाट का उपयोग करें, PTFE टयूबिंग में बफर या सेल निलंबन (१०० १५० µ एल) पिपेट, और एक दूसरे डाट के साथ ट्यूबिंग सील ।
    2. फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज । नमूना-८० ° c या तुरंत चलाने पर भंडारण के लिए एक लेबल cryopreservation ट्यूब को हस्तांतरित किया जा सकता है ।
    3. उंगली देवर तरल नाइट्रोजन के साथ भरें और उंगली देवर में नमूना युक्त PTFE ट्यूबिंग डालें । सुनिश्चित करें कि नमूना प्रतिध्वनि के सक्रिय स्थान में केंद्रित है और EPR ७७ K पर चला है ।
      नोट: माप से पहले अपने स्पेक्ट्रोमीटर 15-30 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस के प्रवाह को प्रारंभ करें, और इस प्रवाह को प्रतिध्वनित में पानी संघनित्र को रोकने के लिए माप भर में जारी रखें ।
    4. निम्न करने के लिए EPR प्राप्ति पैरामीटर सेट करें: माइक्रोवेव आवृत्ति = ९.६५ GHz; मध्य फ़ील्ड = ३४३८ G; मॉडुलन आयाम = ४.० G; स्वीप चौड़ाई = १५० G; माइक्रोवेव पावर = ०.३१६ मेगावाट; स्कैन की कुल संख्या = 10; स्वीप समय = ६० s; और समय स्थिरांक = १.२८ ms.

3. तरल पदार्थ में EPR माप

  1. पूरे रक्त
    1. चूहों का इलाज (8-12 सप्ताह पुरानी) intratracheal ब्लीयामीसिन की एक खुराक के साथ (Bleo; १०० µ एल पर 1 U/एमएल) अकेले पंजाब या पंजाब में भंग के रूप में पहले16,17वर्णित है ।
    2. Euthanize द्वारा चूहों साँस isoflurane (1.5-4%) इसके बाद exsanguination और ग्रीवा विस्थापन । एक सिरिंज में सही निलय के माध्यम से महाप्राण रक्त हेपरिन (१००० खासियत/एमएल) युक्त १०० µ मीटर DTPA और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
    3. एक अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, १०० µ एम DTPA और 3 µ एल के CMH (10 मिमी) के १३२ µ एल के लिए रक्त की कुल मात्रा १५० µ एल और अंतिम CMH एकाग्रता की ०.२ मिमी युक्त 15 µ एल जोड़ें ।
    4. एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रक्त की मशीन ।
    5. पानी स्नान से ट्यूबों निकालें ।
    6. एक केशिका ट्यूब में रक्त लोड हो रहा है और निम्न EPR अधिग्रहण मापदंडों के साथ आरटी पर EPR चलाने के द्वारा एक aliquot ले लो: माइक्रोवेव आवृत्ति = ९.६५ GHz; मध्य फ़ील्ड = ३४३२ G; मॉडुलन आयाम = १.० G; स्वीप चौड़ाई = ८० G; माइक्रोवेव पावर = १९.९ मेगावाट; स्कैन की कुल संख्या = 3; स्वीप समय = १२.११ s; और समय स्थिरांक = २०.४८ ms. वैकल्पिक रूप से, नमूनों फ़्लैश जमे हुए किया जा सकता है के रूप में वर्णित के रूप में चरण २.३ में माप के लिए ७७ K. EPR अधिग्रहण पैरामीटर निम्नलिखित हैं: माइक्रोवेव आवृत्ति = ९.६५ GHz; मध्य फ़ील्ड = ३४३८ G; मॉडुलन आयाम = ४.० G; स्वीप चौड़ाई = १५० G; माइक्रोवेव पावर = ०.३१६ मेगावाट; स्कैन की कुल संख्या = 2; स्वीप समय = ६० s; और समय स्थिरांक = १.२८ ms.
  2. Bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF)
    1. इच्छामृत्यु के बाद (3.1.2 कदम देखें), धीरे जगाकर द्वारा BALF इकट्ठा और १०० µ एम DTPA से युक्त एक सिरिंज में तीन बार एक प्रवेशनी श्वासनली में रखा के माध्यम से पंजाब के 1 मिलीलीटर वापस ले लीजिए ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, ०.२ मिमी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए CMH (10 मिमी) के 4 µ एल के साथ BALF के २०० µ एल इलाज.
    3. एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ५० मिनट के लिए BALF की मशीन ।
    4. पानी के स्नान के बाहर ट्यूब ले लो और उंहें बर्फ पर जगह है ।
    5. एक केशिका ट्यूब में BALF लोड और चरण 1.1.13 में प्रयुक्त के रूप में एक ही EPR सेटिंग्स के साथ RT पर EPR चलाने के लिए, या फ्लैश फ्रीज में २.३ चरण में वर्णित के रूप में तरल नाइट्रोजन ।
  3. ७७ K पर रक्त और BALF में EPR मापन
    1. रक्त एकत्रित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करें (steps 3.1.1. to 3.1.4) और BALF (steps 3.2.1 to 3.2.4) ।
    2. प्लेस १५० PTFE ट्यूबिंग में इलाज रक्त या BALF के µ एल (1-2 में) । एक रबर डाट का प्रयोग करें PTFE टयूबिंग के एक छोर को बंद करने के लिए नमूना जोड़ने और एक और डाट टयूबिंग सील करने से पहले ।
    3. फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज ।
    4. PTFE टयूबिंग में जमे हुए नमूनों में EPR चलाने पर विवरण के लिए धारा २.३ को देखें ७७ K. में उंगली देवर का उपयोग कर जमे हुए CMH के साथ एक सप्ताह में रक्त के नमूनों का इलाज चलाया.

