Summary
यहां हम माउस से प्रेरित erythroid progenitors उत्पादन के लिए हमारे प्रोटोकॉल वर्तमान वयस्क प्रतिलेखन कारक का उपयोग fibroblasts प्रत्यक्ष वंश reprogramminging (डीएलआर) चालित ।
Abstract
Erythroid सेल प्रतिबद्धता और भेदभाव एक वंश के सक्रियकरण के माध्यम से आगे बढ़ना प्रतिबंधित transcriptional नेटवर्क सेल भाग्य का निर्धारण और परिपक्व कारकों के एक समूह द्वारा किया । हम पहले से बाहर सेट करने के लिए लाल रक्त कोशिका fibroblasts प्रेरित erythroid progenitors/पुरोगामी (iEPs) में प्रत्यक्ष वंश reprogramminging का उपयोग कर विकास के निर्देश के लिए आवश्यक कारकों की ंयूनतम सेट परिभाषित । हमें पता चला है कि Gata1, Tal1, Lmo2, और सी Myc (GTLM) के व्यक्त तेजी से murine और मानव fibroblasts सीधे iEPs कि आकृति विज्ञान, बोना के मामले में erythroidी phenotype कोशिकाओं के समान में परिवर्तित कर सकते हैं, और जीन अभिव्यक्ति । हमारा इरादा है कि iEPs erythropoiesis और सेल भाग्य विनियमन अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा । यहां हम प्रतिलेखन कारक के माध्यम से iEPs में murine पूंछ टिप fibroblasts परिवर्तित करने की stepwise प्रक्रिया का वर्णन प्रत्यक्ष वंश reprogramminging (डीएलआर) संचालित । इस उदाहरण में, हम erythroid वंश से fibroblasts में reprogramminging-चूहों कि व्यक्त erythropoietin रिसेप्टर जीन (EpoR) प्रमोटर के नियंत्रण में पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) एक्सप्रेस, erythroid सेल के दृश्य को सक्षम करने के प्रदर्शन reprogramminging पर भाग्य प्रेरण । इस प्रोटोकॉल के बाद, fibroblasts को पांच से आठ दिनों के भीतर iEPs में पुनर्कार्यक्रम किया जा सकता है ।
हालांकि सुधार अभी भी इस प्रक्रिया के लिए किया जा सकता है, हम बताते है कि GTLM मध्यस्थता reprogramminging एक तेजी से और प्रत्यक्ष प्रक्रिया है, बोना के गुणों के साथ कोशिकाओं उपज erythroid जनक और प्रणेता कोशिकाओं ।
Introduction
लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) सभी रीढ़ में आवश्यक है और मानव शरीर के सभी कोशिकाओं के ८४% अप करना1। भ्रूण से वयस्क जीवन के लिए, हमारे स्वास्थ्य आरबीसी homeostasis के सटीक विनियमन पर अत्यधिक निर्भर है । वयस्कता में विकास के दौरान परिपक्व RBCs के चल रहे उत्पादन erythropoiesis के रूप में जाना जाता है । erythropoiesis अनुसंधान में एक प्रमुख चुनौती है मास्टर नियामकों कि आरबीसी विकास आर्केस्ट्रा और आदिम और निश्चित erythropoiesis के बीच स्विच को परिभाषित है । erythroid progenitors के प्रत्यक्ष वंश reprogramminging vivo मेंआगे erythroid विकास को समझने के लिए एक अवसर प्रस्तुत करता है ।
प्रत्यक्ष वंश reprogramminging (डीएलआर), भी transdifferentiation के रूप में जाना जाता है, एक दूसरे में सीधे एक सेल प्रकार reprogramminging की प्रक्रिया है, pluripotent और multipotent जनक चरणों को दरकिनार । डीएलआर इस प्रकार अब तक तंत्रिका2, टेम3,4,5, यकृत6 और नेफ्रोटिक7, जनक कोशिकाओं सहित कई कोशिका प्रकार के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है । विकास जीव के लिए, डीएलआर वंश प्रतिबद्धता और टर्मिनल भेदभाव के पहलुओं से पूछताछ के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है8,9प्रक्रियाओं । डीएलआर पूरक और आंशिक रूप से सेल भाग्य के तंत्र विकास के दौरान कारकों का निर्धारण समझने के लिए vivo अध्ययन में बदल सकते हैं । इस पत्र में वर्णित erythroid progenitors को reprogramminging के लिए डीएलआर प्रोटोकॉल क्षेत्र erythropoiesis के विकास के अध्ययन के लिए एक मानार्थ विधि प्रदान करता है ।
हम पहले से प्रदर्शन किया है कि एक चार कारक कॉकटेल, GATA1, TAL1, LMO2, और सी-MYC (GTLM)के व्यक्त, दोनों murine और मानव fibroblasts को सीधे reprogram erythroid progenitors के लिए पर्याप्त है (iEPs) 10. GTLM-reprogramme कोशिकाओं बहुत सदृश बोना के रूप में erythroid progenitors, phenotype, और जीन अभिव्यक्ति10के मामले में । इस प्रकार iEPs प्रसार क्षमता और nucleated एरिथ्रोसाइट्स क्षणिक निश्चित erythropoiesis की शुरुआत से पहले जल्दी भ्रूण में उत्पादित उन लोगों के लिए समान परिपक्व है । reprogramminging शर्तों (जैसे, reprogramminging कारकों या अंय कारकों के अलावा में अंक उत्परिवर्तनों) में परिवर्तन करने से, एक समझ सकते है कि यह कैसे erythroid विकास और भेदभाव में परिवर्तन होता है । हम उदाहरण के लिए दिखाया गया है कि Klf1 या Myb GTLM कॉकटेल के अलावा मुख्य रूप से भ्रूण (आदिम) से ग्लोबिन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन मुख्यतः वयस्क (निश्चित) । इस खोज corroborates erythropoiesis में विकास कारकों को परिभाषित करने के लिए एक उपकरण के रूप में डीएलआर का उपयोग करने की वैधता ।
