Summary
생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).
Abstract
Erythroid 셀 헌신 및 분화 세포 운명 결정 및 성숙 요인의 그룹에 의해 조율 된 혈통 제한 transcriptional 네트워크의 활성화를 통해 진행 됩니다. 우리는 직접 혈통 유도 erythroid 창시자/선구자 (Iep)으로 섬유 아 세포의 프로그래밍을 사용 하 여 적혈구 개발 지시에 필요한 요인의 최소 집합을 정의 하려면 이전 밖으로 설정. 우리 보여 그 overexpression Gata1의 Tal1, Lmo2및 c-Myc (GTLM) 수 변환 murine와 인간의 섬유 아 세포 직접 Iep 유사한 형태학, 측면에서 보 나 fide erythroid 셀을 빠르게 표현 형, 그리고 유전자 발현입니다. 우리는 Iep 적혈구와 세포 운명 조절 연구에 귀중 한 도구를 제공할 것입니다 것입니다. 여기는 Iep 통해 전사 요소 기반 직접 혈통 (DLR) 프로그래밍 murine 꼬리 팁 fibroblasts 변환의 단계적 과정에 설명 합니다. 이 예제에서 erythroid 셀의 시각화 수 있도록 리스로 수용 체 유전자 (EpoR) 발기인의 통제 노란 형광 성 단백질 (YFP)을 나타내는 erythroid 계보 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 프로그래밍에 따라 운명 감 응 작용입니다. 이 프로토콜에 따라 5 ~ 8 일 이내 fibroblasts Iep에 재설정 수 있습니다.
개선 과정에 아직도 할 수 있다, 우리 표시 프로그래밍 GTLM 중재 하는 것이 신속 하 고 직접적인 프로세스는 저조한 진실 fide 의 속성을 가진 셀 erythroid 조상 및 선구자 세포.
Introduction
적혈구 (Rbc)는 모든 척추 동물에 필수적인 고 인체1의 모든 셀의 84%. 성인 생활에 배아에서 우리의 건강 높은 RBC 항상성의 정확한 규칙에 따라 달라 집니다. 성인으로 개발에 걸쳐 성숙한 RBCs의 지속적인 생산 적혈구로 알려져 있다. 적혈구 연구의 주요 과제 RBC 개발 및 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치 조정 마스터 레 귤 레이 터를 정의 하는 것입니다. 직접 혈통 erythroid 창시자의 프로그래밍 erythroid 개발 비보를 더욱 이해 하는 기회를 선물 한다.
직접 혈통 프로그래밍 (DLR), transdifferentiation, 일컬어 프로그래밍 한 셀 형식을 직접으로, 만능 multipotent 조상 단계를 우회 하는 프로세스입니다. DLR은 지금까지 신경2조 혈3,,45, 간장6 , 신7, 조상 세포를 포함 하 여 수많은 셀 유형을 일으킬 사용 되었습니다. 발달 생물학에 대 한 DLR 혈통 헌신과 터미널 차별화 프로세스8,9의 질의 측면에 대 한 중요 한 도구가 되고있다. DLR 보완 하 고 vivo에서 연구 개발 하는 동안 요소를 결정 하는 세포 운명의 이해 메커니즘에 대 한 부분적으로 대체할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 erythroid 창시자에 프로그래밍에 대 한 DLR 프로토콜 필드에 게 적혈구의 개발 연구에 대 한 무료 방법의 제공 한다.
우리는 이전 4-팩터 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2, 및 c-MYC (GTLM), erythroid 유도 창시자에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 한지 증명 하고있다 (Iep) 10. erythroid는 GTLM 재설정 셀 크게 닮은 형태, 표현 형, 그리고 유전자 식10면에서 보 나 타고 난 기본 erythroid 창시자. 따라서 Iep 확산 수 용량을 제한 하 고 뚜렷이 확실 한 적혈구의 발병 하기 전에 초기 배아에서 생산 된 것과 유사한 nucleated 적혈구 성숙. 재활 조건 (예를 들어, 요소 또는 다른 요소의 추가 프로그래밍에서 점 돌연변이)에서 변경 하 여, 하나는이 erythroid 개발 및 차별화에 변화를 리드 하는 방법을 이해할 수 있다. 우리는 예를 표시 GTLM 칵테일에 Klf1 또는 Myb 의 추가 주로 배아 (기본)에서 globin 식 패턴 변경 주로 성인 (최종). 이 이는 적혈구에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 DLR을 사용 하 여 유효성을 뒷받침.