4. फेफड़ों के ऊतकों पर EPR माप

  1. फ्लैश जमे हुए फेफड़ों के ऊतकों
    1. चरण 3.2.1 में BALF इकट्ठा करने के बाद, छाती खोला और फेफड़ों सही निलय के माध्यम से ठंड पंजाबियों की 10 मिलीलीटर रक्त निकालने के साथ फ्लश । फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में फेफड़ों के ऊतकों को फ्रीज । जमे हुए फेफड़े के ऊतकों EPR माप के लिए उपयोग तक 6 महीने के लिए-८० ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. चिमटी के साथ सूखी बर्फ पर फेफड़े के ऊतकों को स्थिर और एक एकल बढ़त ब्लेड का उपयोग कर फेफड़ों के ऊतकों के कई छोटे टुकड़े (5-15 मिलीग्राम) में कटौती ।
    3. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक वजन, पैमाने पर ट्यूब जगह और पैमाने पर धड़ा, तो ऊतक टुकड़े जोड़ें और वजन रिकॉर्ड ।
    4. १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक के लिए, २०० CMH एल कुल मात्रा को प्राप्त करने के लिए DTPA और 4 µ एल के µ (०.२ मिमी) युक्त KHB के १९६ µ एल जोड़ें ।
    5. एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मशीन ।
    6. नीचे स्पिन (कुछ सेकंड के लिए) में एक microcentrifuge में ३,८८४ x जी
    7. बर्फ और पिपेट पर प्लेस १५० PTFE टयूबिंग में supernatant के µ एल और ७७ K माप के रूप में धारा २.३ में वर्णित के लिए फ्रीज ।
      नोट: इस विधि के लिए विविधता की चोट की जरूरत पर विचार करना होगा । एक ब्लीयामीसिन-प्रेरित फेफड़ों की चोट के लिए, यह देखते हुए कि यह एक अत्यंत विषम चोट है, यह प्रत्येक माउस से फेफड़ों के विभिन्न भागों से कई ऊतक टुकड़े में कटौती करने के लिए सिफारिश की है । वैकल्पिक रूप से, ऊतक का एक बड़ा टुकड़ा KHB बफर में homogenized जा सकता है १०० µ एम DTPA युक्त एक 1:6 वजन पर मात्रा अनुपात (mg/µ l) के रूप में नीचे वर्णित है ।
  2. ताजा फेफड़ों सुक्रोज बफर में संरक्षित ऊतक
    1. ठंडे पंजाबियों के साथ lavaged फेफड़ों फ्लश के रूप में 3.1.2 कदम में किया रक्त को दूर करने के लिए ।
    2. Homogenize एक ग्लास या µ मूसल के साथ Dounce ऊतक चक्की का उपयोग कर एक 1:6 फेफड़े/बफर (एमजी/PTFE एल) अनुपात के साथ ०.२५ मीटर सुक्रोज युक्त Tris-EDTA बफर में ताजा फेफड़े के ऊतकों ।
    3. जोड़ने के ५० µ l को लंग homogenate के ४५० µ l को KHB युक्त १०० µ m DTPA.
    4. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में (१०० µ एल की कुल मात्रा में), KHB में फेफड़ों homogenate के ९८ µ एल के लिए, ०.२ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 मिमी शेयर के µ के 2 CMH एल जोड़ें.
    5. एक पानी के स्नान में 20 मिनट ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मशीन ।
    6. बर्फ पर नमूनों प्लेस और एक केशिका ट्यूब में उन्हें लोड । RT पर EPR चलाएँ (चरण 2.1.13 में उपयोग की गई सेटिंग).
    7. विभिंन अवरोधकों का उपयोग कर विशिष्ट प्रजातियों और स्रोतों के योगदान का परीक्षण करने के लिए, फेफड़े homogenate + के पूर्व उपचार ८८ µ l-अवरोध करनेवाला, KHB के साथ समायोजन करने के लिए ९८ µ एल के एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए इस प्रयोग में, अवरोधकों में वतन के 10 µ एल (१०० यू/एमएल), deferoxamine के 4 µ l (DFO; अंतिम एकाग्रता = ८०० µ मीटर), या µ क्लोराइड के 4 diphenyliodonium l (डुबकी; अंतिम एकाग्रता = १०० µ मी) शामिल हैं । एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    8. CMH के 2 µ एल जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक और 20 मिनट के लिए मशीन, ऊपर वर्णित के रूप में EPR माप के बाद । सुक्रोज बफ़र युक्त CMH KHB के साथ एक बार मिलाए गए रिक्त नमूने को शामिल करें । वैकल्पिक रूप से, भावी मापन के लिए-८० ° c पर शेष फेफड़े homogenates (चरण 3.1.2) की aliquots संग्रहीत करें ।
      नोट: कुल मात्रा की आवश्यकता के रूप में स्केल किया जा सकता है ।
  3. EPR चूहों से फेफड़े के ऊतकों पर माप vivo में स्पिन की जांच के साथ इंजेक्शन (पर आरटी ऊतक सेल का उपयोग)
    1. फ़िल्टर और deoxygenated ५० mM फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर में CPH के ४.९ मिलीग्राम भंग करके CPH स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    2. 20-30 सेकंड के लिए साँस isoflurane (1.5-4%) के साथ Anesthetize चूहों जब तक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए अप्रतिसादी. १०० के साथ retroorbital मार्ग के माध्यम से चूहों इंजेक्षन एक 25 जी माउस शरीर के वजन के लिए CPH स्पिन जांच के µ एल (अंतिम खुराक = 20 मिलीग्राम/और जांच की अनुमति 1 एच के लिए प्रसारित करने के लिए retroorbital इंजेक्शन के बाद तुरंत, ०.५% की एक बूंद proparacaine के लिए आंख क्षेत्र पर एचसीएल जोड़ nt नेत्र दर्द और सूखापन । 1 एच के लिए चूहों पर नजर रखने और ऊतक कटाई के लिए आगे बढ़ना ।
    3. फसल फेफड़े के ऊतकों के रूप में ऊपर वर्णित है और फ्लैश फेफड़ों फ्रीज ।
    4. कट 20-30 सूखी बर्फ पर जमे हुए ऊतक के मिलीग्राम और सटीक वजन रिकॉर्ड ।
    5. धीरे साफ पोंछे के साथ ऊतक पोंछने के लिए किसी भी सतह के पानी को अवशोषित ।
    6. टिशू सेल की खिड़की के भीतर ऊतक प्लेस (एक गौण ऊतक नमूनों के लिए EPR माप की अनुमति देता है) और EPR चलाने के लिए कुल spins निर्धारित करते हैं । डेटा ऊतक के प्रति मिलीग्राम कुल spins के रूप में व्यक्त किया जा सकता है ।

