Summary
هنا نقدم لدينا بروتوكول لإنتاج فعل المباشر المتكفل محمر (المقدمة) من الماوس الليفية الكبار استخدام النسخ التي يحركها عامل النسب إعادة برمجة (DLR).
Abstract
الالتزام خلية محمر والتمايز المضي قدما من خلال تفعيل شبكة النسخي مقيدة بالنسب مدبرة من قبل مجموعة من مصير الخلية تحديد ونضج العوامل. ونحن المبينة سابقا لتحديد الحد الأدنى لعدد من العوامل اللازمة لإرشاد وتطوير خلايا الدم الحمراء باستخدام النسب المباشر إعادة برمجة الخلايا الليفية في محمر المستحث المتكفل/السلائف (المقدمة). لقد أظهرنا أن overexpression من Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة (جتلم) يمكن سرعة تحويل موريني والبشرية الليفية مباشرة إلى المقدمة التي تشبه الخلايا محمر حسن النية من حيث التشكل، النمط الظاهري، والتعبير الجيني. ونحن نعتزم أن المقدمة ستوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة اللائحة مصير تكون الكريات الحمر والخلية. هنا يصف لنا عملية تدريجية لتحويل ذيل موريني نصيحة الليفية في المقدمة عن طريق النسخ يحركها عامل مباشرة نسب إعادة برمجة (DLR). في هذا المثال، نقوم بإعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران محمر تتبع النسب التي تعبر عن البروتين نيون أصفر (يفب) تحت سيطرة المروج الجينات (ابور) مستقبلات ارثروبويتين، تمكين التصور خلية محمر مصير الحث على إعادة برمجة. وفي أعقاب هذا البروتوكول، يمكن أن تعاد برمجتها الليفية في المقدمة في غضون خمسة إلى ثمانية أيام.
بينما لا يزال يمكن إدخال تحسينات على العملية، ونحن تبين أن جتلم بوساطة إعادة برمجة عملية سريعة ومباشرة، مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على خصائص من حسن النية الخلايا السلف والسلائف محمر.
Introduction
خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ضرورية في جميع الفقاريات ويشكلون نسبة 84 في المائة من كافة الخلايا من الهيئات البشرية1. من الجنينية إلى حياة الكبار، صحتنا تعتمد اعتماداً كبيرا على التنظيم الدقيق للتوازن ربك. من المعروف استمرار الإنتاج لكرات الدم الحمراء الناضجة في جميع أنحاء التنمية في مرحلة البلوغ تكون الكريات الحمر. تحديا رئيسيا في تكون الكريات الحمر للبحث هو تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية التي تنسق التنمية ربك والتبديل بين البدائية ونهائية تكون الكريات الحمر. النسب المباشر إعادة برمجة المتكفل محمر فرصة لزيادة فهم التنمية محمر في فيفو.
النسب المباشر برمجة (DLR)، المعروفة أيضا باسم ترانسديفيرينتييشن، هو عملية إعادة برمجة واحدة من نوع الخلية مباشرة إلى آخر، تجاوز pluripotent ومراحل السلف مولتيبوتينت. وقد استخدمت حتى الآن DLR لإنتاج العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك العصبية2و المكونة للدم3،،من45، والكبد6 والكلوية7، خلايا السلف. لعلماء الأحياء التنموي، أصبح DLR أداة هامة لاستجواب جوانب الالتزام بالنسب والتمايز المحطة الطرفية عمليات8،9. يمكن تكمل DLR واستبدال جزئيا في فيفو دراسات لفهم آليات لمصير الخلية العوامل المحددة أثناء التطوير. وينص البروتوكول DLR لإعادة برمجة لموروث محمر المبينة في هذه الورقة الحقل طريقة مجانية للدراسات التنموية لتكون الكريات الحمر.
