Summary
כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).
Abstract
Erythroid תא מחויבות ובידול המשך ההפעלה של שושלת היוחסין מוגבלת לרשת תעתיק בניצוחו של קבוצה של גורל קביעת והתבגרותו גורמים. קודם לכן יצאנו כדי להגדיר את ערכת מינימלי של הגורמים הדרושים להדרכת התפתחות תאי הדם האדומים באמצעות ישיר לשושלת התכנות של fibroblasts לתוך erythroid המושרה אבות/מבשרי (iEPs). הראנו את ביטוי של Gata1, Tal1, Lmo2ו- c-Myc (GTLM) יכול במהירות להמיר מאתר ואנושי fibroblasts ישירות אל iEPs הדומים פיד ה בונה תאים erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים. בכוונתנו כי iEPs יספק כלי יקר ערך ללמוד אריתרופויזה ותא תקנה הגורל. כאן נתאר את תהליך stepwise המרת fibroblasts קצה הזנב מאתר iEPs דרך שעתוק מונחה גורם ישיר לשושלת התכנות (DLR). בדוגמה זו, אנו מבצעים את התכנות ב fibroblasts מן השושלת-עקיבה erythroid עכברים המבטאים החלבון הניאון צהוב (YFP) תחת השליטה של אריתרופויאטין קולטן ג'ין (EpoR) המקדם, המאפשר ויזואליזציה של תא erythroid אינדוקציה הגורל על התכנות. בעקבות פרוטוקול זה, שניתן לתכנת fibroblasts לתוך iEPs בתוך חמש עד שמונה ימים.
אמנם עדיין ניתן לבצע שיפורים לתהליך, אנו מראים כי בתיווך GTLM התכנות הוא תהליך מהיר וישיר, מניב תאים בעלי מאפיינים של פיד ה bona קדמון erythroid ותאי מבשר.
Introduction
תאי דם אדומים (RBCs) חיוניים כל החולייתנים ותשלימו 84% של כל התאים של הגוף האנושי1 מעובריים לחיים הבוגרים, הבריאות שלנו תלויה מאוד מדויק ההסדרה של RBC הומאוסטזיס. ייצור שוטף של בוגר RBCs במהלך פיתוח לבגרות מכונה אריתרופויזה. האתגר העיקרי במחקר אריתרופויזה הוא להגדיר הרגולטורים מאסטר זה שננהל את התפתחות RBC והבורר בין אריתרופויזה פרימיטיביים ומוחלטת. השושלת ישירה התכנות של אבות erythroid מהווה הזדמנות להבין עוד יותר erythroid פיתוח בתוך vivo.
השושלת ישירה התכנות (DLR), הידוע גם בשם transdifferentiation, הוא התהליך של התכנות סוג תא אחד ישירות לתוך אחר, תוך עקיפת pluripotent ושלבים קדמון multipotent. DLR שימש עד כה כדי לייצר סוגי תאים רבים כולל עצבית2,4,hematopoietic3,5, הכבד6 נפרוטית7, ובתאים. עבור ביולוגים התפתחותיים, DLR הפך כלי חשוב חוקר היבטים של שושלת היוחסין ומחויבות התמיינות סופנית תהליכים8,9. DLR ניתן להשלים ולהחליף חלקית ויוו ללימודי הבנה מנגנונים של גורל לקביעת גורמים במהלך הפיתוח. פרוטוקול DLR עבור התכנות אבות erythroid המתואר במאמר זה מספק השדה שיטה ללא תשלום עבור מחקרים התפתחותיים של אריתרופויזה.
בעבר הראו כי ביטוי קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר והן אנושיים ישירות אל erythroid המושרה אבות (iEPs) 10. erythroid היו GTLM תאים דומים במידה רבה bona פיד ה אבות erythroid פרימיטיבית במובן של ביטוי של מורפולוגיה, פנוטיפ, ג'ין-10. לפיכך iEPs מוגבלת יכולת התפשטות, התבגרת. דומים לאלו transiently מיוצר העובר מוקדם לפני התחלתה של אריתרופויזה סופית nucleated אריתרוציטים. על-ידי ביצוע שינויים בתנאים התיכנות (למשל, נקודת מוטציות בגן התכנות גורמים או גורמים אחרים), אפשר להבין איך זה יוביל לשינויים erythroid פיתוח ובידול. אנחנו למשל הראו כי תוספת של Klf1 או Myb GTLM במסיבת הקוקטייל משתנה התבנית ביטוי גלובין בעיקר עובריים (פרימיטיבי) כדי בעיקר למבוגרים (סופית). ממצא זה מאשר את החוקיות של השימוש DLR ככלי להגדרת גורמים התפתחותיים ב אריתרופויזה.