5. डेटा विश्लेषण

  1. EPR स्पेक्ट्रा बेंच-टॉप EMXnano EPR स्पेक्ट्रोमीटर के क्सीनन सॉफ्टवेयर में शामिल SpinFit मॉड्यूल का उपयोग कर अनुकरण । SpinCount मॉड्यूल द्वारा nitroxide एकाग्रता का निर्धारण । वैकल्पिक रूप से, ऐसे 4-hydroxy-टेम्पो या TEMPOL के रूप में एक स्थिर nitroxide के अंशांकन वक्र बनाया जा सकता है, और एकाग्रता नमूना और मानक के साथ संकेत की तीव्रता की तुलना करके प्राप्त किया जा सकता है ।
  2. ७७ K पर एकत्रित डेटा के लिए, SpinCount द्वारा फ़ॉलो किए गए दोहरे एकीकरण का उपयोग करें.

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Representative Results

सुपरऑक्साइड CMH का उपयोग कर सत्यापित किया गया X/XO सुपरऑक्साइड उत्पादन प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रदर्शित करता है कि nitroxide (सेमी.) संकेत पूरी तरह से वतन से हिचक रहा था, जबकि catalase कोई प्रभाव नहीं था (1a आंकड़ा) । कुल, extracellular सुपरऑक्साइड तो सेल-पारगंय CMH स्पिन की जांच के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया था +/ nitroxide एकाग्रता दोनों सेल निलंबन और बफर में मापा गया था, जो दिखा दिया कि दो नमूने प्रकार में मूल्यों पारगंय प्रकृति और स्पिन जांच के तेजी से equilibration के कारण समान थे (आंकड़ा 1b). nitroxide कट्टरपंथी संकेत कच्चे २६४.७ कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए कोशिकाओं की तुलना में पमा के साथ उत्तेजित में वृद्धि हुई । यह संकेत काफी सेल-अभेद्य वतन (चित्रा 1C) के साथ इलाज कोशिकाओं में तनु थी । प्रत्येक रंग विभिंन दिनों पर परीक्षण कुओं का प्रतिनिधित्व करता है, विशिष्ट दिनों और समय भर में परिणाम के reproducibility पर एकत्र आंकड़ों की निरंतरता का प्रदर्शन । extracellular सुपरऑक्साइड की एकाग्रता वतन (टी) के अभाव में पमा के बाद संकेत से वतन के साथ इलाज पमा कोशिकाओं में संकेत घटाकर निर्धारित किया गया था । शेष संकेत intracellular सुपरऑक्साइड (फिगर 1C) के लिए जिम्मेदार ठहराया गया. चित्र 1 d कुल और extracellular सुपरऑक्साइड की गणना दिखाता है । (ङ) मीडिया को हटाने के बाद और सिग्नल पर खूंटी-वतन के प्रभाव से intracellular संकेत को पमा-उपचारित कोशिकाओं में पुष्ट किया गया. इस ग्राफ़ में, (C) के विपरीत, CMH रिक्त माप से घटाया नहीं गया था, और अपुष्ट डेटा दिखाया गया है ।

कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में Mitochondrial सुपरऑक्साइड EPR स्पिन जांच मिळो-टेम्पो-एच, जो mitochondia में जमा का उपयोग कर पाया गया । (क) प्रतिनिधि EPR स्पेक्ट्रा आधारभूत मिळो के लिए-टेम्पो एच संकेत बफर में, वृद्धि हुई मिळो-टेम्पो-नियंत्रण कोशिकाओं (कांग्रेस) में एच संकेत है, और आगे बढ़ाया कोशिकाओं में संकेत mitochondrial अवरोधक Antimycin एक (ए. ए.) के साथ उत्तेजित । संकेत में वृद्धि mitochondrial सुपरऑक्साइड के लिए जिंमेदार ठहराया गया था हमारे पिछले दिखा रहा है कि SOD2 व्यक्त काफी क्षीणन के साथ माप का अध्ययन के आधार पर-टेम्पो-एच10। चित्रा बीमें, mitochondrial nitroxide एकाग्रता समय में कक्ष माप से मिलान बफर से मिळो-टेम्पो-एच संकेत घटाकर निर्धारित किया गया था । CM. सिग्नल की उपस्थिति और वतन की अनुपस्थिति में पमा के साथ उत्तेजना के बाद कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में कम तापमान पर प्राप्त की । (चित्र 3ए) CM. संकेत वतन की उपस्थिति में तनु थी, कमरे के तापमान डेटा (चित्रा 1) के साथ संगत । चित्र बी के लिए कोशिकाओं और vivo नमूनों में ७७ K पर डेटा एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया डाट के साथ PTFE टयूबिंग की तस्वीर से पता चलता है । ब्लड में सुपरऑक्साइड प्रोडक्शन का पता लगाया गया और CMH स्पिन जांच का इस्तेमाल BALF । रक्त या BALF नमूने पंजाबियों से एकत्र किए गए थे और Bleo-इलाज चूहों और CMH के साथ तुरंत मशीन । नमूनों को PTFE टयूबिंग और फ्लैश जमे हुए स्थानांतरित किया गया, और EPR डेटा ७७ K पर एकत्र किया गया था । nitroxide की एकाग्रता (सेमी.) रक्त में संचित CMH (०.२ मिमी) के साथ 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री पर ()चित्र 4a। Nitroxide (सेमी.) BALF से एकाग्रता ५० मिनट (चित्रा 4B) के लिए मशीन । Nitroxide एकाग्रता (सेमी.) रक्त या प्रयोग में प्रयुक्त BALF की मात्रा में संचित की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है ।

