Summary
Здесь мы представляем наши протокол для производства индуцированной эритроидные предшественники (ПРП) от взрослых фибробласты мыши с помощью транскрипции управляемый фактор прямой линии перепрограммирования (DLR).
Abstract
Эритроидных клеток приверженность и дифференциации перейти через активацию линии ограничена транскрипционный анализ сети, организованные группы клеток судьбы, определение и созревания факторов. Ранее мы намерены определить минимальный набор факторов, необходимых для инструктажа развития красных кровяных клеток, используя прямой линии перепрограммирования фибробластов в индуцированной эритроидные предшественники/прекурсоров (ПРП). Мы показали что Сверхэкспрессия Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc (GTLM) можно быстро преобразовать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП, которые напоминают bona fide эритроидные клетки с точки зрения морфологии, фенотип, и экспрессии генов. Мы планируем, что ПРП будет предоставлять бесценным инструментом для изучения эритропоэза и клетка судьба регулирования. Здесь мы описываем процесс поэтапного преобразования мышиных хвостовой оконечности фибробластов в ПРП через транскрипционным фактором driven прямой линии перепрограммирования (DLR). В этом примере мы выполняем перепрограммирования в фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные, которые выражают желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) под контролем промотора гена (EpoR) рецепторов эритропоэтина, позволяя визуализации эритроидные клетки Судьба индукции после перепрограммирования. После этого протокола фибробласты могут быть перепрограммированы в ПРП в течение пяти до восьми дней.
В то время как еще можно улучшить процесс, мы показывают, что GTLM-опосредованной перепрограммирования быстрый и прямой процесс, уступая клетки с свойствами bona fide эритроидные клетки предшественники и прекурсоров.
Introduction
Красные кровяные клетки (эритроциты) важны для всех позвоночных и составляют 84% от всех клеток тела человека1. Из эмбриональных к взрослой жизни наше здоровье сильно зависит от точной регуляции гомеостаза РБК. Текущего производства зрелых эритроцитов на протяжении развития в зрелом возрасте известен как эритропоэза. Серьезной проблемой в эритропоэза исследования заключается в определении главных регуляторов, которые оркестровать РБК развития и переключение между примитивными и окончательного эритропоэза. Прямой линии перепрограммирование эритроидные предшественники представляет возможность для более глубокого понимания эритроидные развития в естественных условиях.
Прямой линии перепрограммирования (DLR), также известный как transdifferentiation, является процесс перепрограммирования один тип ячейки непосредственно в другой, минуя плюрипотентных и Multipotent с прародителем этапов. DLR до настоящего времени был использован для создания многочисленных типов клеток, включая нейронные2, гемопоэтических3,4,5, печеночная6 и нефротическим7, клетки-предшественники. Для развития биологов DLR стал важным инструментом для допрос аспекты приверженность линии и терминала дифференциация процессы8,9. DLR может дополнять и частично заменить в vivo исследований для понимания механизмов судьбы клетки, определяющих факторов во время разработки. DLR протокол для перепрограммирования эритроидные предшественники, описанных в данном документе предоставляет поле бесплатный метод для развития исследований эритропоэза.
Ранее мы показали, что гиперэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к индуцированных эритроидные предшественники (ПРП) 10. GTLM-перепрограммирование эритроидных клеток сильно напоминают bona fide примитивных эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип и ген выражение10. Таким образом ПРП имеют ограниченный потенциал распространения и зрелые ядерных эритроцитов аналогичны временно производится в начале эмбриона до начала окончательного эритропоэза. Внеся изменения в перепрограммирования условиях (например, точечные мутации в перепрограммировании факторов или добавление других факторов), можно понять как это приводит к изменениям в развитии эритроидные и дифференциации. Мы например показали, что добавление Klf1 или Myb на GTLM коктейль изменяет Глобин выражения от преимущественно эмбриональных (примитив) в основном взрослых (окончательный). Этот вывод подтверждают обоснованность использования DLR в качестве инструмента для определения развития факторов в эритропоэза.