כאן, אנחנו חלוקה לרמות את התהליך של יצירת iEPs של עכבר זנב עצה fibroblasts (TTF). התוצאות נציג שלנו, ביצענו את התכנות על fibroblasts מן העכברים שושלת היוחסין-עקיבה erythroid (Epor- Cre R26- eYFP) אשר אקספרס החלבון הניאון צהוב (eYFP) של לוקוס Rosa26 כל התאים את זה הביעו את הקולטן אריתרופויאטין, המאפשר ויזואליזציה קל של מחויבות השושלת erythroid. באמצעות שיטה זו, YFP חיובי (EpoR +) תאים נוכחים מוקדם ככל חמישה ימים לאחר התמרה חושית. פרוטוקול זה, מציע לכן, טכניקה חזקה ומהירה לדור של erythroid אבות במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמה ותחזוקה של זנב העכבר הראשי עצה פיברובלסט תרבויות
- להכין מאכלים מצופים ג'לטין (ממליץ על צלחת 10 ס מ עבור אחד זנב) על ידי ציפוי המשטח 0.1% ג'לטין המקננת המנות למשך כ 20 דקות ב 37 º C. האחות הפתרון ג'לטין מתוך קערה ולאפשר לו להתייבש במשך שעתיים לפחות.
- המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם. להסיר את הזנב עם מספריים, חיתוך בבסיס הזנב. שים את הזנב ב- saline פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם 2% סרום שור עוברית (FBS) עד מוכן לשימוש.
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, זנבות צריך לקחת מן העכברים בסביבות גיל 6 עד 8 שבועות. ניתן לקחת מלוגנו עכברים שגילן עולה על 8 שבועות של גיל, עם זאת, כמו עידן עכברים, את יכולת התפשטות fibroblasts ואת היעילות של התכנות ירידה11זנבות. - ביצוע כל השלבים הבאים של פרוטוקול זה ברדס תרביות רקמה בתנאים סטריליים. להכין פתרון טריפסין מדוללת של 0.02% טריפסין-EDTA ב DPBS ולהוסיף 5 מ"ל לתוך צלחת נייר 10 ס מ.
- לשטוף את הזנב, תחילה ב-70% אתנול, ולאחר מכן ב- DPBS. בקערה, מניחים את הזנב שטוח ולהשתמש מלקחיים שיצמיד אותו למקום. לעשות חתך על הזנב לאורך ציר האורך מהבסיס לקצה.
- לתפוס את הזנב עם זוג מלקחיים והחזק אותו אנכית. באמצעות זוג מלקחיים השני, אחיזה על העור לצד החתך בבסיס של הזנב, לקלף אותו. לעשות זאת משני צידי החתך עד העור יכול לקלף ומשיכה כלפי מטה לכיוון קצה הזנב.
- החזק את הזנב קלופים עם מלקחיים מעל המנה המכיל את הפתרון טריפסין, לחתוך את הזנב לחתיכות כ 1 ס מ ארוך. את החתיכות הזנב בפתרון טריפסין, להשתמש במספריים קטע את החלקים לחתיכות קטנות יותר. דגירה החלקים הזנב בפתרון טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: קטן יותר החלקים המועדפות כדי לספק כל חתיכה פני שטח גבוהה יחס נפח. - להרוות את טריפסין באמצעות 2 כרכים של פיברובלסט הרחבה (את פליקס) בינונית (high-גלוקוז Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 15% FBS, 2 מ מגלוטמין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות (NEAA), 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין).
- לאסוף את כל התוכן של המנה לתוך שפופרת 50 מ ל צנטריפוגה ב × 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend השברים הזנב ב 10 מ"ל של מדיום את פליקס טריים.
- להעביר חלקים הזנב בינוני מאכל מצופה ג'לטין, דגירה-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 ו- 4% O2, הוספת בינוני את פליקס טריים כל יומיים.
הערה: לאחר חמישה עד שבעה ימים, הזנב שברי שיש המצורפת בתחתית של המנה, fibroblasts ניתן לראות מתרחק מהם. - ברגע אשכולות של fibroblasts הם הבחינו, לנער בעדינות את המנה כדי לסלק את הזנב חתיכות וארוקן את המדיום ואת כל שברי עצם עוזב את fibroblasts מחובר לצלחת. הוסף חדש בינוני את פליקס, תרבות של fibroblasts עד confluent.
- כדי להבטיח שום זיהום fibroblasts על ידי אבות hematopoietic, לבטל את התאים מהצלחת באמצעות טריפסין x 1-EDTA עבור 5 דקות ולאסוף את התאים. לרוקן עבור תאים המבטאים סמנים hematopoietic (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, אנטי-Gr-1 (Ly-6G/ג), 7-4, וטר-119) באמצעות מערכת הפרדה מגנטית10.
