Summary
ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統 (DLR)。
Abstract
赤芽球系細胞と分化細胞の運命を決定する、要因の成熟のグループによって仕組まれた血統制限の転写ネットワークの活性化を続行します。以前誘導赤芽球前駆細胞/前駆体 (投資事業組合) に線維芽細胞のプログラムし直す直接系統を使用した赤血球の開発を指示するために必要な要因の最小限のセットを定義に着手しました。Gata1、過剰発現を示したTal1、 Lmo2、およびC-myc (GTLM) が急速に変換マウスおよびひと線維芽細胞直接投資事業組合形態の観点から善意の赤芽球系細胞のように表現型、遺伝子発現。組合が赤血球や細胞の運命制御を研究する非常に貴重なツールを提供する予定です。ここで我々 は投資事業組合経由で転写因子駆動直接系統 (DLR) のリプログラミングにマウス尾先端線維芽細胞を変換する段階的なプロセスをについて説明します。この例では赤芽球系細胞の可視化を有効にする、エリスロポエチン受容体遺伝子 (EpoR) プロモーターの制御下の黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を表す赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行う運命誘導リプログラミングに。このプロトコルでは、次は、この線維芽細胞を 5 ~ 8 日以内投資事業組合に書き換えることができます。
改善はプロセスにまだ行うことができます、ことを示すリプログラミング GTLM を介した迅速かつ直接プロセスbona fideのプロパティを持つセルの赤芽球系前駆細胞および前駆細胞を降伏します。
Introduction
赤い血球 (赤血球) はすべての脊椎動物に欠かせない、人間の体の1のすべてのセルの 84% を占めています。胚は大人の生活に、私たちの健康は RBC の恒常性の厳密な規則に依存です。大人になって開発全体を通して成熟した赤血球の継続的な生産は、赤血球と呼ばれます。赤血球の研究の主要な課題は、RBC 開発とプリミティブと決定的な赤血球間のスイッチの組み合わせによって、マスターのレギュレータを定義することです。直接系統の赤芽球系前駆細胞のリプログラミング赤芽球開発の生体をさらに理解する機会を示します。
直接系統のリプログラミング、分化転換としても知られている (DLR) は、リプログラミング多能性細胞と多能性前駆段階をバイパスして、別に直接 1 つの細胞型のプロセスです。DLR はこれまで神経2、造血3,4、5、肝6ネフローゼ7、前駆細胞など様々 な細胞タイプを生成する使用されています。発達生物学者の DLR の分化系列決定と分化プロセス8,9尋問側面の重要なツールとなっています。DLR を補完して生体内で研究開発中の要因を決定する細胞の運命のメカニズムの理解を部分的に交換できます。このペーパーで説明した赤芽球前駆細胞をリプログラミングの DLR プロトコルは、赤血球の発達的研究の無料メソッド フィールドを提供します。
我々 は以前 4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、誘導の赤芽球系前駆細胞に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すため十分であることを示しています。(投資事業組合)10.、GTLM 書き換え赤芽球系細胞大きく似ているbona fide原始赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子の表現のための10の面で。こうして組合は増殖能力を限定し、有核赤血球無核赤血球造血の発症前に初期胚における一過性作り出されるそれらのように成熟しました。リプログラミングの条件 (例えば、点突然変異の要因やその他の要因の追加をプログラムし直す) に変更して、どのようにこれは赤芽球発生と分化の変化につながる理解できます。たとえば示しました GTLM カクテルKlf1またはMybの添加が主に胚 (プリミティブ) からグロビン表現パターンを変更主に大人に (明確な)。この発見は、赤血球産生の発達的要因を定義するためのツールとして DLR を使用の妥当性を裏付けます。