तीन तरीकों को ऊतक संरक्षण और स्पिन जांच के प्रशासन के लिए कई प्रकाशित तकनीकों का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया गया है पूर्व वीवो बनाम vivo में । फेफड़ों के ऊतकों पर EPR माप प्रदर्शन करने के लिए, हम पहले नियंत्रण या घायल चूहों से फ्लैश जमे हुए फेफड़े के ऊतकों का इस्तेमाल किया । चित्र 5 . CMH-और Bleo-इलाज चूहों, क्रमशः के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन फेफड़ों के ऊतकों का एक छोटा सा टुकड़ा के supernatant में संकेत से पता चलता है। Bleo उपचार के बाद फेफड़ों की चोट के विविधता के कारण, यह फेफड़ों और औसत कई माप के विभिन्न क्षेत्रों से टुकड़े काटने के लिए एक अधिक प्रतिनिधि मूल्य प्रदान करने के लिए सिफारिश की है । वैकल्पिक रूप से, एक पूरे फेफड़ों homogenize और इस homogenate का एक नमूना का उपयोग कर सकते हैं । ७७ K पर एकत्र डेटा PTFE टयूबिंग और उंगली देवर का उपयोग. आंकड़ा 5B nitroxide के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा दिखाता है (CM.) पंजाबियों से संकेत-और Bleo-इलाज चूहों, क्रमशः ।

फेफड़े के ऊतकों का इलाज करने के लिए एक सीमा पूर्व vivo है कि यह संभव नहीं है मज़बूती से extracellular intracellular सुपरऑक्साइड से ऊतक है कि कोशिका झिल्ली को बाधित के प्रसंस्करण के कारण भेद करने के लिए । यदि यह जानकारी प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए महत्वपूर्ण है, यह का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता vivo में CPH जगाकर विधि नीचे वर्णित है । जमे हुए ऊतक mitochondrial सुपरऑक्साइड का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता; हालांकि, इस माप के लिए, प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-टेम्पो-ऊतक या हौसले से अलग mitochondria में एच ।

फेफड़ों के ऊतकों में EPR माप के लिए एक दूसरी विधि के रूप में, ताजा ऊतक सुक्रोज बफर में homogenized था । फेफड़े homogenate DTPA युक्त KHB बफर में CMH जांच के साथ मशीन था । EPR माप आरटी में किया गया था । चित्रा 6A सेमी में वृद्धि दर्शाता है । साथ Bleo । हम एक अतिरिक्त विभिंन अवरोधकों कि प्रजातियों कि मुख्यमंत्री के लिए योगदान का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उपयोग कर परीक्षण प्रस्तुत किया। संकेत. सेमी की उत्पत्ति स्पष्ट करने के लिए। फेफड़े के ऊतकों से उत्पन्न संकेत, हम कई मेहतर और एंजाइमों अवरोधकों के साथ फेफड़े homogenates का इलाज किया । फेफड़े homogenates अभाव में CMH के साथ या वतन की उपस्थिति, deferoxamine (DFO), और diphenyliodonium क्लोराइड (डुबकी) खाते के लिए (क्रमशः) सुपरऑक्साइड, लौह, या सुपरऑक्साइड से उत्पंन फ्लेविन-युक्त से योगदान के लिए मशीन थे एंजाइम (फिगर घमण्ड). यह दृष्टिकोण एक प्रणाली में उत्पन्न विशिष्ट कट्टरपंथी प्रजातियों का आकलन करने या अन्य एंजाइमी स्रोतों (जैसे, NOX, एनोस, या xanthine oxidase) के योगदान को स्पष्ट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