وقد أثبتنا سابقا أن overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، كافية لإعادة برمجة الليفية مورين والبشرية على السواء مباشرة إلى فروعه محمر المستحث (المقدمة) 10-الخلايا محمر "جتلم" برمجة يشابه إلى حد كبير حسن النية محمر البدائية موروث من حيث التعبير مورفولوجيا والنمط الظاهري والجيني10. وهكذا المقدمة قد حدت من قدرة الانتشار وناضجة للكريات الحمراء المنواه مماثلة لتلك التي تنتجها عابر في الجنين المبكر قبل بداية نهائي تكون الكريات الحمر. عن طريق إجراء تغييرات في شروط إعادة برمجة (مثل الطفرات في إعادة برمجة العوامل أو إضافة عوامل أخرى)، يمكننا أن نفهم كيف يؤدي ذلك إلى تغييرات في التنمية محمر والتمايز. ونحن على سبيل المثال أظهرت أن Klf1 أو Myb بالإضافة إلى كوكتيل جتلم تغيير نمط التعبير جلوبين من الدرجة الأولى الجنينية (البدائية) للكبار أساسا (نهائي). وهذا الاستنتاج يؤكد صلاحية استخدام DLR كأداة لتحديد العوامل التنموية في تكون الكريات الحمر.
هنا، فإننا مخطط عملية توليد المقدمة من ذيل الماوس نصيحة الليفية (الصناديق الاستئمانية). في نتائج تمثيلية، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران تتبع النسب محمر (ابور-لجنة المساواة العرقية R26-ايفب) الذي يعرب عن البروتين نيون أصفر (ايفب) من محور Rosa26 في جميع الخلايا التي أعرب عن مستقبلات ارثروبويتين، السماح للتصور من السهل الالتزام بنسب محمر. باستخدام هذا الأسلوب، يفب الإيجابية (+ ابور) خلايا موجودة لها في أقرب وقت بعد توصيل خمسة أيام. ويوفر هذا البروتوكول، ولذلك، تقنية سريعة وقوية لتوليد محمر فروعه في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنشاء وصيانة ذيل الماوس الأساسي تلميح الثقافات تنتجها الخلايا الليفية
- إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة (يوصي طبق 10 سم للذيل واحد) التي تغطي السطح مع الجيلاتين 0.1% وحضانة الأطباق لمدة 20 دقيقة تقريبا في 37 درجة مئوية. نضح الحل الجيلاتين من الطبق والسماح لها الجاف ح 2 على الأقل.
- Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم. قم بإزالة الذيل مع مقص، قص عند قاعدة الذيل. وضع الذيل في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) بنسبة 2% مصل بقرى الجنين (FBS) حتى جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ذيول ينبغي أن تؤخذ من الفئران حوالي 6 إلى 8 أسابيع من العمر. يمكن أن تؤخذ ذيول من الفئران أقدم من 8 أسابيع عمر، ومع ذلك، كسن الفئران، والقدرة على الانتشار الخلايا الليفية وكفاءة إعادة برمجة انخفاض11. - تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول في غطاء زراعة الأنسجة تحت ظروف معقمة. تعد حلاً التربسين مخفف 0.02% التربسين-يدتا في دببس وإضافة 5 مل في طبق غير مصقول 10 سم.
- أغسل الذيل، أولاً في الإيثانول 70%، ثم في دببس. في طبق، مكان الذيل مسطح واستخدام الملقط لأنه عقد في المكان. إجراء شق في الذيل على طول محورها الطولي من القاعدة إلى الحافة.
- فهم الذيل مع زوج واحد من الملقط وأنه عقد عمودياً. استخدام زوج ثاني من الملقط، قبضة الجلد بجوار الشق في القاعدة الذيل وقشر مرة أخرى. القيام بذلك في كلا الجانبين من الشق حتى يمكن خلع الجلد عن طريق سحب أسفل تجاه طرف الذيل.
- اضغط الذيل مقشرة مع الملقط على الطبق الذي يحتوي على الحل التربسين وقطع الذيل إلى حوالي 1 سم قطع طويلة. مع قطع ذيل في حل التربسين، استخدام مقص لتفتيت القطع إلى أجزاء أصغر. احتضان قطعة الذيل في حل التربسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يفضل أصغر القطع بغية توفير كل قطعة مساحة سطحية عالية لنسبة الحجم. - آرو التربسين استخدام وحدات التخزين 2 متوسطة التوسع (FEX) تنتجها الخلايا الليفية (عالية-الجلوكوز دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 15% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين والأحماض الأمينية الأساسية عدم (نيا) 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين).
- جمع محتويات الطبق في أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية وريسوسبيند أجزاء الذيل في 10 مل من جديد FEX المتوسطة.