ここでは、我々 は、マウス尾先端繊維芽細胞 (TTF) から組合を生成するプロセスを概説します。赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った代表的な実績 (EporCre R26- eYFP) すべてのRosa26軌跡から黄色い蛍光蛋白質 (eYFP) を表現するセル赤血球系統へのコミットメントを簡単に表示できるように、エリスロポエチンの受容体を表明しています。このメソッドを使用して、YFP 正 (EpoR +) 細胞が存在、早ければ 5 日伝達後です。このプロトコルは、したがって、赤芽球系前駆細胞の in vitroの世代の迅速かつ信頼性の高い技術を提供しています。
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Protocol
1. 確立及び維持プライマリ マウス尾先端培養線維芽細胞
- 0.1% ゼラチンで表面をカバーし、37 ° C で約 20 分の料理をインキュベート (1 尾 10 cm 皿をお勧めします) ゼラチン コーティングの料理を準備します。お皿からゼラチン溶液を吸引、少なくとも 2 時間乾燥するようにし、なさい。
- 頚部転位によってマウスを安楽死させます。尾の根元切断ハサミ尾を削除します。ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で尻尾 2% ウシ胎児血清 (FBS) を使用する準備ができるまで入れて下さい。
注: 最良の結果をツインテール取られるべきマウスから年齢の約 6 〜 8 週間。ツインテールは、マウスの年齢、繊維芽細胞の増殖能力と減少11をリプログラミング効率として 8 週齢、しかしより古いマウスから取ることができます。 - 無菌条件下でティッシュ文化フードのこのプロトコルのすべての後続の手順を実行します。0.02% トリプシン-EDTA DPBS の希薄トリプシン溶液を調製し、ノンコート 10 cm 皿に 5 mL を追加します。
- 最初 70% エタノール, し、DPBS で尾を洗います。皿尾がフラットに配置し、場所でそれを保持する鉗子を使用します。尾翼をベースからその縦軸に沿って先端に切開を行います。
- 1 組の鉗子で尾をつかみ、それを垂直に保持します。鉗子の 2 番目のペアを使用して、尾の基部に切開の横に皮膚をつかんで戻って皮をむきます。尾の先端に向かって下向きに引っ張って、むけて皮膚まで切開の両方の側でこれを行います。
- トリプシン溶液を含む料理をピンセットで皮をむいた尾をホールドし、約 1 cm の長さの作品に尻尾をカットします。トリプシン溶液で尻尾部分と小さな断片に作品を断片化するのにはさみを使用します。10 分の 37 ° C でトリプシン溶液でテールピースを孵化させなさい。
注: より小さい作品は、各部分の容積の比率に高い表面積を提供するために適しています。 - 線維芽細胞の拡張 (FEX) 媒体の 2 つの容積を使用してトリプシンを消す (高グルコース ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 15 %fbs、2 mM L グルタミン、非本質的なアミノ酸 (NEAA)、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン)。
- 50 mL チューブに 4 ° C で 5 分間 350 × gで遠心する料理の内容全体を収集します。上清を吸引し、新鮮な FEX 中の 10 mL で尾フラグメントを再懸濁します。
- ゼラチン コーティングの皿に中尾フラグメントを転送し、37 ° c 5% CO2と 4% O2、追加する新鮮な FEX 媒体ごとに 2 日間で孵化させなさい。
注: 5 ~ 7 日後お皿の下部に添付している尾断片と線維芽細胞はそれらから遠ざかっていると見なすことができます。 - 線維芽細胞のクラスターが取り囲み、尻尾の部分を取り除くし、媒体とプレートに接続されている線維芽細胞を残してすべての骨片を吸引する皿を軽く振る。FEX の新しい媒体を追加し、合流まで、線維芽細胞を培養します。
- 造血前駆細胞、線維芽細胞の汚染がないことを確認、5 分の 1 x トリプシン-EDTA を用いた平板から細胞を分離し、細胞を収集します。造血のマーカーを発現する細胞の枯渇 (CD117、CD5、CD45R (B220) CD11b、アンチ-グラム-1 (Ly-6 G/C)、7-4、テル 119 番) 磁気分離システム10を使用します。