여기, 우리 iEPs를 마우스 꼬리 팁 섬유 아 세포 (TTF)에서 생성 하는 과정을 설명 합니다. 우리의 대표 결과에 우리 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍을 수행 (Epor-Cre R26-eYFP) 세포는 모든 Rosa26 소재 시에서 노란 형광 성 단백질 (eYFP)를 표현 erythroid 계보에 헌신의 쉽게 시각화 수 있도록 리스로 수용 체를 표현 했다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 (EpoR +) YFP 긍정적인 존재 하는 변환 후 5 일입니다. 이 프로토콜을 따라서, erythroid 창시자에서 생체 외에서의 세대에 대 한 신속 하 고 강력한 기술을 제공합니다.
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Protocol
1. 설립 및 기본 마우스 꼬리의 유지 보수 팁 섬유 문화
- 0.1% 젤라틴으로 표면을 커버 하 고 37 ° c.에서 약 20 분 동안 요리를 배양 하 여 젤라틴 코팅 요리 (한 꼬리 10 cm 접시 추천)를 준비 접시에서 젤라틴 솔루션을 발음 하 고 적어도 2 시간 동안 건조 하 있습니다.
- 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 꼬리의 기지에서 절단가 위 꼬리를 제거 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)에서 꼬리를 넣어.
참고: 최상의 결과 얻으려면 꼬리 취해야 한다 쥐에서 나이의 약 6 ~ 8 주. 그러나 꼬리는 쥐 쥐 나이는 섬유 아 세포의 확산 능력과 감소11프로그래밍의 효율성으로 나이,,의 8 주 이상에서 가져올 수 있습니다. - 무 균 조건 하에서 조직 문화 후드에이 프로토콜의 모든 이후 단계를 수행 합니다. 0.02 %DPBS 트립 신-EDTA의 희석된 trypsin 솔루션을 준비 하 고 코팅된 10 cm 접시에 5 mL을 추가.
- 70% 에탄올, 다음 DPBS 먼저 꼬리를 씻어. 한 접시에는 꼬리를 평면 놓고 집게를 사용 하 여 제자리에. 끝에 기지에서 세로 축 따라 꼬리에 절 개를 확인 합니다.
- 한 쌍의 집게와 꼬리를 잡고를 수직으로 잡고. 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여, 꼬리의 기지에 절 개 옆에 피부를 다시 껍질. 이렇게 절 개의 양쪽에는 꼬리의 끝을 향해 아래쪽으로 당겨 피부를 벗 수 때까지.
- 벗 겨 꼬리 집게와 트립 신 솔루션이 포함 된 요리 위에 고 약 1 cm 긴 조각으로 꼬리를 잘라. 트립 신 솔루션에서 꼬리 조각으로 더 작은 조각으로 조각 조각에 위를 사용 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 trypsin 용액에 꼬리 조각 품 어.
참고: 작은 조각 각 볼륨 비율 높은 표면적을 제공 하기 위해 선호 됩니다. - 구와 확장 (FEX) 매체의 2 개를 사용 하 여 트립 신을 끄다 (높은 포도 당 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 15 %FBS, 2 mM L-글루타민, 비 필수 아미노산 (NEAA) 및 100 U/mL 페니실린/스).
- 50 mL 튜브와 4 ° c.에서 5 분 동안 350 × g 에서 원심 분리기로 접시의 전체 내용을 수집합니다 상쾌한 발음 하 고 신선한 FEX 매체의 10 mL에 꼬리 조각 resuspend.
- 젤라틴 코팅 접시 중간에 꼬리 조각 전송 및 5% CO2 와 4% O2를 2 일 마다 신선한 FEX 매체 추가에서 37 ° C에서 품 어.
참고: 5 ~ 7 일 후, 꼬리 조각 연결 된 접시의 바닥에 그리고 그들을 멀어 섬유 아 세포를 볼 수 있습니다. - 섬유 아 세포의 송이 발견, 일단 부드럽게 꼬리 조각 꺼내와 발음 매체와 접시에 부착 된 섬유 아 세포를 떠나는 모든 뼈 조각이 접시를 흔들. 새로운 FEX 매체를 추가 하 고 합칠 때까지 섬유 아 세포 문화.
- 을 보장 하기 위해 조 혈 창시자에 의해 섬유 아 세포의 오염 없이 5 분에 대 한 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 세포를 수집 합니다. 조 혈 마커를 표현 하는 셀에 대 한 고갈 (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, 안티-Gr-1 (Ly-6 G/C), 7-4, 그리고 Ter-119) 자기 분리 시스템10를 사용 하 여.