Здесь мы приводим процесс генерации ПРП от мыши хвостовой оконечности фибробластов (TTF). В результаты нашего представителя, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor- Cre R26- eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентный белок (eYFP) от Rosa26 Локус во всех клетках, выразили рецепторов эритропоэтина, позволяя легко визуализации приверженность линии эритроидные. С помощью этого метода, рекламы ЯФП позитивные (EpoR +) клетки присутствуют пять дней после передачи в кратчайшие сроки. Этот протокол, таким образом, предлагает быстрый и надежный метод для генерации эритроидные предшественники в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание и поддержание хвост мыши Совет культуры фибробластов
- Готовить блюда желатин покрытием (рекомендуем 10 см блюдо для одного хвоста), покрывая поверхность с 0,1% желатина и инкубации блюда для примерно 20 минут при 37 ° C. Аспирационная раствор желатина из блюдо и дайте ему высохнуть в течение не менее 2 ч.
- Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Удалите хвост с ножницами, резка у основания хвоста. Положите хвост в Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) до готовой к использованию.
Примечание: Для достижения наилучших результатов, хвосты следует от мышей возрасте около 6-8 недель. Хвосты могут быть взяты из мышей, старше 8-недельного возраста, однако, как возраст мышей, возможность распространения фибробластов и эффективности перепрограммирования уменьшение11. - Выполните все последующие действия настоящего Протокола в культуре ткани капюшоном в стерильных условиях. Приготовляют раствор трипсина разреженных 0,02% трипсина-ЭДТА в DPBS и добавьте 5 мл в блюдо без покрытия 10 см.
- Вымойте хвост, сначала в 70% этанола, а затем в DPBS. В блюдо хвост плоский и использовать пинцет, чтобы удерживать его на месте. Сделайте надрез на хвост вдоль его продольной оси от основания до кончика.
- Возьмите хвост с одной парой щипцов и держать его вертикально. Используя вторую пару щипцов, сцепление кожи рядом с разрез у основания хвоста и чистить его обратно. Сделать это в обе стороны разреза до тех пор, пока кожа может быть снимают, потянув вниз к кончик хвоста.
- Держите очищенные хвост пинцетом над блюдо, содержащих раствор трипсина и отрезать хвост кусочками примерно 1 см длиной. С хвоста штук в раствор трипсина используйте ножницы, чтобы фрагмент частей на более мелкие куски. Инкубируйте хвост кусочки в раствор трипсина при 37 ° C за 10 мин.
Примечание: Чем меньше штук предпочтительны обеспечить каждый кусок высокое отношение площади поверхности к тома. - Утолить трипсина, используя 2 тома фибробластов расширения (ФЕКС) среды (высокий глюкозы Дульбекко изменения Eagle среднего (среде DMEM) с 15% FBS, 2 мм L-глютамином, Non-essential аминокислоты (NEAA) и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина).
- Собрать все содержимое блюдо в 50 мл трубки и центрифуги на 350 × g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте хвост фрагментов в 10 мл свежего ФЕКС среды.
- Передать желатин покрытием блюдо хвост фрагментов в средних и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 и 4% O2, добавляя свежий ФЕКС среднего каждые 2 дня.
Примечание: После пяти до семи дней, хвост фрагменты придают в нижней части блюда и может рассматриваться фибробластов, удаляясь от них. - После того, как заметили кластеры фибробластов, осторожно встряхните блюдо, чтобы выбить хвост кусочки и аспирационная средне- и все фрагменты костей, оставляя фибробластов, прикреплены к плите. Добавить новое средство ФЕКС и культуре фибробластов до притока.
- Чтобы не загрязнение фибробластов, кроветворные прародителями, отделить клетки от пластины с помощью 1 x трипсина ЭДТА на 5 минут и собирать клетки. Разрушающим клетки, выражая гемопоэтических маркеры (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, анти-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 и тер-119) с помощью системы магнитной сепарации10.