2. レトロ ウイルス生産
- レトロ包装約 2.5 × 104セル/cm2 (2.0 × 106セル 10 cm の皿のために) (で真空ガス プラズマ) 組織培養処理料理と 10% と高グルコース DMEM で一晩培養細胞を播く FBS、10 mM ナトリウムピルビン酸、および 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン 37 ° C および 5% の CO2。
- 次の朝、半分のボリュームが一晩培養に使用 (10 cm 皿 5 mL) を使用して添加物なしで媒体を DMEM に変更します。午後で、セルが 70-80% の合流と、トランスフェクションを開始を確認します。
- それぞれのリプログラミング因子Gata1、 Tal1、 Lmo2、 C-myc、発現ベクター (pMX) とヘルパー ベクトル (ギャグと pol 遺伝子を含む) の 2:1 の混合物を準備します。線維芽細胞の 10 cm 皿、発現ベクターの 6 μ g、DMEM 培地に 100 μ L の最終巻でヘルパー ベクトルの 3 μ g を使用します。
- リプログラミングする要因、生殖不能のポリスチレン管で部屋の温度 (RT) DMEM の 300 μ L を準備し、慎重に商業トランスフェクション試薬の 27 μ L を追加します。
注: トランスフェクション試薬使用前に RT にもたらされる必要があり、化合物の帯電はチューブのプラスチック製の壁に固執するそれを作ることができる、媒体に直接追加する必要があります。 - トランスフェクション試薬を含むチューブ、簡潔に渦にプラスミド ミックスを追加、インキュベートした簡潔に渦混合物で 15 分のトランスフェクション試薬・ DNA の混合物と滴下レトロ包装のセルにそれを追加して、トランスフェクション試薬・ DNA ミックス文化に均等に広がっているし、37 ° C で一晩インキュベートします。
- トランスフェクション後、24 h 20 %dmem 培地に変更 FBS と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン。トランスフェクション後、48 h は上澄みを収集し、0.22 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターを介してフィルターします。
注: ウイルス上清できます-80 ° c の凍結し、伝達がより効率的な新鮮なウイルス上清を使用する場合、必要になるまでを続けた。
3. GTLM 伝達と iEP の収穫
- 種子尾先端 1 × 104セル/cm2で線維芽細胞 0.1% ゼラチン プレコート FEX 中皿し、24 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 次の日は、次のとおり伝達の混合物を準備します。
- FEX 中 (60%) の 6 巻にレトロ ウイルス感染試薬 (40%) の 4 μ G/ml を添加したそれぞれのリプログラミング因子のウイルス上清の 1 ボリュームを追加します。
- 線維芽細胞の 10 cm 皿、各ウイルス上清 1 mL を追加 (4 × ウイルス = 4 mL) 10 mL 伝達混合物の合計を与える 4 μ g/mL レトロ ウイルス感染症、FEX 中 6 mL に試薬を添加しました。
- 線維芽細胞培養から FEX 中を吸引し、伝達の混合物と置き換えます。低酸素の条件 (5% CO2および 4% O2) 37 ° C で 4 時間伝達を孵化させなさい。
- 伝達の混合物を吸引し、新鮮なリプログラミング媒体に置き換える (拡張の無血清培地 (論文)、100 U/mLPenicillin/ストレプトマイシン、100 ng/mL マウス幹細胞因子 (mSCF)、10 ng/mL マウス インターロイキン-3 (IL3)、2 U/mL 人間組換えエリスロポエチン (hrEPO)、および 100 nM デキサメタゾン)。
- 8 過ごしましたリプログラミング培 2 日ごとの追加、低酸素条件で 37 ° C の孵化させなさい。5 から 8 日後成功の書き換えプレートから切断したセルのクラスターが得られます。