यहां, हम माउस पूंछ टिप fibroblasts (TTF) से iEPs पैदा करने की प्रक्रिया रूपरेखा । हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, हम erythroid वंश से fibroblasts पर reprogramminging-चूहों अनुरेखण (Epor-Cre R26-eYFP) जो सभी कोशिकाओं में eYFP Rosa26 से पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (लोकस) एक्सप्रेस प्रदर्शन किया है कि erythropoietin रिसेप्टर व्यक्त किया है, erythroid वंश के लिए प्रतिबद्धता के आसान दृश्य की अनुमति । इस विधि का उपयोग करते हुए, YFP धनात्मक (EpoR +) कक्ष transduction के बाद पांच दिन के रूप में जल्दी उपस्थित होते हैं । इस प्रोटोकॉल, इसलिए, इन विट्रो मेंerythroid progenitors की पीढ़ी के लिए एक त्वरित और मजबूत तकनीक प्रदान करता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. स्थापना और प्राथमिक माउस पूंछ टिप Fibroblast संस्कृतियों का रखरखाव
- जिलेटिन-लेपित व्यंजन तैयार करें (एक पूंछ के लिए 10 मुख्यमंत्री पकवान की सिफारिश) ०.१% जिलेटिन के साथ सतह को कवर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 20 मिनट के लिए व्यंजन मशीन द्वारा । महाप्राण डिश से जिलेटिन समाधान और यह कम 2 घंटे के लिए शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- चूहों को ग्रीवा विस्थापन करके Euthanize. पूंछ के आधार पर काटने, कैंची के साथ पूंछ निकालें । 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (DPBS) के साथ है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा में पूंछ रखो (FBS) का उपयोग करने के लिए तैयार जब तक ।
नोट: सबसे अच्छे परिणामों के लिए, पूंछ 6 से 8 सप्ताह की उंर के आसपास चूहों से लिया जाना चाहिए । पूंछ चूहों उंर से अधिक उम्र के 8 सप्ताह से लिया जा सकता है, तथापि, के रूप में चूहों उम्र, fibroblasts की प्रसार क्षमता और reprogramminging की क्षमता में कमी11. - एक ऊतक संस्कृति हूड में बाँझ शर्तों के तहत इस प्रोटोकॉल के बाद के सभी चरणों का प्रदर्शन । DPBS में ०.०२% trypsin-EDTA का एक पतला trypsin समाधान तैयार करें और एक अनकोट 10 सेमी डिश में 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
- धो पूंछ, ७०% इथेनॉल में पहले, तो DPBS में । एक डिश में, पूंछ सपाट जगह और संदंश का उपयोग करने के लिए यह जगह में पकड़ । आधार से टिप करने के लिए अपनी अनुदैर्ध्य धुरी के साथ पूंछ पर एक चीरा बनाओ ।
- संदंश की एक जोड़ी के साथ पूंछ समझ और इसे खड़ी पकड़ । संदंश की एक दूसरी जोड़ी का प्रयोग, पकड़ पूंछ के आधार पर चीरा के बगल में त्वचा और इसे छील वापस । चीरा के दोनों पक्षों में इस जब तक त्वचा पूंछ की नोक की ओर नीचे खींच द्वारा बंद किया जा सकता है ।
- trypsin समाधान युक्त पकवान पर संदंश के साथ खुली पूंछ पकड़ो और लगभग 1 सेमी लंबे टुकड़ों में पूंछ में कटौती । trypsin समाधान में पूंछ के टुकड़ों के साथ, टुकड़ों को छोटे टुकड़ों में खंडित करने के लिए कैंची का उपयोग करें । 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर trypsin समाधान में पूंछ टुकड़े मशीन ।
नोट: छोटे टुकड़े इतनी के रूप में प्रत्येक टुकड़ा मात्रा अनुपात के लिए एक उच्च सतह क्षेत्र प्रदान करने के लिए पसंद कर रहे हैं । - fibroblast विस्तार (FEX) मध्यम (उच्च ग्लूकोज Dulbecco ईगल मध्यम (DMEM) 15% FBS, 2 मिमी एल-glutamine, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/Streptomycin) के साथ 2 संस्करणों का उपयोग कर trypsin बुझाने ।
- एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में पकवान की पूरी सामग्री ले लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० × जी पर केंद्रापसारक । महाप्राण supernatant और ताजा FEX माध्यम के 10 मिलीलीटर में पूंछ टुकड़े resuspend ।
- मध्यम में पूंछ के टुकड़ों को एक जिलेटिन-लेपित डिश में ट्रांसफर करें और 5% CO2 और 4% O2में ३७ ° c पर मशीन, ताजा FEX मीडियम को हर 2 दिन में जोड़कर ।
नोट: पांच से सात दिनों के बाद, पूंछ टुकड़े पकवान और fibroblasts के तल पर संलग्न है उन से दूर जा देखा जा सकता है । - एक बार fibroblasts के समूहों देखा जाता है, धीरे से पूंछ टुकड़े उखाड़ देना और मध्यम महाप्राण और सभी हड्डी टुकड़े थाली से जुड़ी fibroblasts छोड़ने के पकवान हिला । नए FEX माध्यम और संस्कृति जोड़ें fibroblasts जब तक धाराप्रवाह ।
- टेम progenitors द्वारा fibroblasts की कोई संदूषण सुनिश्चित करने के लिए, 5 मिनट के लिए 1x trypsin-EDTA का उपयोग कर प्लेट से कोशिकाओं अलग कर देना और कोशिकाओं को इकट्ठा । टेम मार्करों (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, विरोधी जीआर-1 (6G/सी), 7-4, और तेर-११९) एक चुंबकीय पृथक्करण प्रणाली10का उपयोग कर व्यक्त कोशिकाओं के लिए गिरेगा ।
2. Retrovirus उत्पादन
- बीज retroviral पैकेजिंग कोशिकाओं पर लगभग २.५ × 104 कोशिकाओं/सेमी2 (२.० × 10 एक 10 सेमी डिश के लिए6 कोशिकाओं) एक ऊतक संस्कृति पर इलाज (वैक्यूम द्वारा गैस प्लाज्मा) पकवान और संस्कृति उच्च ग्लूकोज DMEM में रातोंरात 10% FBS, 10 मिमी सोडियम के साथ पाइरूवेट, और १०० U/एमएल पेनिसिलिन/Streptomycin पर ३७ ° c और 5% सह2.