2. ретровируса производство
- Семя ретровирусной упаковка клетки на приблизительно 2,5 × 104 клетки/см2 (2.0 × 106 клеток для 10 см блюдо) на культуре ткани лечили (вакуум газовой плазмы) блюдо и культуры на ночь в среде DMEM высокой глюкозы с 10% FBS, 10 мм натрия Пируват и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина при 37 ° C и 5% CO2.
- На следующее утро измените среде DMEM без добавок, используя половину объема используется для культуры на ночь (5 мл на 10 см блюдо). В послеобеденное время проверьте, что клетки 70-80% притока и начинают transfection.
- Для каждого перепрограммирования фактор Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc, приготовить смесь 2:1 выражение вектор (pMX) и вспомогательные вектора (содержащие гены кляп и ГСМ). Для 10 см блюдо фибробластов используйте 6 мкг вектора выражения и 3 мкг, вспомогательные вектора в окончательном объеме 100 мкл в среде DMEM.
- Для каждого перепрограммирования фактора подготовить 300 мкл комнатной температуры (RT) DMEM в стерильную пробирку полистирола и тщательно 27 мкл Реагента коммерческих transfection.
Примечание: Трансфекции реагент должны быть доведены до RT перед использованием и должны быть добавлены непосредственно в среду, как электростатические свойства соединения можно сделать его придерживаться стенку пластиковой трубки. - Добавить смесь плазмида в трансфекции реагент содержащих трубу, вихревой кратко и инкубировать трансфекции реагент ДНК смесь 15 мин на RT. кратко вихревой смесь и добавить его каплям ретровирусной упаковка клетки так, что Трансфекция Реагент ДНК смесь равномерно распределяется по культуре и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
- 24 ч после трансфекции, изменить среде DMEM с 20% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. 48 ч после трансфекции, собирать супернатант и процеживают через фильтр шприц размер пор 0,22 мкм.
Примечание: Вирусный supernatants могут быть заморожены до-80 ° C и держали до тех пор, пока требуется, хотя трансдукции является более эффективным, если используется свежих вирусных супернатант.
3. GTLM трансдукция и iEP урожай
- Семян, хвост отзыв фибробластов в 1 × 104 клетки/см2 на 0.1% желатина предварительно покрытием Посуда в среде ФЕКС и инкубировать при 37 ° C в течение 24 ч.
- Следующий день трансдукции смесь готовят следующим образом.
- Добавьте 1 объем вирусных супернатант для каждого перепрограммирования фактора, дополнена 4 мкг/мл реагента ретровирусной инфекции (40%) 6 томов ФЕКС среды (60%).
- Для 10 см блюдо фибробластов, добавляют 1 мл каждого вирусный супернатант (4 × вирусов = 4 мл) дополнены 4 мкг/мл реагента ретровирусной инфекции до 6 мл среды ФЕКС, давая в общей сложности 10 мл смеси трансдукции.
- Аспирационная ФЕКС среднего от культуры фибробластов и заменить его смесью трансдукции. Инкубируйте трансдукции за 4 ч при 37 ° C в гипоксических условиях (5% CO2 и 4% O2).
- Аспирационная трансдукции смесь и заменить его на свежий перепрограммирования среднего (Serum-free расширение среднего (SFEM), 100 U/mLPenicillin/стрептомицина, 100 нг/мл мышиных стволовых клеток фактора (mSCF), 10 нг/мл мышиных интерлейкина-3 (уровня IL3), 2 человеческого рекомбинантного ед/мл Эритропоэтин (hrEPO) и 100 Нм дексаметазон).
- Инкубируйте 8 daysat 37 ° C в гипоксических условиях, добавляя свежий перепрограммирования среднего каждые 2 дня. После пяти до восьми дней успешного перепрограммирования даст кластеры клеток, которые отсоединены от пластины.