- 解析プログラムし直された細胞を収集するには、お皿から直接それらを収穫するための上下ピペット優しく。比較のため untransduced 線維芽細胞を収穫、1 x トリプシン-EDTA を用いた平板から細胞を分離し、収集します。
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Representative Results
大人の線維芽細胞の転写因子ドリブン DLR を使用してから組合の生産のための再現可能なプロトコルをご紹介します。フローサイトメトリー、コロニー形成の試金、および遺伝子を使用して細胞のリプログラミングを評価する発現解析。赤芽球系細胞の運命への転換の可視化を支援するために赤芽球系の系譜トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った (EporCre R26- eYFP) (eYFP) 黄色い蛍光蛋白質を表現します。エリスロポエチン受容体 (Epor、内因性Epor座の 1 つの対立遺伝子をノックアウトした Cre) を表すすべての細胞におけるRosa26座からトラン スクリプトの開発12,13 (の任意の段階で図 1A)。赤芽球系前駆細胞を誘導の成功の書き換え、YFP 陽性 (EpoR +) 細胞が伝達後 5 日ほど早く観測可能なオブジェクト。日ごとに 5 ラウンドになる細胞のリプログラミングのプレートの表面から持ち上げるし、クラスターを形成し始めます。日 5-投資事業組合を表示 5 月グリューンヴァルト ギムザ後特性の中心核、粗クロマチンと青い細胞質を特色にする、赤芽球系の前駆物質のような形態 (図 1C) を染色します。いくつかの細胞の hemoglobinization は正ベンジジン染色とペレットされるとき穏やか赤い外観明白である (図 1E)。また、日 5 組合共同エクスプレス YFP と特異的表面マーカー Ter119 (図 1F) のごく一部。8 日までに、大規模な YFP + クラスターを見ることができます。日 8iEPs 日 5 組合; よりもより区別された赤血球の表現型を提示します。格段に小型化より多くのヘモグロビンを蓄積しているし、また示す大幅 Ter119 の誘導式 (図 1 b-1 G)。日 8-組合の細胞回転は非常に少数の除核網状観察 (図 1H)、赤芽球のような形態を明らかにします。
線維芽細胞遺伝子のほぼシャット ダウン式し主にグロビン遺伝子を含む多くの赤芽球遺伝子誘導していると 8 日目で収集された一括投資事業組合の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) による遺伝子発現解析を示しています(図 1の私) 胚の種類を表現します。プログラムし直された細胞の多能性前駆細胞を介して移行するかどうかを評価するために時間のコースを行いリプログラミング全体造血のマーカーの発現を分析します。我々 は以前、赤芽球前駆体出力された最高、6 日目に続いてライブ YFP + 細胞 CD71、Ter119、それぞれ10の共発現の 6.6% ± 0.5% と ± 10.5% 4.6%、8 日報告しました。また、Ter119 陽性細胞の出現の前に CD41 陽性細胞の人口があります。C キットも通常造血前駆細胞および赤血球産生のダウンレギュ レートで表されます、CD45 マーカーはプログラムし直す (図 1J) 任意の時点で表されます。これらのデータは、セルが移動しないことお勧め多能性造血前駆、早い段階を通じてもおそらく巨核球赤芽球前駆細胞を介して遷移を行います。
リプログラミングの効率を評価するために信頼性の高い方法は、プログラムし直された細胞 BFU E コロニー形成アッセイを行うことです。日 5 - と日 8 組合のin vitro分化能力ヒトエリスロポエチン、マウスの幹細胞因子、デキサメタゾンと補われるセルロースで検定しました。8 日後組合結成のコロニーの 2 種類: はっきりと赤い (赤い iEP) とない目に見えて赤い (赤以外 iEP)。赤色のコロニーからの細胞が赤芽球の形態を表示赤以外のコロニーからの細胞が赤芽球系細胞とは似ていないと規則的だった、大規模な深い青と粒状の細胞質 (図 2A) を持っていた。