2. הרטרווירוס הפקה
- זרע אריזה retroviral תאים על 2.5 × 104 תאים/cm2 (2.0 × 106 תאים עבור תבשיל 10 ס מ) צלחת שטופלו תרביות רקמה (על-ידי ואקום-גז פלסמה) ותרבות לילה ב- high-גלוקוז DMEM עם 10% FBS, 10 מ מ נתרן פירובט, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין-CO 37 ° C ו-5%2.
- למחרת בבוקר, לשנות את המדיום DMEM עם תוספים לא באמצעות לחצי מנפח נהגה תרבות בין לילה (5 מ"ל על צלחת 10 ס מ). אחר הצהריים, בדוק התאים הם 70-80% confluent להתחיל על תרביות תאים.
- עבור כל גורם התיכנות, Gata1, Tal1, Lmo2, ו- c-Myc, להכין תערובת 2:1 של הביטוי וקטור (pMX), המסייע וקטור (המכיל גנים איסור פרסום ו pol). תבשיל 10 ס מ של fibroblasts, לשימוש µg 6 של הביטוי וקטור ו- 3 µg של המסייע וקטור בנפח סופי של 100 µL DMEM בינוני.
- עבור כל גורם התיכנות, להכין µL 300 בטמפרטורת החדר (RT) DMEM בשפופרת פוליסטירן סטרילי ולהוסיף בזהירות µL 27 של ריאגנט תקנים מסחרי.
הערה: הכימית תרביות תאים מוטב שינתן RT לפני השימוש, יש להוסיף ישירות לתוך המדיום כמו המאפיינים אלקטרוסטטית של המתחם יכול לעשות את זה להיצמד לקיר פלסטיק של הצינור. - להוסיף את תערובת פלסמיד לתוך תרביות תאים המכילים ריאגנט הצינורית, מערבולת בקצרה, דגירה התערובת ריאגנט-DNA תרביות תאים למשך 15 דקות ב- RT. בקצרה מערבולת התערובת ולהוסיף אותו dropwise התאים retroviral אריזה כך תרביות תאים מיקס ריאגנט-DNA אחיד מורחים את התרבות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- 24 שעות לאחר תרביות תאים, לשנות את המדיום DMEM עם 20% FBS ו פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין.... 48 שעות לאחר תרביות תאים, לאסוף את תגובת שיקוע ולסנן אותו דרך מסנן גודל הנקבוביות מזרק 0.22 מיקרומטר.
הערה: supernatants ויראלי יכול להיות קפוא-80 מעלות, נשמרים עד נדרש, למרות התמרה חושית יעילה יותר אם תגובת שיקוע ויראלי טרי משמש.
3. התמרה חושית GTLM ו- iEP קציר
- זרע הזנב עצה fibroblasts-1 × 104 תאים/cm2 ב- 0.1% ג'לטין מצופה מראש מנות במדיום את פליקס, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- למחרת, להכין תערובת התמרה חושית כדלקמן.
- להוסיף נפח 1 של תגובת שיקוע נגיפי עבור כל גורם התיכנות בתוספת 4 µg/mL של זיהום retroviral ריאגנט (40%) 6 כרכים של פליקס בינונית (60%).
- תבשיל 10 ס מ של fibroblasts, הוסיפו 1 מ"ל של כל תגובת שיקוע ויראלי (וירוסים × 4 = 4 מ"ל) בתוספת 4 µg/mL של זיהום retroviral ריאגנט 6 מ של בינוני את פליקס, נותן סך של 10 מ"ל התמרה חושית תערובת.
- וארוקן את פליקס בינוני מתרבות פיברובלסט ולהחליף אותו עם התערובת התמרה חושית. דגירה של התמרה חושית במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים ובשפתיים (5% CO2 ו- 4% O2).
- וארוקן את התערובת התמרה חושית ולהחליפו בינוני התיכנות טריים (ללא סרום הרחבה בינונית (SFEM), 100 U/mLPenicillin/סטרפטומיצין, 100 ננוגרם למ"ל תאי גזע מאתר פקטור (mSCF), 10 ננוגרם למ"ל מאתר אינטרלוקין-3 (IL3), 2 רקומביננטי האנושי U/mL אריתרופויאטין (hrEPO), ו- 100 ננומטר דקסאמתאזון).
- תקופת דגירה של יופי 8 37 מעלות צלזיוס בתנאים שתקבעו, הוספת בינוני התיכנות טריים כל יומיים. אחרי חמש-שמונה ימים, התכנות מוצלחת תניב אשכולות של תאים יש תלושים מהצלחת.