- निंनलिखित सुबह, मध्यम बदलने के लिए कोई additives आधा संस्कृति के लिए इस्तेमाल की मात्रा रात का उपयोग कर के साथ DMEM (एक 10 सेमी डिश के लिए 5 मिलीलीटर) । दोपहर में, जांच करें कि कोशिकाओं 70-80% धाराप्रवाह और अभिकर्मक शुरू कर रहे हैं ।
- प्रत्येक reprogramminging कारक के लिए, Gata1, Tal1, Lmo2, और सी-Myc, अभिव्यक्ति सदिश का एक 2:1 मिश्रण तैयार (pMX) और सहायक वेक्टर (झूठ और पोल जीन युक्त) । fibroblasts की 10 सेमी डिश के लिए, DMEM माध्यम में १०० µ एल के एक अंतिम खंड में अभिव्यक्ति वेक्टर और हेल्पर के 3 µ जी के 6 µ जी का उपयोग करें ।
- प्रत्येक reprogramminging कारक के लिए, एक बाँझ polystyrene ट्यूब में कमरे के तापमान (आरटी) DMEM के ३०० µ एल तैयार करने और ध्यान से वाणिज्यिक अभिकर्मक एजेंट के 27 µ एल जोड़ें ।
नोट: अभिकर्मक रिएजेंट उपयोग करने से पहले RT करने के लिए लाया जाना चाहिए और यौगिक के इलेक्ट्रोस्टैटिक गुण यह ट्यूब के प्लास्टिक की दीवार के लिए छड़ी कर सकते हैं के रूप में सीधे माध्यम में जोड़ा जाना चाहिए. - अभिकर्मक रिएजेंट युक्त ट्यूब, भंवर संक्षेप में प्लाज्मिड मिश्रण जोड़ें और आरटी में 15 मिनट के लिए अभिकर्मक रिएजेंट-डीएनए मिश्रण गर्मी । संक्षेप भंवर मिश्रण और यह retroviral पैकेजिंग कोशिकाओं को dropwise जोड़ने इतना है कि अभिकर्मक एजेंट-डीएनए मिश्रण समान रूप से संस्कृति और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर में फैला है ।
- 24 ज अभिकर्मक के बाद, मध्यम को DMEM से 20% FBS और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/Streptomycin के साथ बदलें । अभिकर्मक के बाद ४८ ज, supernatant इकट्ठा और एक ०.२२ µm ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के माध्यम से यह फिल्टर ।
नोट: वायरल supernatants-८० डिग्री सेल्सियस के लिए जमे हुए किया जा सकता है और आवश्यक जब तक रखा, हालांकि transduction अधिक कुशल अगर ताजा वायरल supernatant प्रयोग किया जाता है ।
3. GTLM transduction और iEP हार्वेस्ट
- बीज पर पूंछ टिप fibroblasts 1 × 104 कोशिकाओं/सेमी2 पर ०.१% जिलेटिन पूर्व FEX मध्यम में लेपित व्यंजन और ३७ ° c पर गर्मी के लिए 24 ज ।
- अगले दिन, एक transduction मिश्रण के रूप में तैयार निंनानुसार है ।
- प्रत्येक reprogramminging कारक के लिए वायरल supernatant के 1 खंड जोड़ें 4 µ जी के साथ पूरक/एमएल retroviral संक्रमण एजेंट (४०%) FEX मध्यम (६०%) के 6 संस्करणों के लिए ।
- fibroblasts के 10 सेमी डिश के लिए, प्रत्येक वायरल supernatant के 1 मिलीलीटर जोड़ें (4 × वायरस = 4 मिलीलीटर) 4 µ जी के साथ पूरक है/retroviral संक्रमण रिएजेंट के 6 मिलीलीटर के लिए FEX मध्यम, कुल 10 मिलीलीटर transduction मिश्रण दे रही है ।
- fibroblast कल्चर से FEX मीडियम महाप्राण और इसे transduction मिश्रण से बदलें । hypoxic शर्तों में ३७ ° c पर 4 ज के लिए transduction मशीन (5% सह2 और 4% हे2) ।
- transduction मिश्रण महाप्राण और इसे ताजा reprogramminging मध्यम (सीरम मुक्त विस्तार मध्यम (SFEM), १०० u/mLPenicillin/Streptomycin, १०० एनजी/एमएल murine स्टेम सेल फैक्टर (mSCF), 10 एनजी/एमएल murine interleukin-3 (IL3), 2 U/एमएल मानव रिकॉमबिनेंट के साथ बदलें Erythropoietin (hrEPO), और १०० एनएम डेक्समेतएसॉनी) ।
- hypoxic स्थितियों में 8 daysat ३७ ° c के लिए मशीन, ताजा reprogramminging मध्यम हर 2 दिन जोड़ने । पांच से आठ दिनों के बाद, सफल reprogramminging कोशिकाओं है कि थाली से अलग है समूहों की उपज होगी ।
- विश्लेषण के लिए reprogrammeed कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, धीरे ऊपर और नीचे पकवान से उंहें सीधे फसल के लिए । तुलना के लिए untransduced fibroblasts फसल के लिए, अलग कर देना प्लेट 1x trypsin-EDTA का उपयोग कर से कोशिकाओं और इकट्ठा ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहां हम वयस्क fibroblasts से iEPs के उत्पादन के लिए एक reproducible प्रोटोकॉल प्रस्तुत प्रतिलेखन कारक-चालित डीएलआर का उपयोग कर । हम सेल reprogramminging प्रवाह cytometry, कॉलोनी बनाने की परख का उपयोग कर मूल्यांकन, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण । आदेश में erythroid सेल भाग्य को रूपांतरण के दृश्य में सहायता करने के लिए, हम erythroid वंश से fibroblasts पर reprogramminging-चूहों अनुरेखण (Epor-Cre R26-eYFP) जो पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eYFP) एक्सप्रेस प्रदर्शन सभी कोशिकाओं में Rosa26 लोकस से कि erythropoietin रिसेप्टर व्यक्त (Epor, Cre एलील अंतर्जात Epor के एक लोकस में खटखटाया) अपने विकास के किसी भी स्तर पर प्रतिलिपि12,13 ( चित्र 1A) । प्रेरित erythroid progenitors के सफल reprogramminging के बाद, YFP सकारात्मक (EpoR +) कोशिकाओं के रूप में पांच दिनों के रूप में जल्दी transduction के बाद देख रहे हैं । reprogramminging के 5 दिन तक, कोशिकाओं दौर हो, थाली की सतह से उठा और समूहों के गठन शुरू करते हैं । 