日 5-組合、約 1 で 1,000 のみ約 - 投資事業組合 1: 10,000 の日 8 は、赤以外のコロニー形成される (図 2B) の非常に高い比率との赤いコロニーを形成した、赤色のコロニー形成。このようにコロニー形成が減少日 5 -、日 8 組合間の能力は日 5-8、GTLM 表現のベクトルが時間をかけて黙らせる苦しみから分化を受けて説明 byiEPs をあることができます。qPCR の分析には、外因性の転写産物の発現を日 5 に 8 から大幅に減少が確認されました。成功の書き換えで期待どおりには、内因性のGata1、 Tal1、 Lmo2、 C-mycの発現が誘導される、ただし、内因性 Lmo2 式は非常に卑しい表現 (図 2C) でのみ。
注記のうち、ポイントと、アッセイの限界は、マクロファージのような細胞を含む赤以外のコロニーがプログラムし直された線維芽細胞コロニー形成によって形成された赤 hemoglobinized iEP コロニーを上回っている試金。赤の iEP のコロニーを作成するコロニー形成能は、GTLM 因子の化学量論比を変更することで改善できます。赤色のコロニーの形成の重要な増加をもたらした余分なGata1赤以外の植民地に赤色のコロニーの比のわずかな増加につながったTal1とLmo2の表現のベクトル量を 2 倍に細胞を伝達ほぼ赤以外のコロニーの完全な除去は赤血球産生 (図 2D) のこれらの要因の重要な役割をサポートします。興味深いことに、 C-mycの発現を大幅に増加してリプログラミングに必要不可欠であるにもかかわらず赤以外の植民地の生産を増加させます。下流解析のための純粋な誘導赤芽を得るためには、コロニーは、コロニー形成アッセイから分離できます。赤のマイクロ アレイの形で遺伝子発現解析を行い、日 5 組合から赤以外のコロニーや植民地 14.5 日から投稿膣 (dpc) 胎仔肝 (フロリダ州) および比較のため成人の骨髄 (BM)。マイクロ アレイ データ、NCBI の遺伝子表現オムニバス (GEO) を通じてアクセスできます: GSE73344。我々 は以前に赤 iEP コロニーが遺伝子表現10(フロリダおよび BM) bona fide赤芽球コロニーを似ています。各植民地にGata1、 Tal1、 Lmo2、 C-mycの発現の検討赤色のコロニーはフロリダおよび BM にすべての 4 つの因子の発現の同じようなレベルを表示、赤以外の植民地の下式があることを示していますすべての要因、特にGata1 (図 2E)。マクロファージのような細胞を含む赤以外の植民地は何を理解するため、マイクロ アレイ データからのコロニーの各種類のセル型固有遺伝子の表現を調査しました。既報の通り赤色のコロニーは FL と BM のような多くの特異的遺伝子を表現します。後に、データを再訪、赤以外の植民地はマクロファージ細胞14 (図 2F) の特徴的ないくつかの遺伝子の高発現を示すことは明らかです。赤も赤以外の植民地は、典型的な球遺伝子15の発現の大幅増加を表示します。一緒に、これらのデータは、赤血球よりもより密接にマクロファージが似ているように赤以外の植民地をお勧めします。これらのマクロファージのような細胞をリプログラミング因子Gata1、 Tal1、 Lmo2の 1 つ以上の表現のレベルがより低いときに形成されるよう赤以外の植民地は GTLM 要因の 1 つが削除されるときを観察することがないので投資事業組合にリプログラミングに必要です。一緒に、これはすべての 4 つの GTLM 要素の発現レベルが iEP リプログラミングに TTF で重要であるとの不均一性が不完全な可能性があります調整することによって修正できる個々 の細胞のリプログラミングにより説明されている示唆しています。化学量論比。
効率性と提案手法のロバスト性を評価するために我々 はテスト 5 日後 iEP セルの表示のクラスターを生成する線維芽細胞のセット番号の能力 384-well プレートで培養した場合。我々 が判断したから 20、30、40、および 50 TTFs の 24 伝達は、iEP の少なくとも 1 つのクラスターと井戸の数 3 (プレート線維芽細胞の 0.6%)、15 (プレート線維芽細胞の 2.0%)、15 (プレート線維芽細胞の 1.6%)、および 13 (プレート線維芽細胞の 1.1%)、それぞれ。GLTM iEP リプログラミングが 1% の効率に達することができる堅牢で信頼性の高いプロセスであることが示唆されました。