- כדי לאסוף מחדש תאים עבור ניתוח, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לקצור אותם ישירות מתוך קערה. הקציר fibroblasts untransduced להשוואה, לנתק את התאים מהצלחת באמצעות טריפסין x 1-EDTA ולאסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים עבור הייצור של iEPs מ fibroblasts למבוגרים באמצעות שעתוק מקדם מונחה-DLR פרוטוקול לשחזור. נוכל להעריך את התא התכנות באמצעות cytometry זרימה, המושבה יוצרי מבחני ג'ין ביטוי ניתוח. על מנת לסייע החזיית ההמרה לגורל erythroid, ביצענו את התכנות על fibroblasts מן העכברים שושלת היוחסין-עקיבה erythroid (Epor- Cre R26- eYFP) אשר מבטאים את החלבון הניאון צהוב (eYFP) מתוך מיקומה Rosa26 בתאים כל המבטאים את הקולטן אריתרופויאטין (Epor, Cre והגיון אלל אחד של מיקומה Epor אנדוגני) תעתיק בכל שלב של שלהם פיתוח12,13 ( איור 1A). לאחר התכנות מוצלחת של המושרה erythroid אבות, YFP חיובי (EpoR +) תאים הם מקהים מוקדם ככל חמישה ימים לאחר התמרה חושית. ביום 5 של התכנות, תאים יתעגל, הרם מפני השטח של הצלחת, להתחיל להרכיב אשכולות. יום 5-iEPs להציג מורפולוגיה קודמן דמוי erythroid, אשר כוללים גרעין מרכזי האופייני, כרומטין גס, עם ציטופלזמה כחולה לאחר מאי-גרונוולד-Giemsa מכתים (איור 1C). Hemoglobinization של כמה תאים מתבטא על ידי צביעת benzidine חיובי מראה במתינות אדום כאשר מגורען (איור 1D-E). בנוסף, חלק קטן של יום 5-iEPs אקספרס שיתוף YFP ו- the marker משטח ספציפי erythroid Ter119 (איור 1F). ביום 8, ניתן לראות YFP + אשכולות גדולים. יום 8iEPs להציג את הפנוטיפ erythroid הבדיל יותר מאשר יום 5 iEPs; הם קטנים משמעותית, צברו יותר המוגלובין, וגם להציג באופן משמעותי ביטוי upregulated של Ter119 (איור 1B–1 G). Cyto-ספינים של יום 8-iEPs לחשוף מורפולוגיה, כמו erythroid, בעוד reticulocytes enucleated מעטים מאוד הם נצפו (איור 1H).
ניתוח ביטוי גנטי על ידי כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של iEPs בתפזורת שייאסף יום 8 מראה כי הם כמעט כיבוי ביטוי של גנים פיברובלסט ויש upregulated גנים erythroid רבים כולל גנים גלובין, בעיקר סוגי עובריים לביטוי (איור 1אני). כדי להעריך אם התאים reprogrammed מעבר דרך אבות multipotent, אנחנו לבצע קורס זמן וניתח את הביטוי של סמנים hematopoietic לאורך כל התכנות. אנחנו בעבר דיווחו כי פלט קודמן erythroid הגבוה ביותר ביום 6, ואחריו יום 8, עם 10.5% ± 4.6% ו- 6.6% ± 0.5% YFP + תאים חיים משותפת להביע CD71 ו- Ter119, בהתאמה10. יש גם אוכלוסייה של CD41 תאים חיוביים לפני הופעתו של תאים חיובי Ter119. C-kit וגם סמנים CD45, אשר בדרך כלל לידי ביטוי קדמון hematopoietic ו downregulated ב אריתרופויזה, באים לידי ביטוי בשלב כלשהו התכנות (איור 1J). נתונים אלו מראים כי התאים אל תלך דרך קדמון hematopoietic multipotent או בשלב מוקדם יותר, אבל לעשות אולי המעבר דרך אב קדמון מגקריוציט-erythroid.
דרך אמינה כדי להעריך את היעילות של התיכנות הוא לבצע מבחני המושבה יוצרי BFU-E על תאים reprogrammed. במבחנה קיבולת בידול בין יום 5 - יום 8-iEPs היה לבדיקה ב methylcellulose בתוספת אריתרופויאטין אנושי גורם לתאי גזע מאתר, דקסמתזון. לאחר שמונה ימים, iEPs יצרו שני סוגים של מושבות: במובהק אדום (אדום iEP) ואת לא-בעליל אדום (אדום-iEP). בעוד תאים מן המושבות אדום מוצג erythroblast מורפולוגיה, תאים מן המושבות-אדום לא דמה erythroid תאים, היו לא סדיר, היה הציטופלסמה כחול עמוק, גרגרים גדולים (איור 2א).