- نقل أجزاء الذيل في المتوسط إلى طبق المغلفة بالجيلاتين واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 و 4% س2، إضافة جديدة FEX المتوسطة كل يومين.
ملاحظة: بعد خمسة إلى سبعة أيام، شظايا الذيل قد تعلق في الجزء السفلي من الطبق ويمكن رؤية الليفية تتحرك بعيداً عنها. - متى تم اكتشاف مجموعات من الخلايا الليفية، بلطف يهز الطبق إزاحة قطعة الذيل ونضح على المديين المتوسط وجميع أجزاء العظام ترك الليفية تعلق على اللوحة. إضافة جديد FEX المتوسطة والثقافة الليفية حتى روافد.
- لضمان لا تلوث الليفية بفروعه المكونة للدم، فصل الخلايا من لوحة باستخدام 1 x التربسين-يدتا لمدة 5 دقائق وجمع الخلايا. المستنفدة للخلايا معربا عن علامات المكونة للدم (CD117، CD5، CD45R (B220)، CD11b، ومكافحة-غرام-1 (Ly-ز 6/ج)، 7-4، ومكررا ثانيا-119) باستخدام نظام فصل مغناطيسي10.
2-لفي الإنتاج
- بذور الخلايا التغليف للفيروس في حوالي 2.5 × 104 خلايا/سم2 (2.0 × 106 خلايا لطبق 10 سم) طبق تعامل زراعة الأنسجة (بفراغ-الغاز البلازما) والثقافة بين عشية وضحاها في دميم عالية-الجلوكوز مع 10% FBS، 10 مم الصوديوم بيروفات، و 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين CO 37 درجة مئوية و 5%2.
- في صباح اليوم التالي، تغيير المتوسطة دميم مع أي إضافات استخدام نصف حجم استخدامها للثقافة بين عشية وضحاها (5 مل لطبق 10 سم). في فترة ما بعد الظهر، تحقق من أن الخلايا هي روافد 70-80% وتبدأ في تعداء.
- لكل عامل من عوامل إعادة برمجة، Gata1، Tal1، Lmo2، و حركة ج، وإعداد خليط 2:1 ناقل التعبير (بمكس) وناقلات مساعد (التي تحتوي على جينات هفوة وبول). لطبق 10 سم الخلايا الليفية، استخدام 6 ميكروغرام من ناقلات التعبير و 3 ميكروغرام لناقل مساعد في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر في المتوسط دميم.
- لكل عامل من عوامل إعادة برمجة، إعداد 300 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة (RT) دميم في أنبوب البوليستيرين عقيمة وإضافة 27 ميليلتر من كاشف تعداء التجارية بعناية.
ملاحظة: ينبغي أن تعرض RT قبل استخدام الكاشف تعداء ويجب إضافة مباشرة في المتوسط كما يمكن أن تجعل خصائص الالكتروستاتيكي المجمع من التمسك بجدار الأنبوبة البلاستيكية. - إضافة مزيج بلازميد في أنبوب يحتوي على كاشف تعداء، دوامة بإيجاز واحتضان خليط كاشف-الحمض النووي تعداء لمدة 15 دقيقة في "الرايت بإيجاز" دوامة الخليط وإضافة دروبويسي إلى الخلايا التغليف للفيروس حيث تعداء مزيج الحمض النووي كاشف تنتشر بشكل متساو على الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- 24 ساعة بعد تعداء، تغيير المتوسطة دميم مع 20% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100/ستربتوميسين. ح 48 بعد تعداء، جمع المادة طافية وتصفيته من خلال عامل تصفية حقنه حجم المسام 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن المجمدة إلى-80 درجة مئوية سوبيرناتانتس الفيروسية وأبقى حتى المطلوبة، على الرغم من أن نقل أكثر كفاءة إذا تم استخدام المادة طافية الفيروسية الطازجة.
3-جتلم توصيل والحصاد iEP
- أطباق في المتوسط FEX البذور الذيل تلميح الليفية في 1 × 104 خلايا/سم2 على 0.1% الجيلاتين المغلفة مسبقاً واحتضانها في 37 درجة مئوية ح 24.
- وفي اليوم التالي إعداد خليط توصيل كما يلي.