2. 레트로 바이러스 생산
- 약 2.5 × 104 셀/cm2 (2.0 × 106 셀 10 cm 요리에 대 한) 10%로 높은 포도 당 DMEM에서 하룻밤 문화와 조직 문화-(에 의해 처리 진공 가스 플라즈마) 접시에 retroviral 포장 셀 씨 FBS, 10mm 나트륨 Pyruvate, 고 37 ° C, 5% CO2100 U/mL 페니실린/스.
- 다음 아침에 변경 매체 DMEM 절반 볼륨 하룻밤 배양 하는 데 사용 (5 mL 10 cm 요리에 대 한)를 사용 하 여 아무 첨가물. 오후에 확인 세포는 70-80% 합칠은 transfection를 시작 합니다.
- 각 재활 요소 Gata1, Tal1, Lmo2및 c-Myc, 표정 벡터 (pMX) 및 도우미 벡터 (개 그 및 pol 유전자 포함)의 2:1 혼합물 준비. 섬유 아 세포의 10 cm 접시, 표정 벡터의 6 µ g과 DMEM 매체에서 100 µ L의 최종 볼륨에 도우미 벡터의 3 µ g를 사용 하 여.
- 각 재활 요소에 대 한 살 균 폴리스 티 렌 튜브에서 실 온 (RT) DMEM의 300 µ L를 준비 하 고 신중 하 게 상업 transfection 시 약의 27 µ L를 추가 합니다.
참고: transfection 시 약 사용 하기 전에 rt 가져와야 한다 하 고 화합물의 정전기 속성 튜브의 플라스틱 벽에 붙어 그것을 만들 수 있는 매체에 직접 추가 해야 합니다. - Transfection 시 약 포함 된 튜브, 짧게 소용돌이에 플라스 미드 혼합을 추가 하 고 실시간 짧게 소용돌이 혼합물에 15 분 동안 transfection 시 DNA 혼합물을 품 어 dropwise retroviral 포장 셀에 추가 되도록 transfection는 시 약-DNA 혼합 문화에 걸쳐 균등 하 게 되 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
- transfection, 후 24 h 20 %DMEM 매체 변경 FBS 및 100 U/mL 페니실린/스. transfection, 후 48 h는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 필터링.
참고: 바이러스 supernatants-80 ° c 냉동 고 변환 신선한 바이러스 상쾌한 사용 하는 경우 더 효율적 이지만, 필요할 때까지 보관 될 수 있습니다.
3. GTLM 변환 및 iEP 수확
- 꼬리 팁 1 × 104 셀/c m2 에서 fibroblasts에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 종자 FEX 매체에서 요리를 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 다음 날는 다음과 같이 변환 혼합물을 준비 하 고.
- 6 양의 FEX 매체 (60%)에 각 재활 요소 retroviral 감염 시 약 (40%)의 4 µ g/mL와 보완에 대 한 바이러스 성 상쾌한의 1 볼륨을 추가 합니다.
- 섬유 아 세포의 10 cm 요리에 대 한 각 바이러스 상쾌한의 1 mL를 추가 (4 × 바이러스 = 4 mL) 10 mL 변환 혼합물의 총 주는 4 µ g/mL FEX 매체의 6 mL를 retroviral 감염 시 약의 보충.
- 구와 문화에서 FEX 매체를 발음 하 고 변환 혼합 합니다. Hypoxic 조건 (5% CO2 와 4% O2)에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 변환 품 어.
- 변환 혼합물을 발음 하 고 신선한 재활 매체 (혈 청 무료 확장 매체 (SFEM), 100 U/mLPenicillin/스, 100 ng/mL murine 줄기 세포 요소 (mSCF), 10 ng/mL murine 인터 루 킨-3 (IL3), 2 U/mL 인간 재조합 리스로 (hrEPO), 그리고 100 nM Dexamethasone).
- 8 daysat hypoxic 조건, 추가 신선한 재활 매체 2 일 마다에서 37 ° C에 품 어. 5 ~ 8 일 후 성공적인 프로그래밍 하는 것은 접시에서 분리 된 셀 클러스터 얻을 것입니다.
- 수집 분석에 대 한 재설정된 셀, 부드럽게 플라스틱 아래로 접시에서 직접 그들을 수확. 비교를 위해 untransduced fibroblasts 수확, 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 수집 합니다.