של יום 5-iEPs, כ 1 ב- 1000 הקימו מושבות אדום, בעוד רק כ 1:10,000 יום 8-iEPs הקימו מושבות אדום, עם יחס גבוה יותר של הלא-אדום הקימו מושבות (איור 2B). בירידה זו המושבה יוצרי היכולת בין יום 5 - יום 8-iEPs יכול להיות מנומקת byiEPs שעברו התמיינות ימים 5-8, את הווקטורים ביטוי GTLM סבל להשתיק לאורך זמן. ניתוח qPCR אישר כי הביטוי של תמליל אקסוגני מקטין באופן משמעותי ימים 5-8. כצפוי ב התכנות מוצלחת, רמות הביטוי של אנדוגני Gata1, Tal1, Lmo2, ו c-Myc הם המושרה, עם זאת, הביטוי Lmo2 אנדוגני הוא רק מתעסקים ביטוי (איור 2C).
נקודה של הערה, מגבלה של וזמינותו, היא כי מושבות-אדום המכיל תאים דמויי מקרופאג עולים במספרם המושבות iEP hemoglobinized אדום הנוצרת על-ידי fibroblasts מחדש בתוך המושבה יוצרי מבחני. ניתן לשפר המושבה יוצרי היכולת ליצור מושבות iEP אדום על-ידי שינוי היחסים stoichiometric של גורמים GTLM. Transducing התאים עם כמות כפולה של וקטורים ביטוי Tal1 ו- Lmo2 הוביל עלייה קלה ביחס של מושבות אדום על מושבות-אדום, בעוד תוספת Gata1 הוביל לעליה משמעותית היווצרות של מושבות אדום ותמיכה כמעט חיסול מוחלט של מושבות-אדום את תפקיד חשוב עבור אלה גורמים אריתרופויזה (איור 2D). מעניין, הגדלת הביטוי של c-Myc באופן דרסטי מגדיל את הייצור של מושבות-אדום למרות היותו חיוני עבור התכנות. כדי להשיג טהור erythroid המושרה אבות לניתוח במורד הזרם, מושבות יכול להיות מבודד מבחני המושבה יוצרי. ביצענו ניתוח ביטוי גנטי בצורת microarray על האדום ורשום מושבות-אדום מיום 5-iEPs ועל מושבות מהימים 14.5 משגל (dpc) העובר בכבד (פל), מח עצם למבוגרים (מוניטור) להשוואה. הנתונים microarray הינם נגישים באמצעות Omnibus ביטוי גנים של NCBI (GEO): GSE73344. אנחנו הראו בעבר כי מושבות אדום-iEP דומים המושבות erythroid פיד ה bona (פל ו מוניטור) על-ידי ביטוי גנים10. בחינת הביטוי של Gata1, Tal1, Lmo2, ו- c-Myc במושבה כל מראה כי בעוד המושבות אדום מציגים רמות דומות של ביטוי של כל הגורמים 4 FL, מוניטור, מושבות-אדום יש ביטוי נמוך כל הגורמים, במיוחד Gata1 (איור 2E). כדי להבין מה המושבות-אדום המכיל תאי מקרופאג דמוי הם, אנחנו סקר את הביטוי של גנים ייחודיים לסוג התא בכל אחד מסוגי המושבה מתוך נתוני microarray. כפי שדווח בעבר, המושבות אדום מבטאים גנים ספציפיים erythroid רבים, דומה לזה של חליל, מוניטור. לאחר ביקור חוזר הנתונים, ברור כי המושבות-אדום מראים ביטוי גבוהה של מספר גנים האופיינית של תאי מקרופאג14 (איור 2F). מושבות לא אדום ולא -אדום מראים ולעלייה משמעותית ביטוי של גנים מגקריוציט אופייני15. יחד, נתונים אלה מראים כי המושבות-אדום להידמות יותר מקרופאגים מאשר אריתרוציטים. מאז מושבות-אדום לא נצפתה כאשר אחד הגורמים GTLM מוסרים תאי מקרופאג דמוי אלה נראה להיווצר כאשר רמות הביטוי של אחד או יותר של הגורמים התיכנות Gata1, Tal1, Lmo2 נמוך יותר נדרש עבור התכנות כדי iEPs. יחד, הדבר מצביע על רמות ביטוי של כל ארבעת הגורמים GTLM הם חשובים ב- TTF iEP התכנות, כי הטרוגניות מוסבר על ידי לא שלם תכנות מחדש של תאים בודדים, אשר פוטנציאל ניתן לתקן על ידי התאמת יחסי stoichiometric.
כדי להעריך את היעילות ואת החוסן של פרוטוקול שלנו, בדקנו את היכולת של מספר קבוע של fibroblasts להפיק אשכולות גלוי של תאים iEP לאחר 5 ימים כאשר תרבותי ב- 384-ובכן צלחות. קבענו כי מתוך 24 transductions של 20, 30, 40 ו- 50 TTFs, המספר של וולס עם אשכול iEP אחד לפחות היה 3 (0.6% הצלחות fibroblasts), 15 (2.0% הצלחות fibroblasts), 15 (1.6% הצלחות fibroblasts) ו 13 (1.1% הצלחות fibroblasts) , בהתאמה. הדבר מצביע על כי GLTM iEP התכנות הוא תהליך עמיד ואמין שיכול להגיע יעילות של 1%.