- إضافة المجلد 1 من المادة طافية الفيروسية لكل عامل من عوامل إعادة برمجة وتستكمل مع 4 ميكروغرام/مل من كاشف (40 ٪) من الإصابة بالفيروس إلى 6 مجلدات من FEX المتوسطة (60%).
- بالنسبة لطبق 10 سم الخلايا الليفية، إضافة 1 مل من كل المادة طافية الفيروسية (4 × الفيروسات = 4 مل) تستكمل مع 4 ميكروغرام/مل من كاشف عدوى الفيروس إلى 6 مل من FEX المتوسطة، أي ما مجموعة 10 مل توصيل خليط.
- نضح FEX المتوسطة من ثقافة تنتجها الخلايا الليفية واستبداله بخليط توصيل. احتضان توصيل ح 4 في 37 درجة مئوية في ظروف التاكسج (5% CO2 و 4% س2).
- نضح الخليط توصيل واستبداله بالمتوسطة إعادة برمجة جديدة (توسيع خالية من المصل المتوسطة (سفيم)، 100 يو/ملبينيسيلين/ستربتوميسين، 100 نانوغرام/مليلتر مورين "الخلايا الجذعية عامل" (سوف)، 10 نانوغرام/مل مورين انترلوكين-3 (IL3)، 2 يو/مليلتر الإنسان المؤتلف الاريثروبويتين (هريبو)، و 100 نانومتر الديكساميتازون).
- احتضانها ديسات 8 37 درجة مئوية في ظروف التاكسج، مضيفاً المتوسطة إعادة برمجة جديدة كل يومين. بعد خمسة إلى ثمانية أيام، سوف تسفر إعادة برمجة ناجحة عن مجموعات من الخلايا التي قد فصل من اللوحة.
- جمع الخلايا أعيدت برمجتها للتحليل، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حصادها مباشرة من الطبق. حصاد أونترانسدوسيد الليفية للمقارنة، فصل الخلايا من لوحة باستخدام 1 x التربسين-يدتا وجمع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهنا يقدم بروتوكول استنساخه لإنتاج المقدمة من الكبار الليفية استخدام النسخ DLR يحركها عامل. نقوم بتقييم الخلية إعادة برمجة استخدام التدفق الخلوي وتشكيل مستعمرة فحوصات والجينات تحليل التعبير. وللمساعدة في تصور التحويل إلى مصير الخلية محمر، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران تتبع النسب محمر (ابور-لجنة المساواة العرقية R26-ايفب) الذي يعرب عن البروتين نيون أصفر (ايفب) من موضع Rosa26 في كافة الخلايا التي يتم التعبير عن مستقبلات الاريثروبويتين (ابور، لجنة المساواة العرقية التي طرقت في اليل واحد من محور ابور المحلية) المحاضر في أي مرحلة من تلك التنمية12،13 ( الشكل 1A). بعد إعادة برمجة الناجحة التي يسببها المتكفل محمر، يفب الإيجابية (+ ابور) الخلايا يمكن ملاحظتها لها في أقرب وقت بعد توصيل خمسة أيام. ليوم 5 من إعادة برمجة الخلايا تصبح جولة ورفع من سطح اللوحة وتبدأ تشكيل مجموعات. عرض يوم 5-المتعلق مورفولوجيا شبيهة بسلائف محمر، التي تتميز بنواة مركزية مميزة، الكروماتين الخشنة، والسيتوبلازم الأزرق بعد أيار/مايو--Grünwald-Giemsa تلطيخ (الشكل 1ج). هيموجلوبينيزاتيون من بعض الخلايا الواضح تلطيخ البنزيدين الإيجابية ومظهر أحمر ملطفة عند القريبون (الشكل 1-E). وبالإضافة إلى ذلك، جزء صغير من يوم 5-المقدمة يفب إكسبرس المشارك والعلامة الخاصة محمر السطحية Ter119 (الشكل 1و). يوم 8، يمكن رؤية مجموعات يفب + كبيرة. يقدم 8iEPs اليوم النمط الظاهري محمر أكثر تمايزاً من يوم 5 المقدمة؛ وهم أصغر بكثير، وتراكمت الهيموغلوبين أكثر، وأيضا إظهار كثيرا التعبير upregulated من Ter119 (الشكل 1B–ز 1). يدور الخلوي ليوم 8-المقدمة تكشف عن مورفولوجيا محمر مثل، بينما لوحظت reticulocytes enucleated قليلة جداً (الشكل 1ح).