- Чтобы собрать перепрограммировать клетки для анализа, мягко вверх и вниз Пипетка собирать их непосредственно из блюдо. Урожай untransduced фибробласты для сравнения, отделить клетки от пластины с помощью 1 x трипсина ЭДТА и собирать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем воспроизводимый протокол для производства ПРП от взрослых фибробластов, с помощью транскрипции фактор driven DLR. Мы оцениваем перепрограммирования клетки, с помощью проточной цитометрии, образуя колонии анализов и гена анализ выражения. Чтобы помочь в визуализации преобразования эритроидных клеток судьбы, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor- Cre R26- eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентный белок (eYFP) от Rosa26 Локус во всех клетках, которые выражают рецепторов эритропоэтина (Epor, КРР, постучал в один аллель эндогенный Локус Epor ) Стенограмма на любой стадии их развития12,13 ( Рисунок 1A). После успешного перепрограммирования индуцированной эритроидные предшественники, рекламы ЯФП позитивные (EpoR +) клетки наблюдаются через пять дней после передачи в кратчайшие сроки. День 5 перепрограммирование, клетки становятся раунд снять с поверхности пластины и начать формирование кластеров. День 5-ПРП отображения эритроидные прекурсоров как морфологии, что функция характерным центрального ядра, грубый хроматина и синий цитоплазмы после мая-Грюнвальда-Гимза окрашивание (рис. 1C). Hemoglobinization некоторых клеток очевидны положительные бензидин окрашивание и слегка красный внешний вид, когда гранулированных (Рис. 1 d-E). Кроме того, небольшая часть дня 5-ПРП Сопредседатель Экспресс рекламы ЯФП и поверхности маркер эритроидные конкретных Ter119 (Рисунок 1F). День 8 можно увидеть большой рекламы ЯФП + кластеры. День 8iEPs представляют более дифференцированной эритроидные фенотип чем день 5 ПРП; они значительно меньше, накопили больше гемоглобина, а также показать значительно upregulated выражение Ter119 (рис. 1B–1 G). Цито закрутки день 8-ПРП раскрыть эритроидные как морфология, хотя очень немногие enucleated ретикулоцитов наблюдаются (рис. 1H).
Анализ выражения гена количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) о массовых ПРП, собранных на 8 день показывает, что они имеют почти выключения экспрессии генов, фибробластов и upregulated многих эритроидные генов, включая Глобин генов, преимущественно выражая эмбриональных типов (рис. 1я). Чтобы оценить ли перепрограммировать клетки перехода через Multipotent с прародителями, мы выступали время курс и проанализированы выражение гемопоэтических маркеров на протяжении перепрограммирования. Мы ранее сообщали, что эритроидные прекурсоров вывода был высоким в день 6, следуют день 8, с 4,6% ± 10,5% и 6,6% ± 0,5% живой рекламы ЯФП + клеток совместно выражая CD71 и Ter119, соответственно10. Существует также население CD41 позитивных клеток до появления Ter119 клеток. C комплект ни CD45 маркеров, которые обычно выражаются в гемопоэтических предшественников и downregulated в эритропоэза, выражаются в любой точке перепрограммирования (рис. 1J). Эти данные позволяют предположить, что клетки не идут через Multipotent с гемопоэтических предшественников или более ранней стадии, хотя сделать возможно переход через мегакариоцитов эритроидные предшественники.
Надежный способ оценить эффективность перепрограммирования — для выполнения анализов образуя колонии BFU-E на перепрограммировать клетки. В vitro дифференциации возможностей день 5 - и день 8-ПРП был assayed в метилцеллюлоза, дополненная человеческого эритропоэтина, мышиных стволовых клеток фактора и дексаметазона. После 8 дней, ПРП сформировали два вида колоний: отчетливо красный (красный iEP) и не заметно красный (iEP-красный). В то время как из красного колоний ячеек erythroblast морфологии, клетки от колоний-красный не напоминают эритроидные клетки и были нерегулярные, имел большой глубокий синий и гранулированный цитоплазмы (рисA).