גורמים אחרים שיכולים להשפיע על יעילות של התכנות כוללים את המעבר מספר את fibroblasts ואת התנאים תרבות. השווינו את יעילות התיכנות של TTFs זה היה כבר passaged שלוש פעמים או תשע פעמים לפני התמרה חושית. TTFs זה היה כבר passaged תשע פעמים (P9) הראו הפחתה דרמטית היכולת לייצר אשכולות של iEPs (איור 3א). מעניין, הכללת סרום בתקשורת התיכנות לחלוטין בלוקים התכנות, סרום בהחלפה עם ציטוקינים erythroid יש צורך לאפשר את הגורמים transduced לנהוג את גורל התא החדש בלי אותות החישוב של הנסיוב. הסרה של הסרום הביטוי של גורמים חדשים בתוך התא הוא עשוי להיות מלחיצה על התאים. אכן, חסימת p53 הפעלה מאוד גדל מספר iEPs שנוצר. ניתן לראות את האפקט הזה ב התכנות של p53 נוקאאוט fibroblasts (איור 3B-D). עיכוב של p53 איתות מוביל יותר תא הישרדות, כדאי התכנות, הוא אחד המאומת שיטה לשיפור התשואה. לבסוף, התכנות בתנאים ובשפתיים היא חיובית אבל לא חיוני לייצור iEP. עם זאת, בתרבית ב- normoxia transduced TTFs הרבה יותר איטית לתכנת, iEP אשכולות שנצפו לאחר 10 ימים במקום חמישה עד שמונה ימים (איור 3E).
איור 1 : ביטוי מאולץ של Gata1, Tal1, Lmo2, ו c-Myc תיכנות מחדש מאתר fibroblasts למבוגרים לתוך אבות erythroid אשר התערוכה מאפיינים של bona פיד ה erythroid תאים. (א) עיצוב ניסיוני עבור שעתוק בתיווך גורם התכנות של הכתב erythroid (Epor-Cre R26-eYFP) זנב עצה fibroblasts (TTF) לתאים EpoR + מחדש. (B–F) קורס iEP הדור של untransduced TTFs (יום 0) והזמן בצובר TTFs GTLM-transduced בימים 5 ו- 8 (נציג של n = 2-3). Transdifferentiation הוערך על ידי תמונות תאים חיים, בהיר-שדה (B) של בארות יחיד (סולם בר, 50 מיקרומטר); (ג) - Giemsa של מאי-גרונוולד מכתים cyto-ספין (סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר); (ד) Benzidine/Giemsa מכתים cyto-ספין (סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר); בדיקה מאקרוסקופית (E) של כדורי תא; ומתכנן cytometry זרימה נציג (נ) מציג YFP / ביטוי Ter119. (G) תא בקוטר של iEPs שנקטפו בימים 5 ו- 8 נמדד מאמצע כמה שקופיות cyto-ספין, מראה ירידה גודל תא ביום 8. הנתונים מוצגים אומר ± SD (n = 21-25); p ≤ 0.0001 מאת אינטראקצית t-מבחן. (H) נציג ברזולוציה גבוהה benzidine/Giemsa תמונות של GTLM-transduced TTFs ביום 8. בר בקנה מידה, 5 מיקרומטר. (א) mRNA היחסי ביטוי של גנים הרלוונטיים פיברובלסט erythroid ספציפיים או כולל גנים גלובין בכמויות untransduced TTFs (עמודות אפור) לעומת GTLM-transduced TTFs (אדום עמודות) ביום 8, נקבעים על-ידי qPCR. הנתונים מוצגים אומר ± SD (n = 4-6 עבור iEPs, n = 2 עבור untransduced TTFs). גרף (J) מציג סיכום של ניתוח cytometry זרימה זמן-קורס של untransduced TTF (יום 0) ו בצובר GTLM transduced TTF נקצרו יום 2, 4, 6 ו 8 מראה ביטוי YFP, CD45, CD71, Ter119 (n = 3). הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SD. איור ממאמרו של S Capellera-גרסיה, ואח. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : GTLM iEPs לייצר מושבות-אדום ואדום מבחני המושבה BFU-E. (א) cytospin בהיר-שדה, מאי-גרונוולד-Giemsa נציג תמונות של הלא-אדום ואדום נגזר iEP מושבות. גודל ברים, 50 מיקרומטר (המושבה תמונות) ו- 10 מיקרומטר (ספין-cyto תמונות). (B) סעיפים המושבה המופקים TTFs untransduced מצופים, לרשימת תפוצה יום 5 iEPs, לרשימת תפוצה יום 8. הנתונים מוצגים אומר ± SD (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0.0001 מאת אנובה דו-כיווני. (ג) ביטוי