5 दिवस-iEPs एक erythroid प्रणेता की तरह आकृति विज्ञान, कि एक विशेषता केंद्रीय नाभिक, मोटे क्रोमेटिन, और नीले कोशिका द्रव्य के बाद मई-Grünwald-Giemsa धुंधला (चित्रा 1सी) की सुविधा प्रदर्शित करते हैं । कुछ कोशिकाओं के Hemoglobinization सकारात्मक benzidine धुंधला और एक हल्के लाल रूप से स्पष्ट है जब गोली (1 d-E) । इसके अलावा, 5 दिन के एक छोटे से अंश-iEPs सह एक्सप्रेस YFP और erythroid-विशिष्ट सतह मार्कर Ter119 (चित्रा 1एफ) । 8 दिन तक, बड़े YFP + क्लस्टर देखा जा सकता है । दिन 8iEPs वर्तमान एक अधिक विभेदित erythroid phenotype भन्दा दिन ५ iEPs; वे काफी छोटे हैं, और अधिक हीमोग्लोबिन जमा है, और यह भी Ter119 की काफी विनियमित अभिव्यक्ति दिखाने (आंकड़ा 1b-1G) । Cyto-8 दिन के spins-iEPs प्रकट erythroid की तरह आकृति विज्ञान, जबकि बहुत कुछ enucleated reticulocytes (चित्रा 1एच) मनाया जाता है ।
मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (थोक iEPs 8 दिन में एकत्र की qPCR) द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलता है कि वे fibroblast जीन के लगभग बंद अभिव्यक्ति है और erythroid जीन सहित कई ग्लोबिन जीन को विनियमित किया है, मुख्य रूप से भ्रूण प्रकार (चित्रा 1मैं) व्यक्त । multipotent progenitors के माध्यम से reprogrammeed कोशिकाओं संक्रमण का आकलन है कि क्या, हम एक समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन किया और reprogrammeing भर टेम मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण । हम पहले की सूचना दी है कि erythroid के अग्रदूत साबित उत्पादन दिन पर सबसे अधिक था 6, दिन 8 द्वारा पीछा किया, १०.५% ± ४.६% और ६.६% का ± ०.५% के साथ जीना YFP + कोशिकाओं सह व्यक्त CD71 और Ter119, क्रमशः10। वहां भी Ter119 सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति से पहले CD41 सकारात्मक कोशिकाओं की आबादी है । न तो सी किट और न ही CD45 मार्करों, जो आमतौर पर erythropoiesis में टेम जनक और downregulated में व्यक्त कर रहे हैं, reprogramminging में किसी भी बिंदु पर व्यक्त कर रहे है (चित्रा 1जंमू) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि कोशिकाओं को एक multipotent टेम जनक या पहले चरण के माध्यम से नहीं जाना है, हालांकि एक megakaryocyte-erythroid जनक के माध्यम से शायद संक्रमण है ।
reprogramminging की दक्षता का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका BFU-ई कॉलोनी reprogramminged कोशिकाओं पर परख बनाने के प्रदर्शन है । इन विट्रो में 5 दिन के विभेद की क्षमता-और 8 दिन-iEPs मानव erythropoietin, murine स्टेम सेल फैक्टर, और डेक्समेतएसॉनी के साथ पूरक methylcellulose में परख की थी । 8 दिनों के बाद, iEPs कालोनियों के दो प्रकार के गठन: अलग लाल (लाल iEP) और नहीं दिख लाल (गैर लाल iEP) । जबकि लाल कालोनियों से कोशिकाओं erythroblast आकृति विज्ञान प्रदर्शित, गैर लाल कालोनियों से कोशिकाओं erythroid कोशिकाओं के समान नहीं था, और अनियमित थे, बड़े गहरे नीले और दानेदार कोशिका द्रव्य (चित्रा 2ए) था ।
दिन के 5-iEPs, १,००० में लगभग 1 लाल कालोनियों का गठन किया है, जबकि केवल लगभग 1:10000 दिन 8-iEPs लाल कालोनियों का गठन, गैर लाल कालोनियों का एक बहुत अधिक अनुपात के साथ गठन (2बी) । 5 दिन और दिन 8-iEPs के बीच कॉलोनी बनाने की क्षमता में यह कमी 5-8 दिनों और GTLM अभिव्यक्ति वैक्टर समय पर मुंह बंद करने पीड़ित से भेदभाव के दौर से गुजर byiEPs समझाया जा सकता है । qPCR विश्लेषण की पुष्टि की है कि exogenous प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति काफी दिनों से 5 से 8 कम हो जाती है । के रूप में सफल reprogramminging में उंमीद, अंतर्जात Gata1, Tal1, Lmo2, और सी-Myc की अभिव्यक्ति का स्तर प्रेरित कर रहे हैं, तथापि, अंतर्जात Lmo2 अभिव्यक्ति केवल बहुत नीच व्यक्त (चित्रा 2सी) है ।