День 5-ПРП приблизительно 1 на 1000, формируемых красный колоний, в то время как только приблизительно мэм день 8-ПРП сформировали красный колоний, с коэффициентом гораздо выше-красный колонии сформированы (рис. 2B). Это сокращение в колонии формирование способности между день 5 - и день 8-ПРП может быть объяснено byiEPs, происходят дифференциация от дней 5-8 и векторы выражения GTLM, страдания, глушителей со временем. ПЦР анализ подтвердил, что выражение экзогенных Стенограмма значительно уменьшается от 5 до 8 дней. Как ожидалось в успешного перепрограммирования, индуцированной выражение уровня эндогенного Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc , однако, эндогенного Lmo2 выражение только очень скромное выраженной (рис. 2C).
Точки следует отметить и ограничение анализа, является колоний-красный, содержащих Макрофаг как клетки превышает число колоний красной hemoglobinized iEP, образованный перепрограммировать фибробластов в формировании колонии анализов. Образуя колонии возможность создания Красной iEP колонии могут быть улучшены путем изменения стехиометрические коэффициенты GTLM факторов. Преобразователя клетки с удвоить количество векторов выражения Tal1 и Lmo2 привело к незначительное увеличение соотношения красного колоний над колониями-красный, в то время как дополнительные Gata1 привело к значительному увеличению в формировании красных колоний и почти полная ликвидация-красный колоний поддерживает важную роль этих факторов в эритропоэза (Рисунок 2D). Интересно, что увеличение выражение c-Myc резко увеличивает производство-красный колоний, несмотря на то что незаменимым для перепрограммирования. Чтобы получить индуцированных чистой эритроидные предшественники для анализа ниже по течению, колонии могут быть изолированы от колонии формируя assays. Мы провели анализ выражения гена в виде microarray дна на красный и -красный колоний от день 5-ПРП и колоний от 14,5 дней коитус (dpc) фетальной печени (FL) и взрослого костного мозга (БМ) для сравнения. Microarray данные доступны через NCBI ген выражение Омнибус (GEO): GSE73344. Ранее мы показали, что красный iEP колонии напоминают bona fide эритроидных колоний (FL и БМ) ген выражение10. Анализ выражения Gata1, Tal1, Lmo2 и c-Myc в каждой колонии показывает, что в то время как красные колонии показывают аналогичные уровни выражения всех четырех факторов FL и БМ, колоний-красный ниже выражение все факторы, особенно Gata1 (рис. 2E). Чтобы понять, что колоний-красный, содержащих Макрофаг подобных клеток являются, мы обследовали экспрессии генов определенного типа клеток в каждом типе колонии от данных microarray. Как сообщалось ранее красные колонии Экспресс многих эритроидные конкретных генов, похож на FL и БМ. После пересмотра данных, становится ясно, что колоний-красный показать высокое выражение целого ряда генов характерные макрофагов ячейки14 (Рисунок 2F). Красный, ни не красный колоний показывают значительно увеличили выражение генов типичных мегакариоцитов15. Вместе эти данные позволяют предположить, что колоний-красный больше напоминают макрофаги чем эритроцитов. Так как колоний-красный никогда не наблюдаются, когда один из факторов, GTLM удаляются, как представляется, эти клетки макрофагального как образуется, когда уровни выражения одного или более из перепрограммирования факторов, Gata1, Tal1, Lmo2 , ниже, чем требуется для перепрограммирования ПРП. Вместе это свидетельствует о том, что уровни выражения всех четырех факторов GTLM важны в ТЦФ для перепрограммирования iEP и что неоднородность объясняется неполным перепрограммирования отдельных клеток, которые потенциально могут быть исправлены путем корректировки стехиометрические коэффициенты.
Чтобы оценить эффективность и надежность нашего протокола, мы протестировали способность установить количество фибробластов производить видимых кластеры клеток iEP после 5 дней когда культивировали в 384-ну пластины. Мы установлено, что из 24 transductions 20, 30, 40 и 50 ТЦФ, количество скважин с по крайней мере один iEP кластер 3 (0,6% от пластины фибробластов), 15 (2,0% от пластины фибробластов), 15 (1,6% плит фибробластов) и 13 (1,1% плит фибробластов) , соответственно. Это свидетельствует о том, что GLTM iEP перепрограммирования является прочным и надежным процессом, который может достигать КПД 1%.