CPH स्पिन जांच (20 मिलीग्राम/retroorbital मार्ग के माध्यम से vivo मेंEPR मापन प्रदर्शन के लिए चूहों के साथ इंजेक्शन थे । यह अज्ञात है कि CMH सुरक्षित रूप से पशुओं के लिए प्रशासित किया जा सकता है, जबकि CPH जांच गैर विषैले होने की सूचना दी गई है; इस प्रकार, हम vivo प्रयोगों में के लिए CPH का चयन किया । फेफड़ों के ऊतकों को काटा गया और CPH जांच के संचलन के बाद तरल नाइट्रोजन 1 एच में जमे हुए फ्लैश । चूहे एक साथ विशिष्ट antioxidants के साथ इलाज के लिए संकेत के लिए जिंमेदार प्रजातियों अंतर कर सकते हैं । चित्रा 7A उच्च वाणिज्यिक पत्र से पता चलता है। चूहों पर नियंत्रण की तुलना में Bleo-इलाज चूहों में संकेत. नियंत्रण और Bleo-इलाज चूहों से फेफड़ों के ऊतकों की संख्या स्पेक्ट्रा चित्रा 7Bमें दिखाया गया है । सीपी का मिश्रित EPR स्पेक्ट्रा. और ascorbic एसिड कट्टरपंथी मनाया गया । चित्रा 7A में बताया मान सीपी की सांद्रता हैं. घटक. डेटा टिशू सेल का उपयोग कर आरटी में एकत्र किए गए ।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न सेल डिब्बों में सुपरऑक्साइड का पता लगाने. (A) EPR स्पेक्ट्रा ०.५ mm hypoxanthine/xanthine oxidase (8 mU/एमएल) के साथ और बिना वतन (30 यू/एमएल) में ०.२५ mm CMH द्वारा उत्पंन । (ख) कच्चे २६४.७ कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं/ठीक है) से प्रेरित थे 10 µ m पमा के लिए CMH की उपस्थिति में ५० मिनट के लिए ३७ ° c और nitroxide एकाग्रता (µ m) में पाया गया कक्ष निलंबन (कक्ष + बफ़र) और बफ़र का इलाज किया कोशिकाओं से एकत्र की । (ग) कच्चे २६४.७ कोशिकाओं को पमा बनामउत्तेजित किया गया । वाहन नियंत्रण (कांग्रेस) । कोशिकाओं का एक सेट 30 यू/एमएल सेल के साथ 10 मिनट के लिए इलाज किया गया-अभेद्य वतन (पमा + वतन) । प्रत्येक रंग अलग प्रायोगिक दिनों से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है और प्रत्येक बिंदु एक व्यक्ति से अच्छी तरह से कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । KHB में CMH के साथ एक समय मिलान रिक्त में nitroxide संकेत अंतिम मान प्राप्त करने के लिए प्रत्येक संकेत से घटाया गया था । (घ) पमा उत्तेजित प्रकोष्ठों में कुल तथा extracellular सुपरऑक्साइड की गणना; T = कुल सुपरऑक्साइड, EC = extracellular सुपरऑक्साइड (वतन बाधित सिग्नल). (ङ) intracellular सुपरऑक्साइड संकेत (आईसी) का मूल्यांकन करने के लिए, पमा + वतन के बाद बफर में संकेत बफर के हटाने के बाद पमा-उपचारित कोशिकाओं की तुलना की गई. पुष्टि करने के लिए, कुओं ६० यू/एमएल सेल-पारगंय खूंटी-वतन १.५ घंटे के लिए के साथ इलाज किया गया intracellular वतन संकोच का निर्धारण । समय-मिलान CMH रिक्त दिखाया गया है, और डेटा निरपेक्ष nitroxide संकेत प्रतिबिंबित । डेटा के रूप में व्यक्त ± SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: antimycin ए के साथ उत्तेजित कच्चे कोशिकाओं में mitochondrial सुपरऑक्साइड का पता लगाने । (ए) mitochondrial-विशिष्ट EPR स्पिन जांच के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा, ०.२५ मिमी मिळो-टेम्पो-बिना कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में एच (कांग्रेस) या के साथ 25 µ m antimycin एक (एए) ५० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर । (ख) सेमी. एकाग्रता (µ मी) कोशिकाओं में नियंत्रण की तुलना में ए. ए. के साथ इलाज. एक समय में nitroxide संकेत-मिलान मिळो-टेम्पो-एच खाली अंतिम मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कुल संकेत से घटाया गया था । डेटा के रूप में व्यक्त ± SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:77K में कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में सुपरऑक्साइड का पता लगाने। (क) कच्चे २६४.७ कोशिकाओं के साथ उत्तेजित 10 µ m पमा और EPR स्पिन जांच, CMH ०.२५ mM (५० मिनट में ३७ ° c) के साथ (काला) या बिना (लाल) 30 यू/एमएल वतन के साथ उपचार । १०० supernatant के µ एल एक 1 इंच PTFE टयूबिंग की लंबाई टुकड़ा में लोड किया गया था, तो तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश । डाट हटा रहे थे, और जमे हुए PTFE टयूबिंग ७७ K पर डेटा अधिग्रहण के लिए उंगली देवर में रखा गया था । (ख) PTFE टयूबिंग और डाट की एक तस्वीर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: नियंत्रण और ब्लीयामीसिन-इलाज चूहों से रक्त और BALF में EPR माप. चूहों intratracheal ब्लीयामीसिन (आईटी Bleo) की एक खुराक के साथ इलाज किया गया (१०० µ एल पर 1 यू/एमएल) या पंजाबियों वाहन. 7 दिन में चूहे anesthetized और euthanized थे । रक्त एक १००० खासियत के साथ लेपित सिरिंज में सही वेंट्रिकुलर पंचर के माध्यम से एकत्र किया गया था/एमएल हेपरिन १०० µ एम DTPA युक्त । Bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) को पंजाबियों में १०० µ मीटर DTPA के 1 मिलीलीटर के साथ फेफड़ों lavaging करके एकत्र किया गया था । रक्त और BALF 10 या ५० मिनट के लिए, क्रमशः ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.२ mM CMH के साथ कर रहे थे । १५० रक्त या BALF के µ एल PTFE टयूबिंग तरल नाइट्रोजन और EPR एक उंगली देवर का उपयोग ७७ K पर एकत्र आंकड़ों में जमे हुए फ़्लैश में लोड किया गया था । डेटा (ए) रक्त और (ख) पंजाबियों से BALF-और Bleo-इलाज चूहों में nitroxide सांद्रता दिखाने (n = 4-6) । डेटा मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त की (ग) पंजाबियों से रक्त में nitroxide के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा-और Bleo-इलाज चूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: फ्लैश जमे हुए फेफड़ों के ऊतकों में EPR माप । चूहों intratracheal ब्लीयामीसिन (आईटी bleo) की एक खुराक के साथ इलाज किया गया (१०० µ एल पर 1 यू/एमएल) या पंजाबियों वाहन. 7 दिनों में, फेफड़ों में खून निकालने और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश के लिए ठंडे पंजाबियों के साथ फ्लश किया गया । 5-15 मिलीग्राम फ्लैश-जमे हुए फेफड़े के ऊतकों में ०.२ mM CMH के साथ KHB में १०० µ मीटर युक्त था कुल मात्रा के २०० µ एल में 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर Supernatant एकत्र किया गया था और PTFE टयूबिंग में रखा और उंगली देवर में ७७ कश्मीर में चलाते हैं । (क) Nitroxide एकाग्रता (Nitroxide के µ एम को सामान्यीकृत करने के लिए 1 मिलीग्राम ऊतक). डेटा प्रत्येक फेफड़ों के लिए 2-3 माप के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं । डेटा मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त की (ख) पंजाबियों से फेफड़े के ऊतकों में nitroxide के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा-और Bleo-इलाज चूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: सुक्रोज बफर में संरक्षित फेफड़े के ऊतकों में EPR माप । चूहों intratracheal ब्लीयामीसिन (1 यू/एमएल पर १०० µ एल) की एक खुराक के साथ इलाज किया गया । 7 दिनों के बाद उपचार, फेफड़ों ठंड पंजाबियों के साथ रक्त निकालने के लिए फ्लश थे, और ताजा फेफड़े के ऊतकों में homogenized था Tris-EDTA बफर ०.२५ मिमी सुक्रोज युक्त एक 1:6 फेफड़ों के वजन/बफर मात्रा (mg/µ l) अनुपात । फेफड़ों homogenate के ५० µ एल के साथ या बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए निम्नलिखित अवरोधकों के साथ KHB के साथ किया गया था: वतन (१०० यू/एमएल), deferoxamine (DFO; ८०० µ मीटर), और diphenyliodonium क्लोराइड (डुबकी; १०० माइक्रोन) के साथ मशीन द्वारा पीछा ०.२ mM CMH में KHB युक्त १०० µ m DTPA ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए । EPR केशिका ट्यूबों का उपयोग कर आरटी में डेटा प्राप्त किया गया था । (क) पंजाब-और Bleo-इलाज चूहों से फेफड़ों में एकाग्रता Nitroxide. (ख) अनुपस्थिति में Bleo फेफड़ों में Nitroxide एकाग्रता या अवरोधकों की उपस्थिति (n = 3). डेटा के रूप में व्यक्त ± SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: CPH स्पिन जांच के साथ इंजेक्शन चूहों से फेफड़ों के ऊतकों में EPR माप. १०० µ एल CPH के एक अंतिम एकाग्रता के लिए retroorbital इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया गया था 20 CPH के मिलीग्राम शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम. संचलन के 1 ज के बाद, चूहों euthanized थे, फेफड़ों सही निलय के माध्यम से ठंडे पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ निकाल रहे थे, और फेफड़ों के ऊतकों जमी फ़्लैश था । 20 से 30 फेफड़ों के ऊतकों की मिलीग्राम ऊतक कोशिका और EPR माप आरटी में प्रदर्शन में रखा गया था (क) डेटा spins के रूप में व्यक्त/(ख) पंजाब और Bleo फेफड़ों के ऊतकों में nitroxide संकेत के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा (* को इंगित करता है ascorbic एसिड कट्टरपंथी के साथ ओवरलैप) । डेटा के रूप में व्यक्त ± SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Inhibitors प्रजातियों
सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) Extracellular सुपरऑक्साइड
सुपरऑक्साइड dismutase – पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी-वतन) Intracellular सुपरऑक्साइड
Catalase हाइड्रोजन पेरोक्साइड आधारित कण
उरते Peroxynitrate
इथेनॉल और DMSO हाइड्रॉक्सिल जहाल
मेटल chelators धातु आयनों (लौह और तांबा)