mRNA היחסי של Gata1, Tal1, Lmo2, ו- c-Myc untransduced TTF, בצובר TTF GTLM transduced נקצרו ביום 5 וביום 8, נקבעים על-ידי qPCR. תחל תוכננו כך ביטוי אנדוגני יכול להבחין בין הביטוי הכולל. הנתונים מוצגים אומר ± SD (n = 4-6 עבור iEPs, n = 2 עבור untransduced TTF). (ד) סעיפים המושבה המופקים מצופה בכמות גדולה והיום untransduced TTFs 5 iEPs שנוצר על ידי הכפלת את היחס של כל אחד מהגורמים GTLM. הנתונים מוצגים אומר ± SD (n = 3); * * p ≤ 0.001; p ≤ 0.0001 מאת אנובה דו-כיווני. (E) ביטוי היחסי של Gata1, Tal1, Lmo2, ו- c-Myc untransduced fibroblasts, מושבות שנאספו המופקים iEPs GTLM-transduced (אדום ואדום), הכבד עוברית dpc 14.5 ועצם למבוגרים מח, נקבע על ידי microarray. הנתונים מוצגים אומר ± SD; * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0.0001 מאת אנובה דו-כיווני. (נ) ביטוי היחסי של הגנים שנבחר ידועה לביטוי ב- erythroid (למעלה), מגקריוציט (באמצע) ו מקרופאג (למטה) בתאים untransduced fibroblasts ועל מושבות שנאספו המופקים iEPs GTLM-transduced (אדום ואדום), 14.5dpc מח העצם למבוגרים, נקבע על ידי microarray וכבד בעובר. הנתונים מוצגים אומר ± SD; * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0.0001 מאת אנובה דו-כיווני. נתון זה ממאמרו של גרסיה Capellera S, et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : GTLM התכנות הוא תהליך עמיד ואמין. (א) גרף של מספר אשכולות נצפתה מ 10,000 TTFs ותמונות הנציגה ביום 5 של GTLM התכנות של הזנב עצה fibroblasts (TTF) שעברו שלושה מעברים (P3) או תשעה קטעים (P9) לפני התכנות. הנתונים מוצגים אומר ± SD (n = 6); גודל ברים הם 50 מיקרומטר. (B–D) תמונות נציג של iEP אשכולות 6 ימים לאחר GTLM (B) התכנות של הזנב עצה fibroblasts; (ג) GTLM תכנות מחדש של TTFs עם תוספת של p53DN ביטוי וקטור; (ד) GTLM התכנות של p53 נוקאאוט TTFs (גודל ברים = 50 מיקרומטר). (ה) נציג תמונות של אשכולות iEP לאחר 10 ימים GTLM התכנות בנטילת normoxic תנאים (סולם בר = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביטוי של קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר ואנושי ישירות אל iEPs10. התאים היו erythroid דמה מאוד בונה פיד ה אבות erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים ויכולת המושבה יוצרי. ממצא זה אם יאשר הרציונל של שימוש ישיר התכנות ככלי להגדרת גורמים התפתחותיים ב- hematopoiesis. כדי לתמוך את תוקפו של שיטה זו, iEPs גם ניתן להפיק באמצעות אינדוקציה GTLM של העכבר מתחלקים fibroblasts ו fibroblasts העורלה אנושי, מראה כי זה עובד עבור fibroblasts של מקורות שונים, על פני מינים10. בדו ח זה, אנחנו מתחילים התכנות של fibroblasts מהעכבר שושלת היוחסין-עקיבה erythroid ככלי להמחיש את ההמרה תא erythroid. השימוש העכבר הזה הוא שימושי, אבל לא קריטי לפרוטוקול. אנו באופן שגרתי לבצע התכנות באמצעות מספר סוגים של פיברובלסט מפני זנים שונים של העכבר, לזהות iEPs על-ידי ביטוי סמן משטח תאים Ter119 CD71.
השיטה הנוכחית שלנו מייצר iEPs כי התערוכה הפנוטיפ פרימיטיביים erythroid בניגוד למבוגרים הפנוטיפ סופית. הבדל עיקרי אחד בין אלה שלבי הפיתוח הוא הביטוי של גנים שונים גלובין. אולם, אנחנו הראו כי תוספת של Klf1 Myb לתבנית ביטוי גלובין 'iEPs שינויים קוקטייל GTLM מ מתחלקים בעיקר כדי בעיקר למבוגרים10,14. מעניין, תוספת של Gata2 ו- Runx1 4-factor קוקטייל, thrombopoietin במדיום biases תהליך התיכנות לכיוון ה16של השושלת megakaryocytic.