Другие факторы, которые могут повлиять на эффективность перепрограммирования включают количество фибробластов и культуры условий прохода. Мы сравнили перепрограммирования эффективность ТЦФ, которые были пассированной три раза или девять раз до трансдукции. ТЦФ, которые были пассированной девять раз (P9) показал резкое снижение способности производить кластеры ПРП (рисA). Интересно, что включение сыворотки в перепрограммирования СМИ полностью блоков перепрограммирование, заменяя сыворотки с цитокинами эритроидные необходимо позволить transduced факторы диск новой судьбы клетки без компаундирования сигналы от сыворотки. Удаления сыворотки и проявление новых факторов в ячейке может быть стресс на клетки. Действительно Блокирование активации p53 значительно увеличилось количество созданных ПРП. Этот эффект можно увидеть также в перепрограммировании p53 нокаут фибробластов (Рисунок 3B-D). Ингибирование p53 сигнализации приводит к более ячеек выживания и лучше перепрограммирования и является одним из проверенных методов для повышения урожайности. Наконец перепрограммирование в гипоксических условиях является благоприятным, но не жизненно важное значение для производства iEP. Однако transduced ТЦФ культивировали в normoxia гораздо медленнее, для того перепрограммировать и кластеры iEP наблюдаются после 10 дней вместо пяти до восьми дней (рис. 3E).
Рисунок 1 : Принудительный выражение Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc перепрограммирует мышиных взрослых фибробластов в эритроидные предшественники, которые exhibit свойства bona fide эритроидных клеток. (A) экспериментальный дизайн для транскрипции фактор опосредованной перепрограммирование эритроидные репортер (Epor-Cre R26-eYFP) хвост кончик фибробластов (TTF) EpoR + перепрограммировать клетки. (B–F) Время курса iEP поколения untransduced ТЦФ (день 0) и сыпучие GTLM-преобразованы ТЦФ в дни 5 и 8 (представитель n = 2-3). Transdifferentiation была оценена (B) клеток, светлые области изображения одиночных скважин (шкала бар, 50 мкм); (C) мая-Грюнвальда - Гимза пятнать Цито спин (линейки, 20 мкм); (D) бензидин/Гимза пятнать Цито спин (линейки, 20 мкм); (E) макроскопических осмотр клеток гранул; и (F) представитель проточной цитометрии участков показаны рекламы ЯФП / Ter119 выражение. (G) диаметр ячеек ПРП, найденным в дни 5 и 8 измеряется от нескольких слайдов Цито спина, показывая уменьшение размера ячейки на 8 день. Данные представлены как означает ± SD (n = 21-25); p ≤ 0,0001 от непарных t-теста. (H) представитель высокого разрешения бензидин/Гимза образы GTLM-преобразованы ТЦФ на 8 день. Линейки, 5 мкм. (I) выражение относительного mRNA соответствующих фибробластов и эритроидные конкретных генов, включая гены Глобин навалом untransduced ТЦФ (серый столбцы) против GTLM-преобразованы ТЦФ (красные столбцы) на день 8, определяется ПЦР. Данные представлены как означает ± SD (n = 4-6 для ПРП, n = 2 для untransduced ТЦФ). (J) график, показывающий резюме cytometry анализ потока времени курс untransduced TTF (день 0) и сыпучих GTLM-преобразованы TTF, собирают в день 2, 4, 6 и 8 показаны рекламы ЯФП, CD45, CD71 и Ter119 выражение (n = 3). Данные представлены как среднее ± SD. рисунок заимствован из S Capellera-Гарсия, и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : GTLM ПРП производят красный и -красный колоний в BFU-E колонии анализов. (A) представитель cytospin ярко поле и Май-Грюнвальда-Гимза изображения iEP производные красный и -красный колоний. Масштаб баров, 50 мкм (колонии изображения) и 10 мкм (Цито спин изображения). (B) колонии счетчики, созданные с покрытием untransduced ТЦФ, массового день 5 ПРП и массового день 8. Данные представлены как означает ± SD (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001, двусторонний ANOVA. (C) выражения относительной мРНК Gata1, Tal1, Lmo2, и c-Myc в