ध्यान दें की एक बिंदु है, और परख की एक सीमा है कि गैर लाल मैक्रोफेज युक्त कालोनियों-कोशिकाओं की तरह लाल हीमोग्लोबिन कॉलोनियों में reprogrammeed fibroblasts द्वारा गठित कॉलोनियों-परख बनाने की संख्या । कॉलोनी बनाने की क्षमता वाले लाल iEP कालोनियों को GTLM कारकों के stoichiometric अनुपात में बदलकर सुधारा जा सकता है. Transducing Tal1 और Lmo2 अभिव्यक्ति वैक्टर की दोहरी राशि के साथ कोशिकाओं गैर लाल कालोनियों पर लाल कालोनियों के अनुपात में एक मामूली वृद्धि के लिए नेतृत्व किया, जबकि अतिरिक्त Gata1 लाल कालोनियों के गठन में एक उल्लेखनीय वृद्धि करने के लिए नेतृत्व और लगभग गैर के एक पूर्ण उंमूलन लाल erythropoiesis में इन कारकों के लिए महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन कालोनियों (चित्रा 2डी) । दिलचस्प है, सी की अभिव्यक्ति में वृद्धि -Myc तेजी से गैर-लाल कालोनियों के उत्पादन में reprogramminging के लिए अपरिहार्य होने के बावजूद बढ़ जाती है । बहाव विश्लेषण के लिए शुद्ध प्रेरित erythroid progenitors प्राप्त करने के लिए, कालोनियों को कॉलोनी बनाने की परख से अलग किया जा सकता है । हम 5 दिन से लाल और गैर लाल कालोनियों पर microarray के रूप में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन किया-iEPs और १४.५ दिनों से कालोनियों पोस्ट सहवास (डीपीसी) भ्रूण जिगर (FL) और वयस्क अस्थि मज्जा (बीएम) तुलना के लिए । microarray डाटा NCBI के जीन एक्सप्रेशन सर्वग्राही (भू): GSE73344 के माध्यम से सुलभ हैं । हम पहले से पता चला है कि लाल iEP कालोनियों जीन अभिव्यक्ति10द्वारा बोनाी erythroid कालोनियों (FL और बीएम) सदृश । प्रत्येक कॉलोनी में Gata1, Tal1, Lmo2, और सी-Myc की अभिव्यक्ति की परीक्षा से पता चलता है कि जबकि लाल कालोनियों FL और बीएम के लिए सभी चार कारकों की अभिव्यक्ति के समान स्तर दिखाने के लिए, गैर लाल कालोनियों की कम अभिव्यक्ति है सभी कारकों, विशेष रूप से Gata1 (चित्रा 2ई) । यह समझने के लिए कि मैक्रोफेज-जैसी कोशिकाओं वाली गैर-लाल कॉलोनियाँ क्या हैं, हमने microarray डेटा से प्रत्येक प्रकार की कॉलोनियों में कोशिका प्रकार के विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति का सर्वेक्षण किया. जैसा कि पहले की रिपोर्ट, लाल कालोनियों कई erythroid-विशिष्ट जीन, FL और बीएम के समान व्यक्त करते हैं । आंकड़ों पर गौर करने के बाद, यह स्पष्ट है कि गैर लाल कालोनियों मैक्रोफेज कोशिकाओं14 (चित्रा 2एफ) की विशेषता जीन की एक संख्या की उच्च अभिव्यक्ति दिखाते हैं । न तो लाल और न ही गैर लाल कालोनियों ठेठ megakaryocyte जीन15की अभिव्यक्ति काफी वृद्धि हुई दिखाओ । साथ में, इन आंकड़ों का सुझाव है कि गैर लाल कालोनियों और अधिक बारीकी से एरिथ्रोसाइट्स से मैक्रोफेज सदृश । जब GTLM कारकों में से एक एक या अधिक reprogramminging कारकों में से एक या अधिक की अभिव्यक्ति का स्तर Gata1, Tal1, Lmo2 से कम कर रहे है जब गैर लाल कालोनियों में से एक को हटा रहे है जब इन मैक्रोफेज कोशिकाओं का गठन किया जा करने के लिए लग रहे है कभी नहीं मनाया iEPs के लिए reprogramminging के लिए आवश्यक है । साथ में, यह पता चलता है कि सभी चार GTLM कारकों की अभिव्यक्ति का स्तर TTF में iEP reprogramminging के लिए महत्वपूर्ण है और कि विविधता व्यक्तिगत कोशिकाओं है, जो संभावित समायोजित द्वारा सही किया जा सकता है की अपूर्ण reprogramminging द्वारा समझाया गया है stoichiometric अनुपात ।
दक्षता और हमारे प्रोटोकॉल की मजबूती का आकलन करने के लिए, हम fibroblasts के सेट संख्या की क्षमता का परीक्षण करने के लिए iEP कोशिकाओं के दृश्य समूहों का उत्पादन 5 दिन के बाद जब ३८४ में संस्कृति-अच्छी तरह से प्लेटें । हम निर्धारित किया है कि 20 के 24 transductions के बाहर, 30, ४०, और ५० TTFs, कुओं की संख्या के साथ एक iEP क्लस्टर था 3 (०.६% की प्लेट्स fibroblasts), 15 (२.०% प्लेट्स की fibroblasts), 15 (१.६% प्लेट्स की fibroblasts), और 13 (१.१% प्लेट्स की fibroblasts) क्रमशः. यह पता चलता है कि GLTM iEP reprogramminging एक मजबूत और विश्वसनीय प्रक्रिया है कि 1% की एक दक्षता तक पहुंच सकते है ।