तालिका 1. आम अवरोधकों स्पिन जांच ऑक्सीकरण के लिए जिंमेदार प्रजातियों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया ।

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Discussion

जैविक सेटिंग्स में नि: शुल्क कट्टरपंथी उत्पादन का आकलन स्वास्थ्य और रोग में redox विनियमित संकेत को समझने में महत्वपूर्ण है, लेकिन इन प्रजातियों का माप मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों और तकनीकी के छोटे आधे जीवन के कारण अत्यधिक चुनौतीपूर्ण है सामांयतः उपयोग की जाने वाली विधियों के साथ सीमाएं । EPR redox जीवविज्ञान में एक मूल्यवान और शक्तिशाली उपकरण है, क्योंकि यह केवल अस्पष्ट मुक्त कण का पता लगाने के लिए विधि है । इस परियोजना में, हम प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए व्यावहारिक EPR तरीकों का प्रदर्शन और ROS में विभिन्न सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच का उपयोग करने के लिए नमूनों की तैयारी और vivo में विभिन्न ऊतक डिब्बों. हम भी व्यावहारिक तरीके प्रदान करने के लिए जैविक नमूनों और स्टोर नमूनों को संभालने के लिए दक्षता में सुधार ।

स्पिन की जांच ROS के साथ कुशलतापूर्वक प्रतिक्रिया और एक स्थिर nitroxide कट्टरपंथी है कि EPR के साथ पता लगाया जा सकता है उत्पादन । स्पिन जांच के कई डेरिवेटिव (चक्रीय hydroxylamine) अलग पारगम्यता विशेषताओं के साथ संश्लेषित किया गया है, जो उन्हें विभिन्न सेलुलर डिब्बों में मुक्त कट्टरपंथी उत्पादन का पता लगाने के लिए उपयुक्त बनाने10. इस प्रोटोकॉल का उपयोग सेल-पारगंय स्पिन जांच, CMH; हालांकि, अभेद्य स्पिन जांच में 1-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium क्लोराइड एचसीएल (CAT1H) का इस्तेमाल extracellular सुपरऑक्साइड का पता लगाने के लिए किया जा सकता है । मानव lymphoblast सेल लाइंस18में हमारे पूर्व अध्ययन के लिए इसी तरह, हम अभेद्य वतन और सेल पारगंय खूंटी-कच्चे 264.7 कोशिकाओं में वतन के साथ पारगंय CMH स्पिन जांच के उपयोग को मांय कर रहे थे (एक माउस फेफड़ों मैक्रोफेज सेल लाइन) को पमा के साथ उत्तेजित extracellular और intracellular सुपरऑक्साइड के बीच अंतर ।