ويبين تحليل التعبير الجيني بالكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) من المقدمة السائبة التي تم جمعها في يوم 8 أنهم تقريبا إيقاف التشغيل في التعبير عن الجينات تنتجها الخلايا الليفية وقد أوبريجولاتيد العديد من الجينات محمر بما في ذلك الجينات جلوبين، يغلب وإذ تعرب عن أنواع الجنينية (الشكل 1أنا). تقييم ما إذا كانت الخلايا أعيدت برمجتها الانتقال من خلال فروعه multipotent، نحن إجراء دورة وقت وتحليل التعبير عن علامات المكونة للدم في جميع أنحاء إعادة برمجة. ونحن سابقا أفادت أن إنتاج السلائف محمر أعلى في يوم 6، تليها يوم 8، مع 10.5% ± 4.6% و 6.6% ± 0.5% من يعيش يفب + الخلايا المشترك معربا عن CD71 و Ter119، على التوالي10. وهناك أيضا عدد خلايا CD41 الإيجابية قبل ظهور الخلايا إيجابية Ter119. ج-كيت وعلامات CD45، التي عادة ما يتم التعبير عن السلف المكونة للدم ودوونريجولاتيد في تكون الكريات الحمر، لا يعبر عن في أي نقطة في إعادة برمجة (الشكل 1ي). تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا لا تذهب من خلال السلف المكونة للدم مولتيبوتينت أو المرحلة السابقة، على الرغم من القيام ربما الانتقال عن طريق السلف محمر ميجاكاريوسيتي.
طريقة يمكن الاعتماد عليها تقييم الكفاءة لإعادة برمجة لإجراء فحوصات تشكيل مستعمرة أولما ه على الخلايا أعيدت برمجتها. وكان جزيئي في المختبر قدرة التمايز يوم 5--ويوم 8-المقدمة في methylcellulose تكملة مع ارثروبويتين البشرية ومعامل الخلايا الجذعية مورين الديكساميتازون. بعد 8 أيام، شكلت المقدمة نوعين من المستعمرات: أحمر واضح (iEP أحمر) وعدم وضوح الأحمر (غير الأحمر iEP). بينما عرض الخلايا من المستعمرات الأحمر مورفولوجيا اريثروبلاست، لا تشبه الخلايا محمر، الخلايا من المستعمرات غير الأحمر وكانت غير النظامية، كان السيتوبلازم الأزرق العميق والحبيبية الكبيرة (الشكل 2أ).
يوم 5-المقدمة، تشكل حوالي 1 في 1,000 المستعمرات الحمراء، بينما المضيفين فقط تقريبا يوم 8 المقدمة تشكيل المستعمرات الحمراء، مع نسبة أعلى بكثير من المستعمرات غير الأحمر وشكلت (الشكل 2ب). وهذا الانخفاض في تشكيل مستعمرة القدرة بين يوم 5 ويوم 8-المقدمة يمكن أن تكون أوضح بييبس تمر بالتمايز من 5-8 أيام وناقلات التعبير جتلم المعاناة إسكات على مر الزمن. وأكد تحليل qPCR أن التعبير عن نسخة خارجية يقلل إلى حد كبير من 5 إلى 8 أيام. كما هو متوقع في إعادة برمجة ناجحة، فعل مستويات التعبير الذاتية Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة ، بيد الذاتية Lmo2 التعبير هو فقط المتواضع جداً أعرب (الشكل 2ج).