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Representative Results
여기 성인 섬유 아 세포 전사 인자 기반 DLR을 사용 하 여에서 Iep의 생산을 위한 재현 가능한 프로토콜 선물이. 우리 셀 프로그래밍 cytometry, 식민지 형성 분석 실험, 및 유전자를 사용 하 여 평가 식 분석. Erythroid 셀 운명에 변환의 시각화에 지원 하기 위해 우리는 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 (Epor-Cre R26-eYFP)는 노란 형광 성 단백질 (eYFP) 표현 리스로 수용 체 (Epor, Cre 생 Epor 로커 스의 1 개의 대립 유전자에 기 절)를 표현 하는 모든 셀에 Rosa26 소재 시에서 그들의 개발12,13 ( 의 모든 단계에서 성적 그림 1A). 성공적인 프로그래밍 erythroid 창시자 유발, 후 YFP 긍정적인 (EpoR +) 셀 변환 후 5 일 관찰할 수 있습니다. 프로그래밍, 라운드, 될 셀의 하루 5 접시의 표면에서 들어올리고 클러스터 형성 시작 합니다. 하루 5-Iep 표시 후에 5 월-그 룬 발트-Giemsa 특성 중심 핵, 거친 chromatin 그리고 블루 세포질 기능 erythroid 전조 같은 형태 (그림 1C) 얼룩. 일부 셀의 hemoglobinization는 분명 긍정적인 benzidine 얼룩이 지 고 때 수송과 약간 빨간 외관에 의해 (그림 1D-E). 또한, (그림 1F) 하루 5-Iep 공동 익스프레스 YFP 및 erythroid 특정 표면 마커 Ter119의 작은 분수. 8 일에 의해 큰 YFP + 클러스터를 볼 수 있습니다. 하루 8iEPs 현재 하루 5 Iep; 보다 더 차별화 된 erythroid 형 그들은 훨씬 더 작은, 더 많은 헤모글로빈, 축적 그리고 또한 크게 upregulated 식 Ter119의 표시 (그림 1B-1 G). 거의 enucleated reticulocytes (그림 1H)를 관찰 하는 동안 하루 8-Iep의 Cyto-회전 급강하 erythroid 같은 형태학, 공개.
주 8에서 수집 된 대량 Iep의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 의해 유전자 표정 분석와을 보여줍니다 그들은 섬유 아 세포 유전자의 거의 종료 표현을 upregulated 주로 globin 유전자를 포함 하 여 많은 erythroid 유전자 (그림 1나) 배아 형식 표현. 재설정된 셀 multipotent 창시자 통해 전환, 우리 시간 과정을 수행 하 고 프로그래밍을 통해 조 혈 마커의 식 분석. 우리는 이전 erythroid 전조 출력이 높은 날 6, 10.5% ± 4.6%와 6.6% ± 0.5% 라이브 YFP + 셀 공동 표현 CD71와 Ter119, 각각10의 8, 하루 뒤 보고. Ter119 긍정적인 셀의 모양 전에 CD41 긍정적인 세포의 인구가 있다. C-키트도는 일반적으로 조 혈 모 조상 및 적혈구에 downregulated 표현, CD45 마커는 (그림 1J) 프로그래밍에 어느 시점에서 표현 됩니다. 이러한 데이터 셀을 이동 하지 마십시오 것이 좋습니다 multipotent 조 혈 조상 또는 이전 단계를 통해 비록 아마도 megakaryocyte erythroid 조상 통해 전환 할.
재설정된 셀에 BFU E 식민지 형성 분석을 수행 하는 프로그래밍의 효율성을 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법이입니다. 하루 5-하루 8-Iep의 차별화 용량 생체 외에서 인간 erythropoietin murine 줄기 세포 비율과 dexamethasone 보충 스에서 분석 했다. 8 일 후, Iep 형성 식민지의 두 종류: 분명히 빨간색 (빨간색 iEP)와 안 가시 레드 (레드 비 iEP). 빨간 식민지에서 셀 표시 erythroblast 형태학, 비 레드 식민지에서 세포 erythroid 세포, 유사 하지 않은 일반 했다, 큰 깊은 블루 하 고 세분화 된 세포질 (그림 2A) 했다.
Iep-주 5의 약 1에서 1000만 약 1:10,000 하루 8-Iep 비 레드 식민지 형성 (그림 2B)의 훨씬 더 높은 비율로 빨간 식민지를 형성 하는 동안 빨간 식민지를 형성 했다. 식민지 형성이 감소 하루 5-하루 8-Iep 사이 능력 설명된 byiEPs 일 5-8 시간 동안 침묵 고통을 GTLM 식 벡터에서 차별화를 겪고 수 있습니다. 정량 분석 외 인 성적 표현의 일 5 ~ 8에서에서 크게 감소 확인. 그러나 성공적인 프로그래밍에서 예상 대로 생 Gata1, Tal1, Lmo2, 및 c-Myc 식 수준 유도,, 내 인 성 Lmo2 식만 매우 미 천 한 표현된 (그림 2C).