हम भी इंट्रा और अतिरिक्त सेलुलर डिब्बों के बीच CMH के तेजी से equilibration की पुष्टि की है, और हम यह भी पाया कि कोशिकाओं में सुपरऑक्साइड संकेत काफी केवल एक बार KHB के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद बूंदें (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हम mitochondrial विशिष्ट स्पिन जांच मिळो की उपयोगिता की पुष्टि की-टेम्पो-कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में एच mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधक antimycin के साथ उत्तेजना पर उत्पंन वृद्धि हुई mitochondrial सुपरऑक्साइड को मापने के लिए एक । mitochondrial सुपरऑक्साइड उत्पादन के विशिष्ट योगदान के लिए मिळो-टेम्पो-एच पहले प्रदर्शन किया गया है और अलग ताजा mitochondria या mitochondrial सुपरऑक्साइड dismutase MnSOD (SOD2) के साथ सिस्टम का उपयोग कर प्रयोगों में मांय किया जा सकता है एक्सप्रेस10.

vivo में ROS उत्पादन का आकलन विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन विशिष्ट ROS के उत्पादन का पता लगाने की क्षमता महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है जब ऑक्सीडेटिव तनाव या जैविक में विनियमित संकेतन की भूमिका redox पूछताछ सेटिंग्स. ऊतक की उचित हैंडलिंग जब स्पिन जांच और EPR का उपयोग करने reproducible और सार्थक परिणाम उत्पंन करने के लिए आवश्यक है । ऊतक के साथ स्पिन की जांच की संभावना एक छोटी आधा जीवन की वजह से ऊतक कटाई के समय मौजूद सुपरऑक्साइड कण उपाय नहीं होगा, लेकिन बजाय यह NAPDH oxidase, युगल endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड जैसे एंजाइमों द्वारा उत्पादित सुपरऑक्साइड का पता लगाता है सिंथेस , या xanthine oxidase जब फेफड़े के ऊतकों या homogenates ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्पिन की जांच के साथ मशीन हैं । जमे हुए ऊतक के उपयोग सुपरऑक्साइड mitochondria द्वारा उत्पंन शामिल नहीं है, ठंड नुकसान mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला गतिविधि के बाद से होगा । mitochondrial सुपरऑक्साइड परीक्षण करने के लिए, जांचकर्ताओं ताजा mitochondria को अलग या vivo में या ताजा ऊतक में mitochondrial विशिष्ट जांच का उपयोग करने की जरूरत है ।

कई विभिंन प्रोटोकॉल ऊतक के संरक्षण के लिए साहित्य14,15में प्रकाशित किया गया है । हम फेफड़े के ऊतकों में EPR माप के लिए तीन प्रकाशित तरीकों की तुलना में: 1) तरल नाइट्रोजन में फ्लैश ठंड ऊतक, 2) सुक्रोज बफर में अनुमन्य ऊतक, और 3) एक स्पिन की जांच के साथ vivo में चूहों का इलाज 1 घंटे ऊतक कटाई से पहले । हम की तुलना में चूहों को नियंत्रण चूहों गंभीर फेफड़ों की सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव ब्लीयामीसिन द्वारा प्रेरित करने के लिए प्रत्येक विधि के घायल फेफड़ों में nitroxide संकेतों में लगातार मतभेद दिखाने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए । सभी तीन तरीकों ब्लीयामीसिन-इलाज चूहों के फेफड़ों में nitroxide संकेत में एक समान सापेक्ष वृद्धि दिखाई । फ़्लैश जमे हुए ऊतक के उपयोग की संभावना सबसे आसान दृष्टिकोण के लिए ज्यादातर प्रयोगशालाओं के लिए ऊतक इकट्ठा होगा, कटाई के समय सुक्रोज बफर में ऊतक प्रक्रिया की जरूरत को नकारना । CPH के इंजेक्शन vivo में मुक्त कण को पकड़ने के लिए शक्तिशाली है, लेकिन विशिष्ट प्रजातियों की पुष्टि करने के लिए, इस उचित एंटीऑक्सीडेंट सहित एक उपचार समूह की आवश्यकता है ।

स्पिन जांच का उपयोग करने की एक चुनौती यह है कि nitroxide करने के लिए स्पिन जांच के ऑक्सीकरण एक समान तीन लाइन EPR स्पेक्ट्रम उत्पंन ऑक्सीकरण के लिए जिंमेदार प्रजातियों की परवाह किए बिना; इस प्रकार, यह अलग ROS प्रजातियों के बीच भेद नहीं करता है । साथ ही, यह भी बताया गया है कि संश्लेषक इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन और cytochrome सी oxidase19,20के साथ hydroxylamine जांच की संभावित प्रतिक्रियाएं हैं । इन टिप्पणियों पर विचार किया जाना चाहिए जब परिणाम की व्याख्या । इस प्रोटोकॉल में, संश्लेषक प्रणाली मौजूद नहीं है, और बफर के साथ DTPA का समावेश मुक्त घाट और आयनों cuprous10 के संभावित संदूषण को रोकता है । हम का प्रदर्शन कैसे विशिष्ट एंजाइमों या फेफड़ों के ऊतकों में chelators की एक श्रृंखला का उपयोग करने के लिए विशेष ROS या एंजाइम अवरोधकों के योगदान को स्थापित करने के लिए ROS के स्रोत का निर्धारण । यह दृष्टिकोण पहले EPR के साथ प्रयोग किया गया है के कारण ROS के योगदान को निर्धारित करने के लिए जोड़ा एनोस13,15। हम आम प्रजातियों स्पिन की जांच ऑक्सीकरण (तालिका 1) के लिए जिंमेदार भेद करने के लिए इस्तेमाल की एक सूची प्रदान करते हैं ।