अंय कारकों है कि reprogramminging की दक्षता को प्रभावित कर सकते है fibroblasts और संस्कृति की स्थिति के बीतने संख्या शामिल हैं । हम TTFs कि तीन बार या नौ बार transduction से पहले पारित किया गया था की reprogramminging दक्षता की तुलना में । TTFs कि नौ बार पारित किया गया था (P9) iEPs के समूहों का उत्पादन करने की क्षमता में एक नाटकीय कमी दिखाई (चित्रा 3ए) । दिलचस्प है, सीरम के reprogramminging मीडिया में शामिल किए जाने के पूरी तरह से ब्लॉक reprogramminging, erythroid साइटोकिंस के साथ सीरम की जगह transduced कारकों सीरम से संकेत समझौता बिना नए सेल भाग्य ड्राइव करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है । सीरम हटाने और कोशिका के भीतर नए कारकों की अभिव्यक्ति कोशिकाओं पर तनावपूर्ण होने की संभावना है । दरअसल, p53 सक्रियण अवरुद्ध बहुत iEPs उत्पंन की संख्या में वृद्धि हुई । इस प्रभाव को p53 नॉकआउट fibroblasts (चित्रा 3बी डी) के reprogramminging में भी देखा जा सकता है । p53 संकेत के निषेध अधिक सेल अस्तित्व और बेहतर reprogramminging की ओर जाता है और उपज में सुधार के लिए एक मांय विधि है । अंत में, hypoxic स्थितियों में reprogramminging अनुकूल है, लेकिन iEP उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण नहीं है । हालांकि, transduced TTFs normoxia में cultureed reprogram करने के लिए बहुत धीमी है और iEP क्लस्टर 10 दिनों के बजाय पांच से आठ दिनों (चित्रा 3ई) के बाद मनाया जाता है ।
चित्रा 1 : Gata1 की मजबूर अभिव्यक्ति , Tal1, Lmo2, और सी-Myc reprograms murine वयस्क fibroblasts erythroid progenitors में जो बोना के गुण erythroid की कोशिकाओं का प्रदर्शन । (क) प्रतिलेखन कारक के लिए प्रायोगिक डिजाइन-मध्यस्थ reprogramminging of erythroid रिपोर्टर (Epor-Cre R26-eYFP) टेल टिप fibroblasts (TTF) से Epor + पुनः कार्यक्रम कक्ष । (बीएफ) untransduced TTFs (दिन 0) और थोक GTLM-transduced TTFs के iEP पीढ़ी के समय पाठ्यक्रम 5 और 8 (n = 2-3 के प्रतिनिधि) । Transdifferentiation द्वारा मूल्यांकन किया गया था (ख) जियो-सेल, उज्ज्वल-एकल कुओं के क्षेत्र छवियों (स्केल बार, ५० µm); (ग) मई-Grünwald's-Giemsa धुंधला cyto-स्पिन (स्केल बार, 20 µm); (D) Benzidine/Giemsa धुंधला cyto-स्पिन (स्केल बार, 20 µm); (ङ) कोशिका छर्रों का macroscopic निरीक्षण; और (च) प्रतिनिधि प्रवाह cytometry कथानक दिखा YFP/Ter119 अभिव्यक्ति. (छ) iEPs के सेल व्यास 5 और 8 दिनों पर काटा कई cyto-स्पिन स्लाइड से मापा, 8 दिन पर सेल आकार में कमी दिखा । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (n = 21-25); टी-टेस्ट न होने से पी ≤ ०.०००१ (ज) GTLM-transduced TTFs के प्रतिनिधि उच्च संकल्प benzidine/Giemsa images of day 8. स्केल बार, 5 µm. (I) प्रासंगिक fibroblast के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति-और erythroid-विशिष्ट जीन सहित ग्लोबिन untransduced में TTFs जीन (ग्रे कॉलम) बनाम थोक GTLM-transduced TTFs (लाल कॉलम) दिन 8 पर, qPCR द्वारा निर्धारित । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 4-6 iEPs के लिए, n = 2 untransduced TTFs के लिए) । (ञ) untransduced TTF के समय-पाठ्यक्रम प्रवाह cytometry विश्लेषण का सारांश दर्शाते हुए ग्राफ (day 0) और बल्क GTLM-transduced TTF को दिन में 2, 4, 6 और 8 में YFP, CD45, CD71 और Ter119 अभिव्यक्ति (n = 3) दिखाकर काटा गया. डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । चित्रा Capellera-गार्सिया एस, एट अलसे अनुकूलित है । 10. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : GTLM iEPs BFU-ई कॉलोनी की परख में लाल और गैर लाल कालोनियों का उत्पादन । (क) प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र और मई-Grünwald-Giemsa cytospin की छवियों iEP-व्युत्पंन लाल और गैर लाल कालोनियों । स्केल बार्स, ५० µm (कॉलोनी छवियां) और 10 µm (cyto-स्पिन छवियां) । (ख) कॉलोनी गणना मढ़वाया untransduced TTFs, थोक दिन 5 iEPs और थोक दिन 8 से उत्पंन । डेटा मतलब ± एसडी (एन = 3) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; p ≤ ०.०००५; p ≤ ०.०००१ द्वारा दो तरह से ANOVA. (ग) Gata1के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति, Tal1, Lmo2, और सी- Myc में untransduced TTF और बल्क GTLM-transduced TTF की कटाई दिन में 5 और दिन 8, qPCR द्वारा निर्धारित की गई. प्राइमरों ताकि अंतर्जात अभिव्यक्ति कुल अभिव्यक्ति से प्रतिष्ठित किया जा सकता है डिजाइन किए गए थे । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 4-6 iEPs के लिए, n = 2 untransduced TTF के लिए) । (घ) मढ़वाया untransduced TTFs से उत्पंन कॉलोनी गिनती, और थोक दिन 5 iEPs GTLM कारकों में से प्रत्येक के अनुपात दोहरीकरण द्वारा उत्पंन । डेटा मतलब ± एसडी (एन = 3) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; * * p ≤ ०.००१; p ≤ ०.