untransduced ТЦФ и массовых GTLM-преобразованы TTF собирают в день 5 и 8, день определяется ПЦР. Праймеры были разработаны таким образом, чтобы эндогенного выражение можно было отличать от всего выражения. Данные представлены как означает ± SD (n = 4-6 для ПРП, n = 2 для untransduced TTF). (D) колонии графов, полученные гальваническим untransduced ТЦФ и основная день 5 ПРП порожденных удвоение соотношение каждого из факторов GTLM. Данные представлены как означает ± SD (n = 3); ** p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001, двусторонний ANOVA. (E) относительное выражение Gata1, Tal1, Lmo2, и c-Myc в untransduced фибробластов и взял колоний генерируется из GTLM-преобразованы ПРП (красный и -красный), 14,5 dpc фетальной печени и взрослого кости костного мозга, определяется microarray. Данные представлены как означает ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001, двусторонний ANOVA. (F) относительное выражение отдельных генов известный для их выражения в эритроидные (вверху), мегакариоцитов (в середине) и макрофагов (внизу) клетки в untransduced фибробластов и взял колоний, созданный из GTLM-преобразованы ПРП (красный и -красный), 14.5dpc печени плода и костного мозга взрослого, определяется microarray. Данные представлены как означает ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001, двусторонний ANOVA. Рисунок заимствован из Capellera-Гарсия S, и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : GTLM перепрограммирования является прочным и надежным процессом. (A) граф количество кластеров наблюдается от 10000 ТЦФ и представитель картинки на 5 день GTLM перепрограммирования фибробластов кончик хвоста (TTF) которые подверглись три проходы (P3) или девять проходы (P9) до перепрограммирования. Данные представлены как означает ± SD (n = 6); Масштаб гистограммы являются 50 µm. (B–D) представитель фотографии iEP кластеры 6 дней после GTLM (B) перепрограммирования фибробластов кончик хвоста; (C) GTLM перепрограммирования ТЦФ с добавлением p53DN вектора выражения; (D) GTLM перепрограммирования p53 нокаут ТЦФ (масштаб баров = 50 мкм). (E) представитель фотографии iEP кластеров после 10 дней перепрограммирования GTLM в нормоксические условиях (шкала бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сверхэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП10. Перепрограммировать эритроидных клеток сильно напоминал bona fide эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип, экспрессии генов и колонии формирование способности. Этот вывод подтверждают обоснование использования прямого перепрограммирования как инструмент для определения развития факторов в кроветворения. Для поддержки действительность этого способа, ПРП также можно создавать с помощью индукции GTLM мыши эмбриональных фибробластов и фибробластов человека крайней плоти, показать, что он работает для фибробластов различного происхождения и различных видов10. В настоящем докладе мы побудить перепрограммирование фибробласты мыши линии трассировки эритроидные как инструмент для визуализации преобразование эритроидных клеток. Использование этой мыши является полезным, но не решающее значение для протокола. Мы регулярно выполнять перепрограммирование с использованием нескольких видов фибробластов от различных штаммов мыши и определить ПРП клеток поверхности маркер выражения Ter119 и CD71.
Наш текущий метод создает ПРП, которые exhibit примитивных эритроидные фенотип отличие от окончательного взрослых фенотип. Главным различием между этими этапами развития является выражением Глобин различных генов. Однако мы показали что помимо Klf1 и Myb GTLM коктейль изменения ПРП Глобин выражению преимущественно эмбриона в основном взрослых10,14. Интересно, что помимо Gata2 и Runx1 в четырех фактор коктейль и thrombopoietin в среде уклоны перепрошивка к мегакариоцитарная линии16.