메모의 포인트와 분석 결과의 한계는 대 식 세포와 같은 세포를 포함 하는 레드 비 식민지 식민지 형성 재설정된 섬유 아 세포에 의해 형성 된 레드 hemoglobinized iEP 식민지 많습니다 분석 실험. 식민지를 형성 수 빨간 iEP 식민지를 만들 GTLM 요인의 화학 량 론 비율을 변경 하 여 개선할 수 있습니다. 여분의 Gata1 빨간 식민지의 형성에 상당한 증가를 주도 하는 동안 비 레드 식민지, 빨간 식민지의 약간의 증가를 주도 시험 Tal1 , Lmo2 식 벡터의 금액을 두 번 셀 그리고 거의 비 레드 식민지의 완전 한 제거 적혈구 (그림 2D)에 이러한 요소에 대 한 중요 한 역할을 지원. 흥미롭게도, c-Myc 의 표현을 대폭 증가 프로그래밍을 위한 불가결 임에도 불구 하 고 비 레드 식민지의 생산을 증가 시킵니다. 다운스트림 분석에 대 한 순수한 유도 erythroid 창시자를, 식민지는 식민지 형성 분석 실험에서 분리 수 있습니다. 우리 레드에 microarray의 형태로 유전자 표정 분석을 수행 하 고 하루 5-Iep에서 비 레드 식민지와 식민지 14.5 일에서 게시 성교 (dpc) 태아 간 (플로리다), 성인 골 수 (BM) 비교. Microarray 데이터 NCBI의 유전자 식 옴니 버스 (GEO)를 통해 액세스할 수 있습니다: GSE73344. 우리는 이전 레드-iEP 식민지 유전자 식10(플로리다와 BM) 진실 fide erythroid 식민지를 닮은 나타났습니다. 각 식민지에 있는 Gata1, Tal1, Lmo2, 및 c-Myc 의 식의 시험이 보여줍니다 빨간 식민지 플로리다와 BM을 모든 4 개의 요인의 식의 표시, 비 레드 식민지의 낮은 식 모든 요인, 특히 Gata1 (그림 2E). 무엇을 이해 하 비 레드 식민지 대 식 세포와 같은 세포를 포함 하는, 우리가 조사 각 유형의 microarray 데이터에서 식민지에 셀 유형 특정 유전자의 표정. 이전 보고, 빨간 식민지 많은 erythroid 관련 유전자, 플로리다와 BM의 유사한 표현 한다. 후 데이터를 다시 방문, 그것은 분명 레드 비 식민지 대 식 세포 세포14 (그림 2F)의 높은 식 유전자의 수의 표시. 빨간색도 아닌 레드 식민지 크게 증가 표현의 전형적인 megakaryocyte 유전자15를 표시합니다. 함께, 이러한 데이터 비 레드 식민지 더 가깝게 적혈구 보다 세포를 닮는 것이 좋습니다. 이후 비 레드 식민지는 결코 GTLM 요인 중 하나가 제거 되 면 관찰이 대 식 세포와 같은 세포 하나 이상의 재활 요인 Gata1, Tal1, Lmo2 식 수준 보다 낮은 때 형성 될 것 Iep에 프로그래밍에 대 한 필요 합니다. 함께,이 모든 4 개의 GTLM 요소 식 수준의 중요 TTF에 iEP 프로그래밍 하 고이 잠재적으로 조정 하 여 수정 하실 수 있습니다 개별 셀의 불완전 한 재프로그래밍에 의해 설명 된다 제안 화학 량 론 비율입니다.
효율성과 우리의 프로토콜의 안정성을 평가 하기 위해 우리는 5 일 후 iEP 셀의 보이는 클러스터를 생산 하는 섬유 아 세포의 세트 숫자의 능력 테스트 384-잘 접시에 배양 할 때. 우리는 20, 30, 40, 그리고 50 TTFs의 24 transductions에서 iEP는 적어도 하나의 클러스터와 우물의 수 했다 결정 3 (접시 섬유 아 세포의 0.6%), 15 (접시 섬유 아 세포의 2.0%), 15 (접시 섬유 아 세포의 1.6%), 그리고 13 (접시 섬유 아 세포의 1.1%) 각각. 이 GLTM iEP 프로그래밍 하는 것이 1%의 효율성을 도달할 수 있는 강력 하 고 신뢰할 수 있는 프로세스는 나왔다.