०००१ द्वारा दो तरह से ANOVA. (ङ) Gata1की सापेक्ष अभिव्यक्ति, Tal1, Lmo2, और सी-Myc में untransduced fibroblasts और चुनी गई कालोनियों से उत्पन्न GTLM-transduced iEPs (लाल और गैर-लाल), १४.५ डीपीसी भ्रूण जिगर और वयस्क अस्थियां मज्जा, microarray द्वारा निर्धारित । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; * p ≤ ०.०५; * * p ≤ ०.००५. p ≤ ०.०००५; p ≤ ०.०००१ द्वारा दो तरह से ANOVA. (च) erythroid (ऊपर) में उनकी अभिव्यक्ति के लिए जाना जाने वाले चयनित जीन की सापेक्षिक अभिव्यक्ति, megakaryocyte (मध्य), और मैक्रोफेज (नीचे) कक्षों में untransduced fibroblasts और चुनी गई कालोनियों में GTLM-transduced iEPs (लाल और गैर-लाल) से उत्पन्न, 14.5 डीपीसी भ्रूण जिगर और वयस्क अस्थि मज्जा, microarray द्वारा निर्धारित । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; * p ≤ ०.०५; * * p ≤ ०.००५. p ≤ ०.०००५; p ≤ ०.०००१ द्वारा दो तरह से ANOVA. चित्रा Capellera-गार्सिया एस, एट अल से अनुकूलित है । 10. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : GTLM reprogramminging एक मजबूत और विश्वसनीय प्रक्रिया है । (क) १०,००० TTFs और पूंछ टिप fibroblasts (TTF) है कि तीन मार्ग (पी 3) या नौ मार्ग (P9) reprogramminging से पहले आया है की reprogramminging के 5 दिन पर प्रतिनिधि चित्रों से मनाया समूहों की संख्या का ग्राफ । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (n = 6); स्केल बार्स ५० µm हैं । (बीडी) iEP क्लस्टर के प्रतिनिधि चित्र 6 दिनों के बाद (ख) पूंछ टिप fibroblasts के GTLM reprogramminging; (ग) p53DN अभिव्यक्ति वेक्टर के अलावा TTFs के GTLM reprogramminging; (घ) p53 नॉकआउट TTFs (स्केल बार्स = ५० µm) के GTLM reprogramminging । (ङ) iEP समूहों के प्रतिनिधि चित्रों GTLM reprogramminging के 10 दिनों के बाद normoxic शर्तों पर प्रदर्शन किया (स्केल बार = ५० µm) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
एक चार कारक कॉकटेल, GATA1, TAL1, LMO2, और सी-MYC (GTLM)के व्यक्त करने के लिए पर्याप्त murine fibroblasts और मानव iEPs करने के लिए सीधे है10। reprogrammeed erythroid कोशिकाओं बहुत आकृति विज्ञान, phenotype, जीन अभिव्यक्ति, और कॉलोनी बनाने की क्षमता के मामले में erythroid progenitors के सदृश । यह खोज hematopoiesis में विकास कारकों को परिभाषित करने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रत्यक्ष reprogramminging का उपयोग करने के औचित्य corroborates । इस विधि की वैधता का समर्थन करने के लिए, iEPs भी माउस भ्रूण fibroblasts और मानव चमड़ी fibroblasts की GTLM प्रेरण का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, दिखा रहा है कि यह विभिन्न मूल के fibroblasts के लिए काम करता है और10प्रजातियों के पार. इस रिपोर्ट में, हम erythroid वंश से fibroblasts के reprogramminging प्रेरित-एक उपकरण के रूप में माउस अनुरेखण एक erythroid कोशिका को रूपांतरण कल्पना । इस माउस का उपयोग उपयोगी है, लेकिन प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण नहीं है । हम नियमित रूप से विभिंन माउस उपभेदों से fibroblast के कई प्रकार के प्रयोग reprogramminging प्रदर्शन और Ter119 और CD71 के सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति द्वारा iEPs की पहचान ।
हमारे वर्तमान विधि iEPs कि प्रदर्शन एक आदिम erythroid phenotype के रूप में एक निश्चित वयस्क phenotype का विरोध उत्पंन करता है । विकास के इन चरणों के बीच एक प्रमुख अंतर अलग ग्लोबिन जीन की अभिव्यक्ति है. लेकिन, हमें पता चला है कि Klf1 और Myb के अलावा GTLM कॉकटेल परिवर्तन करने के लिए मुख्य रूप से भ्रूण से iEPs ग्लोबिन अभिव्यक्ति पैटर्न मुख्यतः वयस्क10,14। दिलचस्प है, Gata2 और Runx1 के अलावा चार कारक कॉकटेल और मध्यम में thrombopoietin को megakaryocytic वंश16की ओर reprogramminging प्रक्रिया को पक्षपाती ।
GTLM प्रेरित iEPs एक आदिम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर और एक सीमित प्रफलन क्षमता के साथ erythroid progenitors का उत्पादन । इसके अलावा, iEPs बहुत कुछ enucleated एरिथ्रोसाइट्स उत्पादन । गरीब erythroid जनक विस्तार करने के लिए किट + निश्चित erythroid कोशिकाओं है, जो संभवतः अंय एक निश्चित जीन अभिव्यक्ति के साथ iEPs के लिए प्रत्यक्ष reprograming उत्प्रेरण कारकों के अलावा के साथ प्राप्त हो सकता है reprogram विफलता द्वारा समझाया गया है प्रोग्राम.