GTLM-индуцированной ПРП производят эритроидные предшественники с подписью выражение примитивный геном и ограниченную вместимость пролиферативную. Кроме того ПРП производят очень мало enucleated эритроцитов. Бедных эритроидные предшественники расширение объясняется неспособностью перепрограммировать комплект + окончательного эритроидных клеток, которые потенциально могут быть достигнуты с добавлением других факторов стимулирования прямых перепрограммирования к ПРП с выражением окончательного гена программы.
Наши данные также предлагаю бедных Энуклеация эффективность объясняется тот факт, что GTLM-индуцированной ПРП генерировать прекурсоров с примитивным, а не программа выражения окончательного гена. Несколько попыток оптимизации условий культуры были попытки без улучшения Энуклеация. Поэтому продолжающиеся попытки повысить эффективность распространения и Энуклеация как прародитель ориентированы на выявление отсутствующих факторов для стимулирования перепрограммирования для окончательного ПРП.
Для оптимального производства красных iEP колоний важно, что клетки будут преобразованы с всеми четырьмя векторами и GTL гены выражены на высоком уровне. К сожалению в настоящее время наиболее эффективный метод не позволяет предварительного контроля вектор титры. Попытка повысить эффективность с помощью bicistronic лентивирусные векторы не был успешным, возможно из-за проблем с нижней стехиометрии или недостаточно выражение уровня. В то время как продолжается работа по совершенствованию перепрограммирования векторов, наиболее эффективный метод остается с помощью комбинации свежезаваренным производства супернатант вектор с ранее описанных ретровиральных векторов, выражая только один фактор и не гена маркер выделения.
GTLM перепрограммирования ПРП является единственным сообщил протокол способен производить эритроидные предшественники как клетки от совершено соматических клеток. Как исследовательский инструмент DLR iEP метод поэтому имеет ряд преимуществ над другими эритроидные клетки модель системы, такие как эритроидные клетки линии клетки HiDEPs/HuDEP (PMID: 23533656)17. В то время как HiDEPs/HuDEP клетки являются более удобные инструменты для крупномасштабного производства эритроцитов и оценки функции гена во время терминального эритропоэза, уникальным преимуществом GTLM перепрограммирования ПРП является возможность непосредственно изучить ядра транскрипционный анализ программы установления судьбы эритроидных клеток. GTLM перепрограммирования обеспечивает неоценимую платформу для изучения обоих эритропоэза в организме человека и мыши, например, для изучения переключение между примитивными и окончательного эритропоэза. Понимание этого переключателя является огромный интерес для потенциального лечения hemoglobinopathies, таких как серповидно-клеточная анемия, в котором исследователи стремятся обратить вспять переключатель в взрослых фетального гемоглобина для облегчения болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без коллизии интересов в отчет.
Acknowledgments
Мы благодарим Эвелин Ван и Грегори Хайд (Институт Уайтхед, Кембридж, Массачусетс) для клонирования и Харви Lodish (Уайтхед институт) за предоставление многих плазмид, используется для генерации ретровирусной библиотеки. Мы благодарим Кавитха Шивы и Sofie Singbrant (Кафедра молекулярной медицины и генной терапии, Лундский университет), Гёран Карлссон и Shamit Soneji (Отдел молекулярной гематологии, Лундский университет) за их роль в описании iEP производства. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить Julian Пулесьо (Центр восстановительной медицины, Барселона биомедицинская научно-исследовательский парк), Виолета района-Эстрада (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк), Карл Walkley (Сент-Винсент институт медицинских исследований и Кафедра медицины, Сент-Винсент больницы, Университет Мельбурна), Анхель рая (каталонский Институт передовых исследований, Барселона) и Vijay G. Sankaran (широкой институт Массачусетского института технологии и Гарвардского университета, Кембридж ) для их предыдущий вклад в эту работу. Эта работа была поддержана Рагнар Söderberg фонда (J.F.); Шведские исследования Совета (к J.F.); Стифтельсен Олле Engkvist Byggmästare (к J.F.); Шведский фонд стратегических исследований (к J.F.); Åke Wiberg фонд (к J.F.); Мари Кюри интеграции Грант (J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