हम भी प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए समय की गर्मी के अनुकूलन के महत्व का प्रदर्शन किया । जाल स्पिन करने के लिए स्पिन की जांच की तुलना करते हैं, स्पिन जाल मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों की विशिष्टता के लिए अनुमति देता है जो प्रतिक्रिया के आधार पर अद्वितीय स्पेक्ट्रा उत्पन्न; हालांकि, वे भी सुपरऑक्साइड स्पिन फँसाने के लिए धीमी कैनेटीक्स प्रदर्शन और biodegradation करने के लिए प्रवण हैं. EPR जांच पूर्व vivo के साथ फेफड़े के ऊतकों के उपचार भी पर्याप्त रूप से ऊतक के प्रसंस्करण के दौरान कोशिका झिल्ली के विघटन के कारण intracellular सुपरऑक्साइड से extracellular भेद करने के लिए अक्षमता द्वारा सीमित है (ठंड या अनुमन्य) । वीवो में इंजेक्शन की स्पिन जांच का इस्तेमाल वतन या सेल के साथ संयोजन के रूप में पारगंय खूंटी-वतन इस समस्या का पता कर सकते हैं ।

एक लक्ष्य के लिए कुशलता से नमूनों को इकट्ठा करने और उंहें EPR माप से पहले-८० ° c में स्टोर करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था । इसलिए हम नमूने रखने के लिए PTFE टयूबिंग का उपयोग करने के लिए एक व्यावहारिक विधि विकसित की है । इस टयूबिंग सीधे EPR विश्लेषण के लिए उंगली देवर में ७७ K पर नमूनों के बीच देवर साफ करने की आवश्यकता के बिना रखा गया है । यह हाल ही में प्रकाशित 1 एमएल सीरिंज में नमूनों की ठंड से संबंधित विधि के लिए एक विकल्प है । PTFE टयूबिंग में संग्रहीत जमे हुए नमूनों में माप संकेत की स्थिरता को प्रदर्शित करने के लिए कई दिनों से अधिक दोहराया जा सकता है । इस दृष्टिकोण EPR माप बैच के लिए अनुमति देता है और प्रयोगशालाओं के बीच नमूनों को स्थानांतरित करने की सुविधा तो एक दूरदराज के EPR सुविधा नमूने चला सकते हैं ।

कुल मिलाकर, इन प्रोटोकॉल जैविक प्रणालियों में EPR माप के लिए कोशिकाओं और ऊतकों को तैयार करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल ऑक्सीडेटिव तनाव और अंय स्पिन जांच के उपयोग के साथ जुड़े अंय मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । समय और स्पिन जांच की एकाग्रता के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक शर्त के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी । EPR की क्षमता उपस्थिति और मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों के उत्पादन का निर्धारण करने के लिए स्पष्ट रूप से redox जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को कठोरता प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए विश्वविद्यालय के कोलोराडो स्कूल ऑफ मेडिसिन के डीन के रणनीतिक अनुसंधान अवसंरचना पुरस्कार, R01 HL086680-09 और 1R35HL139726-01 के लिए E.N.G. और UCD CFReT फेलोशिप पुरस्कार (वह) का समर्थन किया गया. लेखक डॉ सैंड्रा ईटन और dr. गैरेथ ईटन (डेनवर विश्वविद्यालय), डॉ गेराल्ड Rosen और डॉ यूसुफ पी काओ (मैरीलैंड विश्वविद्यालय), और डॉ सुजाता वेंकटरमण (कोलोराडो डेनवर विश्वविद्यालय) के लिए उपयोगी विचार विमर्श के लिए धंयवाद, और Joanne Maltzahn, एशले Trumpie और आइवी McDermott (कोलोराडो विश्वविद्यालय डेनवर) तकनीकी सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTech 10566-016 cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) Sigma Aldrich D6518-5G
sodium chloride (NaCl)  Fisher Scientific   BP358-212 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) Fisher Scientific   BP363-500 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) Sigma Aldrich P-5379 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB)  (Alfa Aesar, Hill) J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) Sigma Aldrich  S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Sigma Aldrich P1585-1MG Dissolve in DMSO
Antimycin A (AA) Sigma Aldrich A8674-25MG Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) Enzo Life Sciences ALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) Enzo Life Sciences ALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) Enzo Life Sciences ALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) Enzo Life Sciences ALX-430-131-M250
Heparin  Sagent Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride  Sigma Aldrich 43088
Deferoxamin mesylate salt Sigma Aldrich D9533-1G
Critoseal Leica 39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark Sigma Aldrich 708733 Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		 NORELL 1598774A Teflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR NORELL 94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer  Bruker BioSpin GmbH E7004002
EMX NANO TISSUE CELL Bruker BioSpin GmbH E7004542

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References

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जैव रसायन अंक १४३ इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पिन जांच CMH CPH मिळो-टेम्पो-एच सुपरऑक्साइड प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों nitroxide सुपरऑक्साइड dismutase polytetrafluoroethylene टयूबिंग
परिवेशी तापमान और ७७ K पर जैविक नमूनों में इलेक्ट्रॉन Paramagnetic अनुनाद का उपयोग
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Elajaili, H. B., Hernandez-Lagunas, L., Ranguelova, K., Dikalov, S., Nozik-Grayck, E. Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K. J. Vis. Exp. (143), e58461, doi:10.3791/58461 (2019).

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