IEPs GTLM-induced לייצר erythroid אבות עם חתימה של ביטוי גנים פרימיטיבי, קיבולת proliferative מוגבלת. יתר על כן, iEPs לייצר אריתרוציטים enucleated מעט מאוד. הרחבת קדמון erythroid המסכן מוסברת על-ידי הכשל לתכנת לתאים קיט + erythroid מוחלטת, אשר ניתן להשיג באופן פוטנציאלי עם גורמים אחרים גרימת התכנות ישיר כדי iEPs עם ביטוי גנים סופית תוכנית.
הנתונים שלנו מציע גם יעילות המסכן העקירה היא מוסברת על ידי העובדה iEPs GTLM-induced ליצור סימנים מקדימים עם אדם פרימיטיבי, יותר מאשר תוכנית ביטוי גנים סופית. מספר ניסיונות אופטימיזציה של תרבות בתנאים שהיו ניסיונות ללא העקירה משופרת. נסיונות מתמשכים כדי להגדיל את תפוצת שני קדמון ויעילות העקירה מתמקדים לפיכך בזיהוי גורמים חסרים עבור גרימת התכנות כדי iEPs סופית.
לייצור אופטימלית של מושבות iEP אדום, היא חיונית, כי התאים הם transduced עם כל ארבעת כיווני, GTL הגנים באים לידי ביטוי ברמה גבוהה. לצערי השיטה היעילה ביותר כיום אינו מאפשר שליטה מוקדמת של וקטור titers. בניסיון לשפר את היעילות באמצעות וקטורים lentiviral bicistronic היה לא מוצלח, כנראה עקב בעיות עם סטויכיומטריה נחות או רמות הביטוי לא מספיק. בעוד עבודה מתמשך לשיפור וקטורים התיכנות, השרידים השיטה היעילה ביותר באמצעות שילובים של טרי הפיק תגובת שיקוע וקטור עם הווקטורים retroviral שתואר לעיל לבטא גורם אחד בלבד, אין גן סמן הבחירה.
GTLM התכנות כדי iEPs הוא פרוטוקול דיווח רק מסוגל לייצר erythroid קדמון, כמו תאים מתא סומטיים מחויבת. כמו שיטה iEP כלי ה-DLR מחקר ולכן יש כמה יתרונות על פני השני erythroid תא דגם מערכות כגון התא erythroid שורות תאים HiDEPs/HuDEP (רמב"ם: 23533656)17. בעוד HiDEPs/HuDEP תאים הם כלי נוח יותר עבור ייצור כדוריות דם אדומות בקנה מידה גדול, הערכת תפקוד הגן במהלך אריתרופויזה מסוף, היתרון הייחודי של GTLM התכנות כדי iEPs היא היכולת ללמוד ישירות של גרעין תוכניות תעתיק קביעת גורל התא erythroid. GTLM התכנות מספק פלטפורמה שלא יסולא בפז ללמוד אריתרופויזה שני בני אדם, עכבר, לדוגמה, ללמוד את הבורר בין אריתרופויזה פרימיטיביים ומוחלטת. הבנת בורר זה היא עניין עצום בטיפול פוטנציאלי של פתולוגיות של המוגלובין, כגון האנמיה החרמשית, שבו חוקרים שואפים להפוך את המתג במבוגרים כדי המוגלובין עוברית כדי להקל על המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לדווח.
Acknowledgments
אנו מודים אוולין וואנג והייד גרגורי (מכון וייטהד, Cambridge, MA) על שיבוט, הארווי Lodish (מכון וייטהד) למתן רבים פלסמידים משמש ליצירת ספריית retroviral. אנו מודים Kavitha Siva, סופי Singbrant (המחלקה לרפואה מולקולרית, ריפוי גנטי, אוניברסיטת לונד), גוראן קרלסון, סאנג'י שמיט (המחלקה להמטולוגיה מולקולארית, אוניברסיטת לונד) על תפקידיהם בתיאור של ייצור iEP. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ג'וליאן Pulecio (מרכז של רפואה רגנרטיבית, ברצלונה פארק מחקר ביו-רפואית), ויולטה זהורית-אסטרדה (רוקפלר אוניברסיטה, ניו יורק), קארל Walkley (המכון למחקר רפואי סנט וינסנט, מחלקת רפואה, בית החולים סנט וינסנט, אוניברסיטת מלבורן), רעיה אנחל (קטלאנית במוסד לחולי ומחקר ללימודים מתקדמים, ברצלונה), ענבר G. עמי הולצמן (מכון רחבה של מכון מסצ'וסטס של טכנולוגיה, הרווארד, קיימברידג ) על תרומתם קודמת לעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי קרן Söderberg רגנר (כדי ג'יי); מחקר שוודי המועצה (כדי ג'יי); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (כדי ג'יי); העמותה השבדית לחקר אסטרטגי (כדי ג'יי); הקרן של אקא Wiberg (כדי ג'יי); מענק אינטגרציה מארי קירי (כדי ג'יי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