프로그래밍의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인 포함 문화 조건과 섬유 아 세포의 통과 번호. 우리는 세 번을 passaged 했다 TTFs의 또는 9 번 변환 전에 재활 효율성 비교. 9 번을 passaged 했다 TTFs (P9) Iep (그림 3A)의 클러스터를 생성 하는 기능에 있는 극적인 감소를 보여주었다. 흥미롭게도, 재활 미디어에서 혈 청의 포함 완전히 블록 프로그래밍, erythroid cytokines와 교체 혈 청은 혈 청에서 합성 신호 없이 새로운 세포 운명을 transduced 요소를 허용 하는 데 필요한. 혈 청의 제거와 셀 내에 새로운 요인의 식 세포에 스트레스가 될 것입니다. 실제로, Iep 생성의 수를 증가 하는 p53 활성화를 크게 차단. 이 효과 또한 p53 녹아웃 섬유 아 세포 (그림 3B-D)의 프로그래밍에서 볼 수 있습니다. 억제 p53 신호 더 리드 세포 생존 및 더 나은 프로그래밍 및 수율 향상을 위한 하나의 유효한 방법입니다. 마지막으로, hypoxic 조건에서 프로그래밍 이지만 유리한 iEP 생산을 위한 중요 하지. 그러나, 불리고 TTFs normoxia에 교양된 프로그램을 훨씬 더 느리게 되며 iEP 클러스터 5 ~ 8 일 (그림 3E) 대신 10 일 후에 관찰 된다.
그림 1 : Gata1, Tal1, Lmo2, 및 c-Myc 의 강제 식으로 murine 성인 섬유 아 세포 나 fide erythroid 셀의 속성을 전시 하는 erythroid 창시자로. (A) 녹음 방송 요인 중재 erythroid 기자의 프로그래밍에 대 한 실험 설계 (Epor Cre R26-eYFP) EpoR + 재설정 셀 팁 섬유 아 세포 (TTF) 꼬리. (B-F) Untransduced TTFs (0 일)의 iEP 생성의 과정을 시간 및 5-8 일에 GTLM 불리고 TTFs 대량 (n의 대표 = 2-3). Transdifferentiation 단일 우물 (눈금 막대, 50 µ m);의 (B) 라이브 셀, 밝은 필드 이미지에 의해 평가 되었다 (C) 5 월-그 룬 발트의 Giemsa 얼룩 cyto-스핀 (눈금 막대, 20 µ m); (D) Benzidine/Giemsa 얼룩 cyto-스핀 (눈금 막대, 20 µ m); (E) 거시적인 검사 셀 펠 릿; (F) 대표 cytometry YFP 보여주는 플롯 / Ter119 식. (G) 셀 직경 5-8 일에 수확 하는 Iep의 날 8 셀 크기의 감소를 보여주는 여러 cyto-스핀 슬라이드에서 측정. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 21-25); 짝이 없는 tp ≤ 0.0001-테스트. 8 일에 GTLM 불리고 TTFs의 (H) 대표 고해상도 benzidine/Giemsa 이미지. 스케일 바, 5 µ m. (I) 관련 섬유 및 erythroid 관련 유전자 정량에 의해 결정 untransduced TTFs (회색 열) 대 대량 GTLM 불리고 TTFs (빨간 열) 8, 당일 globin 유전자를 포함 하 여의 상대 mRNA 표현. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 4-6 Iep, n = 2 untransduced TTFs에 대 한). (J) 그래프 untransduced TTF (0 일) 및 대량 GTLM 불리고 TTF 하루 2, 4, 6 및 8 보여주는 YFP, CD45, CD71 및 Ter119 식에서 수확의 시간 과정 흐름 cytometry 분석의 요약 표시 (n = 3). 평균 ± sd. 그림은 Capellera-가르시아 S에서 적응 하는 대로 데이터 표시 됩니다 외. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : GTLM Iep 생산 BFU E 식민지 분석 실험에 빨간색과 비 레드 식민지. (A) 대표 밝은 필드와 5 월-그 룬 발트-Giemsa cytospin 이미지 iEP 파생 된 빨강 및 비-레드의 식민지. 스케일 바, 50 µ m (식민지 이미지) 및 10 µ m (cyto-스핀 이미지). (B) 식민지 카운트 도금된 untransduced TTFs에서 생성 된 하루 5 iEPs를 대량 고 대량 주 8. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 (C) Gata1, Tal1, Lmo2, 및 untransduced TTF 및 대량에서 c-Myc 의 상대 mRNA 표정 GTLM 불리고 TTF 수확 5 일과 8, 하루에 정량에 의해 결정 됩니다. 프라이 머는 내 생 식 총 식에서 구별 될 수 있도록 설계 되었습니다. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 4-6 Iep, n = 2 untransduced TTF에 대 한). (D) 에서 생성 된 식민지 수 도금 untransduced TTFs, 및 대량 하루 5 Iep GTLM 요인의 각각의 비율을 두 배로 의해 생성 된. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 3); * * p ≤ 0.001; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 (E) 상대 표현의 Gata1, Tal1, Lmo2, 및 untransduced fibroblasts에 고른된 식민지 c-Myc 에서 생성 된 GTLM 불리고 Iep (빨간색과 비-레드), 14.5 dpc 태아 간, 성인 골 수, microarray에 의해 결정 됩니다. 데이터는 ± SD; 의미 하는 대로 표시 됩니다. * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0.005 p ≤ 0.0005; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 (F) erythroid (맨 위), megakaryocyte (중간), 그리고 대 식 세포에 그들의 표현에 대 한 선택 된 유전자의 상대적 표현을 알려진 untransduced fibroblasts에 고른된 식민지 GTLM 불리고 Iep (빨간색과 비-레드)에서 생성 (아래) 셀 14.5dpc 태아 간, 성인 골 수, microarray에 의해 결정 됩니다. 데이터는 ± SD; 의미 하는 대로 표시 됩니다. * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0.005 p ≤ 0.0005; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 그림은 Capellera-가르시아 S, 그 외 여러분 에서 적응 됩니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : GTLM 프로그래밍 하는 것은 강력 하 고 신뢰할 수 있는 과정 이다. (A) GTLM 3 구절 (P3) 또는 9 구절 (P9) 프로그래밍을 이전 받은 꼬리 팁 fibroblasts (TTF)의 프로그래밍의 5 일에 10000 TTFs, 대표 사진에서 관찰 하는 클러스터 수의 그래프. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 6); 스케일 바는 50 µ m. (B-D) iEP의 대표 사진을 클러스터 (B) GTLM 꼬리 팁 fibroblasts;의 프로그래밍 후 6 일 (C) GTLM 프로그래밍 TTFs의 p53DN 표정 벡터;의 추가 (D) GTLM는 p53 녹아웃 TTFs의 프로그래밍 (바 규모 = 50 µ m). IEP 클러스터 GTLM 프로그래밍의 10 일 normoxic 조건에서 수행 된 후의 (E) 대표 사진 (눈금 막대 = 50 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
4 단계 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 및 c-MYC (GTLM), Iep10에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 하다. 재설정된 erythroid 세포는 크게 진실 fide erythroid 창시자를 형태, 표현 형, 유전자 발현, 그리고 식민지를 형성 하는 능력을 닮았다. 이 조에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 서 직접 프로그래밍을 사용 하 여 근거를 뒷받침. 이 방법의 유효성을 지원 하기 위해 Iep 또한 생성할 수 있습니다 마우스 미 발달 섬유 아 세포 및 다른 근원의 및 종10에서 fibroblasts에 대 한 작품을 보여주는 인간 포 피 섬유 아 세포의 GTLM 유도 사용 하 여. 이 보고서에서 우리는 시각화 erythroid 셀으로 변환 하는 도구로 서 프로그래밍 erythroid 리니지 추적 마우스에서 섬유 아 세포의 유도. 이 마우스의 사용은 유용 하지만 프로토콜에 중요 하지. 우리는 정기적으로 여러 종류의 다양 한 마우스 긴장에서 섬유를 사용 하 여 프로그래밍을 수행 하 고 Ter119와 CD71의 세포 표면 마커 식으로 Iep를 식별 합니다.
우리의 현재 메서드는 기본 erythroid 형 확실 한 성인 형에 반대 하는 Iep를 생성 합니다. 이 단계 개발의 큰 차이점 중 하나는 다른 globin 유전자의 표현 이다. 그러나, 우리가 나타났습니다 Klf1 그리고 Myb 의 그 추가 GTLM 칵테일 변경 Iep의 globin 식 패턴을 주로 성인을 주로 배아10,14에서. 흥미롭게도, 추가 Gata2 Runx1 4 요소 칵테일을 매체에서 thrombopoietin megakaryocytic 계보16으로 재활 과정 편견.
GTLM 유도 Iep 원시 유전자 표현 및 제한 된 증식 용량 erythroid 창시자 생산. 또한,는 Iep 거의 enucleated 적혈구 생성. 불 쌍 한 erythroid 조상 확장 키트 + 확실 한 erythroid 셀, 잠재적으로 유도 하는 결정적인 유전자 발현으로 Iep를 직접 프로그래밍 하는 다른 요소의 추가 함께 얻을 수 있는 프로그램을 실패에 의해 설명 된다 프로그램입니다.