リプログラミングの効率に影響を与える他の要因は、繊維芽細胞と培養条件の通路番号を含めます。伝達する前に 3 回継代されていた TTFs のまたは 9 回リプログラミング効率を比較しました。9 回継代されていた TTFs (P9) は、投資事業組合 (図 3A) のクラスターを生成する能力の劇的な減少を示した。興味深いことに、リプログラミングのメディアにおける血清の包含完全にブロック リプログラミング、赤芽球サイトカイン交換血清は血清から配合信号なしの新しい細胞の運命を車に導入された要因を許可する必要。血清の取り外しとセル内で新しい因子の発現は細胞のストレスになる可能性が高いです。確かに、p53 の活性化を大きくブロック生成投資事業組合の数が増加しました。この効果は、p53 ノックアウト線維芽細胞 (図 3B ~ D) のリプログラミングに見ることができます。多くにつながる細胞生存およびよりよいリプログラミングと歩留まり向上のための検証済みメソッドが 1 つのシグナル抑制 p53。最後に、低酸素の条件のリプログラミングは iEP の生産に不可欠ではないが好ましいです。しかし、導入された TTFs 常に培養が再プログラムする遅く、iEP クラスター (図 3E) 5 から 8 日ではなく 10 日後に観察。
図 1:善意の赤芽球系細胞の特性を表わす赤芽球系前駆細胞にマウス アダルト線維芽細胞の書き換えはGata1、Tal1、Lmo2、およびC-mycの発現を強制します。(A)転写因子を介した赤芽球系記者のプログラムし直すための実験計画 (Epor Cre R26-eYFP) EpoR + 再プログラム細胞に線維芽細胞の先端 (TTF) を尾します。(B-F)Untransduced TTFs (0 日目) の iEP 世代の時間経過と、5 と 8 の日に GTLM 導入 TTFs を一括 (n の代表的な 2-3 を =)。分化転換は単一の井戸 (バー, 50 μ m スケール); (B)生細胞、明視野画像で評価しました。(C) 5 月グリューンヴァルト-ギムザ染色細胞スピン (スケール バー、20 μ m)(D)ベンジジン/ギムザ染色細胞スピン (スケール バー、20 μ m)(E)細胞ペレット; の検査(F)代表フローサイトメトリー プロット YFP を表示/Ter119 式。(G) 5 と 8 の日に収穫した投資事業組合の細胞径は 8 日目にセルのサイズの減少を示すいくつかの細胞スピン スライドから測定されます。平均 ± SD データを提示する (n = 21-25);対になっていないtp ≤ 0.0001-テストします。8 日目に GTLM 導入 TTFs の(H)代表的な高解像度ベンジジン/ギムザ画像。スケール バーは、5 μ m (I) qPCR によって決定 untransduced TTFs (灰色列)と一括、8 日目に GTLM 導入 TTFs (赤柱) グロビン遺伝子を含む関連する線維芽細胞と赤芽球特異遺伝子の相対発現。平均 ± SD データを提示する (n = 4-6 組合、n の = untransduced TTFs のための 2)。(J)グラフ untransduced TTF (0 日) と一括 GTLM 導入の TTF 2、4、6、8 YFP、CD45、CD71 Ter119 発現を示す日で収穫の時間コースの流れフローサイトメトリー解析の概要 (n = 3)。平均 ± SD. 図は Capellera ガルシアの S から合わせられるようデータを提示するら。10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: GTLM 組合 BFU E コロニー試金赤と赤以外のコロニーを生成します。(A) iEP 由来の赤と赤以外の代表的な明るいフィールドと 5 月グリューンヴァルト ギムザ cytospin 画像植民地。尺度バー、(植民地画像) 50 μ m と 10 μ m (cyto スピン画像)。(B)メッキの untransduced TTFs から生成されたコロニー カウント 5 日目投資事業組合を一括して 8 日目に一括します。平均 ± SD データを提示する (n = 3);p ≤ 0.0005;p ≤ 0.0001 二元によって。5 日目で、8 日目の(C) Gata1、 Tal1、 Lmo2、および untransduced の TTF と一括でC-mycの相対発現 GTLM 導入 TTF 収穫が、qPCR によって決まります。プライマーは、内因性の表現は、完全な表現から区別することできるように設計されました。