हमारे डेटा भी गरीब enucleation क्षमता का सुझाव तथ्य GTLM प्रेरित iEPs एक आदिम, बजाय एक निश्चित जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम के साथ पुरोगामी उत्पंन द्वारा समझाया गया है । संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन पर कई प्रयास सुधार enucleation बिना प्रयास किए गए । दोनों जनक प्रसार और enucleation क्षमता बढ़ाने के लिए चल रहे प्रयास इसलिए निश्चित iEPs को reprogramminging उत्प्रेरण के लिए लापता कारकों की पहचान पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं ।
लाल iEP कालोनियों के इष्टतम उत्पादन के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं के सभी चार वैक्टर और GTL जीन उच्च स्तर पर व्यक्त कर रहे है के साथ transduced हैं । दुर्भाग्य से वर्तमान में सबसे कुशल विधि वेक्टर titers के पूर्व नियंत्रण की अनुमति नहीं है । bicistronic lentiviral वैक्टर का उपयोग कर दक्षता में सुधार करने का प्रयास सफल नहीं था, संभवतः अवर stoichiometry या अपर्याप्त अभिव्यक्ति के स्तर के साथ मुद्दों के कारण । जबकि काम करने के लिए reprogramminging वैक्टर सुधार चल रहा है, सबसे कुशल विधि पहले से वर्णित retroviral वैक्टर केवल एक ही कारक है और कोई चयन मार्कर जीन व्यक्त के साथ हौसले से उत्पादित वेक्टर supernatant के संयोजन का उपयोग कर रहता है ।
iEPs करने के लिए GTLM reprogramminging केवल रिपोर्ट एक प्रतिबद्ध दैहिक कोशिका से erythroid जनक की तरह कोशिकाओं का उत्पादन करने में सक्षम प्रोटोकॉल है । एक अनुसंधान उपकरण के रूप में डीएलआर iEP विधि इसलिए अंय erythroid सेल मॉडल सिस्टम पर कई लाभ है जैसे erythroid सेल लाइनों HiDEPs/HuDEP कोशिकाओं (PMID: २३५३३६५६)17। जबकि HiDEPs/HuDEP कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर एरिथ्रोसाइट उत्पादन और टर्मिनल erythropoiesis के दौरान जीन समारोह के मूल्यांकन के लिए और अधिक सुविधाजनक उपकरण हैं, GTLM को iEPs reprogramminging के अद्वितीय लाभ के लिए सीधे कोर का अध्ययन करने की क्षमता है transcriptional erythroid सेल भाग्य का निर्धारण कार्यक्रम । GTLM reprogramminging मनुष्यों और माउस में दोनों erythropoiesis का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य मंच प्रदान करता है, उदाहरण के लिए, आदिम और निश्चित erythropoiesis के बीच स्विच का अध्ययन करने के लिए । इस स्विच को समझना hemoglobinopathies के संभावित उपचार में भारी ब्याज की है, जैसे सिकल सेल एनीमिया, जिसमें शोधकर्ताओं ने भ्रूण हीमोग्लोबिन के लिए वयस्कों में स्विच रिवर्स करने के लिए प्रयास करने के लिए रोग को कम.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों की रिपोर्ट के लिए ब्याज का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
हम एवलिन वांग और ग्रेगरी हाइड (व्हाइटहेड संस्थान, कैंब्रिज, एमए) क्लोनिंग और हार्वे Lodish के लिए धंयवाद (व्हाइटहेड संस्थान) retroviral पुस्तकालय पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया plasmids के कई प्रदान करने के लिए । हम Kavitha शिव और Sofie Singbrant (आणविक चिकित्सा और जीन चिकित्सा विभाग, Lund विश्वविद्यालय), Göran कार्लस्सन और श्मित सोनेजी (आणविक रुधिर विभाग, Lund विश्वविद्यालय) iEP उत्पादन के वर्णन में अपनी भूमिकाओं के लिए धंयवाद । हम यह भी स्वीकार करते है और धंयवाद जूलियन Pulecio (अपक्षयी चिकित्सा के केंद्र, बार्सिलोना जैव चिकित्सा अनुसंधान पार्क), Violeta रेयान-एस्ट्राडा (रॉकफेलर विश्वविद्यालय, ंयूयॉर्क), कार्ल Walkley (सेंट विंसेंट चिकित्सा अनुसंधान संस्थान और चिकित्सा विभाग, सेंट विंसेंट अस्पताल, मेलबोर्न विश्वविद्यालय), Ángel राया (कातालान अनुसंधान और उंनत अध्ययन, बार्सिलोना के लिए संस्था), और विजय जी शंकरन (व्यापक प्रौद्योगिकी और हार्वर्ड, कैंब्रिज के मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट के संस्थान ) इस काम के लिए उनके पिछले योगदान के लिए । यह काम राग् Söderberg फाउंडेशन (J.F.) द्वारा समर्थित था; स्वीडिश अनुसंधान परिषद (J.F. के लिए); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (to J.F.); सामरिक अनुसंधान के लिए स्वीडिश फाउंडेशन (J.F. के लिए); Åke Wiberg की बुनियाद (to J.F.); एक मैरी क्यूरी एकीकरण अनुदान (J.F. करने के लिए) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