우리의 데이터는 또한 가난한 enucleation 효율은 GTLM 유도 Iep 생성 확실 한 진 식 프로그램 보다는 기본으로 일어나는 사실에 의해 설명 제안. 문화 조건 최적화에 몇몇 시도 향상 된 enucleation 없이 시도 했다. 모두 조상 확산 및 enucleation 효율성을 증가 하는 지속적인 시도 따라서 유도 하는 확실 한 iEPs를 프로그래밍에 대 한 누락 된 요소를 식별 하는에서 집중 된다.
빨간 iEP 식민지의 최적 생산을 위한 세포는 모든 4 개의 벡터와 불리고 및 GTL 유전자가 높은 수준에서 표현 생명 이다. 불행 하 게도 현재 가장 효율적인 방법은 벡터 titers의 사전 제어를 허용 하지 않습니다. Bicistronic lentiviral 벡터를 사용 하 여 효율성을 개선 하기 위해 열 등 산출할 또는 부족 식 수준 문제 때문에 가능 하 게 실패 했다. 작업 재활 벡터를 개선 하기 위해 진행 하는 동안 갓의 조합을 사용 하 여 가장 효율적인 방법 남아 하나의 요소와 아무 선택 마커 유전자 표현 앞에서 설명한 retroviral 벡터 벡터 상쾌한 생산.
GTLM 프로그래밍 Iep에 최선을 다하고 체세포에서 erythroid 조상 같은 셀을 생산할 수 있게 유일한 보고 프로토콜입니다. Erythroid 셀 라인 HiDEPs/HuDEP 세포와 같은 erythroid 모델 시스템으로 연구 도구는 DLR iEP 방법 따라서 몇 가지 장점이 다른 셀 (PMID: 23533656)17. HiDEPs/HuDEP 셀은 대규모 적혈구 생산 고 터미널 적혈구 중 유전자 기능을 평가 하기 위한 더 편리한 도구, 독특한 GTLM Iep에 프로그래밍의 장점은 직접 코어의 연구 능력 erythroid 세포 운명 결정 하는 transcriptional 프로그램. GTLM 프로그래밍 인간 및 마우스, 예를 들어 두 적혈구를 공부 하 고 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치를 공부 하는 귀중 한 플랫폼을 제공 합니다. 이 스위치를 이해 hemoglobinopathies 연구 노력 질병을 완화 시키기 위해 태아 헤모글로빈에 성인에 있는 스위치를 반대로 낫 세포 빈 혈 등의 잠재적인 치료에 거 대 한 관심의 이다.
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Disclosures
저자 보고 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리 감사에 블 린 왕와 그레고리 하이드 (화이트 헤드 연구소, 케임브리지, MA) 복제와 하 비 Lodish (화이트 헤드 연구소)에 대 한 많은 retroviral 라이브러리를 생성 하는 데 사용 하는 플라스 미드의 제공. 우리 iEP 생산의 설명에서 그들의 역할에 대 한 더 Siva와 소피 Singbrant (학과 분자 의학 및 유전자 치료, 룬 드 대학), 예란 Karlsson Shamit Soneji (학과 분자 혈액학, 룬 드 대학) 감사합니다. 우리 또한 인정 하 고 율리우스 Pulecio (재생 의학 센터, 바르셀로나 메디컬 리서치 파크), 비 올레 타 레이 온 스 트 라 다 (록펠러 대학교, 뉴욕), 칼 Walkley 감사 하 고 싶습니다 (세인트 빈센트의 연구소의 의학 연구와 학과 의학, 세인트 빈센트 병원, 멜버른 대학), 앙 헬 라 야 (연구 및 첨단된 연구, 바르셀로나에 대 한 카탈로니아어 기관), 그리고 비제이 G. Sankaran (광범위 한 기술 및 하버드, 캠브리지, 매사 추세 츠 연구소의 연구원 )이이 작품에 그들의 이전 기여 금을 위해. 이 작품 (J.F.);에 라 그 나 Söderberg 재단에 의해 지원 되었다 스웨덴 연구 위원회 (J.F.);에 Stiftelsen 올레 Engkvist Byggmästare (J.F.);에 전략적 연구 (J.F.);에 대 한 스웨덴 재단 (J.F.);를 아 Wiberg의 기초 (J.F.)에 마리 퀴리 통합 그랜트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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