± SD を意味するようにデータが示される (n = 4-6 組合、n の = untransduced の TTF のための 2)。(D)から生成されたコロニー カウント メッキ untransduced TTFs との GTLM 要因の比率の倍増によって生成された 5 組合一括日。平均 ± SD データを提示する (n = 3);* * p ≦ 0.001;p ≤ 0.0001 二元によって。(E) Gata1、 Tal1、 Lmo2、 untransduced 線維芽細胞と選ばれた植民地でC-mycの相対的な表現から生成される GTLM 導入組合 (赤と赤以外)、14.5 の dpc 胎仔肝と大人の骨骨髄、マイクロ アレイによって決まります。データを提示する平均 ± SD;* p ≤ 0.05;* * p ≤ 0.005。p ≤ 0.0005;p ≤ 0.0001 二元によって。(F)マクロファージ、巨核球 (中央)、赤血球 (top) の式で知られて相対的な遺伝子発現 untransduced 線維芽細胞と GTLM 導入組合 (赤と赤以外) から生成された選ばれた植民地 (下) セル14.5dpc 胎児肝臓と成人の骨髄があり、マイクロ アレイによって決まります。データを提示する平均± SD;* p ≤ 0.05;* * p ≤ 0.005。p ≤ 0.0005;p ≤ 0.0001 二元によって。図は Capellera ガルシア S, et al.から適応10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: GTLM の書き換え堅牢かつ信頼性の高いプロセスであります。(A) GTLM の 3 つの通路 (P3) や 9 通路 (P9) プログラムし直す前に受けた尾先端芽 (TTF) のリプログラミングの日 5 10,000 TTFs の写真の代表的なクラスター数のグラフに観察。平均 ± SD データを提示する (n = 6);スケール バーは、50 μ m (B-D) iEP の代表写真クラスター (B) GTLM リプログラミング尻尾先端繊維芽細胞; の後 6 日間。(C) GTLM の TTFs の p53DN 発現ベクター; 添加とリプログラミング(D) GTLM リプログラミングの p53 ノックアウト TTFs (スケール バー = 50 μ m)。(E) iEP クラスター GTLM リプログラミングの 10 日間の培養条件の実行後の代表的な写真 (スケールバー = 50 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、組合10に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すための十分なです。プログラムし直された赤芽球系細胞には、 bona fide赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子発現及びコロニー形成能の面で大きく類似していた。この発見は、造血に発達的要因を定義するためのツールとして直接リプログラミングによる根拠を裏付けます。この手法の有効性をサポートするため投資事業組合も GTLM 誘導マウス胚性線維芽細胞とひと包皮線維芽細胞、種10の異なる起源の線維芽細胞に対応することを示すを使用して生成されることができます。本報告では、赤芽球系細胞への変換を可視化するツールとして赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを誘発します。このマウスの使用は、便利ですが、プロトコルに重要でないです。我々 は定期的に様々 なマウス系統から線維芽細胞の複数のタイプを使用して書き換えを実行し、Ter119 および CD71 の細胞表面マーカーの発現による投資事業組合を識別します。
私たちの現在のメソッドは、決定的なアダルト表現型ではなく原始的な赤血球の表現型を示す投資事業組合を生成します。開発のこれらの段階の 1 つの主な違いは、異なるグロビン遺伝子の表現です。しかし、主に胎児期から主にアダルト10,14GTLM カクテル変更組合のグロビン表現パターンにKlf1とMybを加えているを示している私たち。興味深いことに、4 因子カクテルと媒体のトロンボポエチン Gata2 の Runx1 に加えてバイアス巨核芽球系統16プログラムし直すプロセスです。
GTLM 誘起組合は、原始的な遺伝子発現シグネチャと限られた増殖能力と赤芽球系前駆細胞を生成します。さらに、組合は、非常に少数の除核赤血球を生成します。貧しい赤芽球前駆細胞の拡大、決定的な遺伝子発現と組合に直接再プログラム化するその他の要因についての追加と達成できる可能性がありますキット + 決定的な赤芽球系細胞をプログラムし直すための失敗によって説明されます。プログラム。
我々 のデータはまた、貧しい摘出効率は決定的な遺伝子発現プログラムではなく、プリミティブの前駆体 GTLM による投資事業組合を生成するという事実によって説明される提案します。改良された眼球摘出することがなく培養条件を最適化することでいくつかの試みを試みた。両方の前駆摘出と増殖効率を高める継続的な試みしたがって決定的な組合に再プログラム化を誘導するため不足している要因を識別するのに集中しています。
赤い iEP コロニーの最適生産のため細胞はすべての 4 つのベクトルを導入し、GTL 遺伝子を高レベルで発現に不可欠です。残念ながら現在最も効率的な方法では、ベクトル抗体の前の制御はできません。Bicistronic レンチ ウイルスのベクトルを使用して効率を向上させる試みが成功すると、下の化学量論または不十分な表現のレベルの問題に起因でした。仕事は初期化ベクトルを改善するために継続的なたての組み合わせを使用して最も効率的な方法のままはのみ 1 つの要因となし選択マーカー遺伝子を表現する前述の retroviral ベクトルとベクトル上清を生産しました。
GTLM リプログラミング投資事業組合には、コミットの体細胞からの赤芽球系前駆細胞を生成することが唯一報告されたプロトコルです。赤芽球細胞モデル系であるような赤芽球系細胞ライン HiDEPs/HuDEP 細胞研究ツール DLR iEP 法は他にいくつかの利点として (PMID: 23533656)17。HiDEPs/HuDEP 細胞は赤血球の大規模な生産およびターミナルの赤血球中に遺伝子の機能を評価するためのより便利なツール、GTLM の投資事業組合にリプログラミングのユニークな利点は直接コアの学習能力赤芽球系細胞の運命を決定する転写プログラム。GTLM リプログラミング プリミティブと決定的な赤血球間スイッチを勉強する人間、マウス、たとえばの両方の赤血球を勉強の貴重なプラットフォームを提供します。このスイッチを理解する研究者は、成人のスイッチを逆に病気を軽減するために胎児のヘモグロビンに努めて、鎌状赤血球貧血などの赤血球の溶血の潜在的な治療の大きな関心のです。
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Disclosures
著者はレポートに利害の対立があります。
Acknowledgments
レトロ ウイルス ライブラリを生成するために使用するプラスミドの多くを提供するクローニングとハーヴェイ Lodish (ホワイト ヘッド研究所)、イブ王とグレゴリー ・ ハイド (ホワイト ヘッド研究所、ケンブリッジ、MA) に感謝します。IEP 生産の説明での役割、Kavitha シヴァとソフィー Singbrant (分子医学、遺伝子治療、ルンド大学)、ヨーラン カールソンと Shamit Soneji (分子血液学の部門、ルンド大学) に感謝します。認め、ジュリアン ・ Pulecio (再生医療センター、バルセロナ医研究公園)、ビオレッタ レーヨン エストラーダ (ロックフェラー大学、ニューヨーク)、カール ・ スタッフ ・感謝も申し上げます (セント ・ ヴィンセント ・医学研究所とセントヴィンセントの病院、メルボルン大学の部門)、スペイン ・ ラヤ (研究や高度な研究、バルセロナのカタロニア語機関) とビジェイ G. Sankaran (ブロード研究所の技術とハーバード、ケンブリッジのマサチューセッツ大学) この作品へ以前の貢献。この作品は、(j. f.); にラグナル協会財団によって支えられました。スウェーデン研究評議会 (に j. f.)。Stiftelsen オルレ Engkvist Byggmästare (に j. f.)。スウェーデン (j. f.); に戦略的研究財団Åke ウヰーベルグ財団 (に j. f.)。(j. f.) に助成金統合マリー キュリー。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