نقطة ملاحظة، وحد من التحليل، أن المستعمرات غير الأحمر التي تحتوي على خلايا مثل بلعم يفوق عدد المستعمرات iEP هيموجلوبينيزيد الحمراء التي شكلتها الليفية أعيدت برمجتها في تشكيل مستعمرة فحوصات. يمكن تحسين القدرة على تشكيل مستعمرة لإنشاء مستعمرات iEP أحمر بتغيير نسب المقايسة من العوامل جتلم. ترانسدوسينج الخلايا مع كمية مضاعفة من ناقلات التعبير Tal1 و Lmo2 أدى إلى زيادة طفيفة في نسبة المستعمرات الأحمر أكثر المستعمرات غير الأحمر، بينما إضافي Gata1 أدى إلى زيادة كبيرة في تكوين مستعمرات أحمر ونحو القضاء تام على المستعمرات غير الأحمر دعم الدور الهام لهذه العوامل في تكون الكريات الحمر (الشكل 2د). من المثير للاهتمام، زيادة التعبير عن ج-حركة شديدا يزيد إنتاج المستعمرات غير الأحمر على الرغم من كونه لا غنى عنه لإعادة برمجة. للحصول على موروث محمر المستحث نقية لتحليل المتلقين للمعلومات، يمكن أن تكون المستعمرات المعزولة من فحوصات تشكيل مستعمرة. أجرينا تحليل التعبير الجيني في شكل ميكرواري على الأحمر والمستعمرات غير الأحمر من يوم 5-المقدمة والمستعمرات من 14.5 يوما بعد الجماع (dpc) الجنين الكبد (فلوريدا) والبالغين نخاع العظم (بي أم) للمقارنة. البيانات ميكرواري يمكن الوصول إليها من خلال التعبير الجيني نكبي في الجامع (جورجيا): GSE73344. وقد أظهرنا سابقا أن المستعمرات iEP الأحمر يشابه المستعمرات محمر حسن النية (فلوريدا وبي أم) ب التعبير الجيني10. دراسة للتعبير عن Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة في كل مستعمرة يبين أن بينما المستعمرات الحمراء تظهر مستويات مماثلة من التعبير عن جميع العوامل الأربعة إلى فلوريدا وبي أم، المستعمرات غير الأحمر التعبير أقل من جميع العوامل، لا سيما Gata1 (الشكل 2ه). لفهم ما هي المستعمرات غير الأحمر التي تحتوي على خلايا مثل بلعم، نحن الذين شملهم الاستطلاع الجينات الخاصة بنوع الخلية في كل نوع من مستعمرة من البيانات ميكرواري. وكما ذكر سابقا، أعرب المستعمرات الأحمر العديد من الجينات الخاصة محمر، شبيه بفلوريدا وبي أم. وبعد إعادة النظر في البيانات، فمن الواضح أن المستعمرات غير الأحمر إظهار التعبير عالية من عدد من الجينات المميزة ل الخلايا بلعم14 (الشكل 2و). المستعمرات الأحمر لا غير الأحمر إظهار التعبير زيادة كبيرة من الجينات megakaryocyte نموذجي15. معا، هذه البيانات تشير إلى أن المستعمرات غير الأحمر أكثر شبهاً الضامة من الكريات الحمراء. حيث لوحظت المستعمرات غير الأحمر ابدأ عندما تتم إزالة أحد العوامل جتلم هذه الخلايا مثل بلعم يبدو أنها ستشكل عند أقل من مستويات التعبير من واحد أو أكثر من عوامل إعادة برمجة Gata1، Tal1، Lmo2 اللازمة لإعادة برمجة إلى المقدمة. معا، وهذا يوحي بأن مستويات التعبير من كل أربعة عوامل جتلم هامة في الصناديق الاستئمانية المواضيعية لإعادة برمجة iEP وأن يفسر عدم التجانس بإعادة برمجة غير كاملة من الخلايا الفردية، التي يحتمل أن يمكن تصحيحها عن طريق ضبط نسب المقايسة.
لتقييم كفاءة ومتانة لدينا بروتوكول، نحن اختبار القدرة على إعداد مجموعة من الخلايا الليفية لإنتاج مجموعات مرئية من الخلايا iEP بعد 5 أيام عند مثقف في لوحات 384-جيدا. عقدنا العزم أن عدد الآبار مع الكتلة iEP واحد على الأقل من أصل 24 ترانسدوكشنز من 20، 30 و 40 و 50 الصناديق الاستئمانية المواضيعية، كان 3 (0.6 في المائة من الألواح الليفية) و 15 (2.0 في المائة من الألواح الليفية)، 15 (1.6 في المائة من الألواح الليفية)، و 13 (1.1 في المائة من الألواح الليفية) ، على التوالي. وهذا يوحي أن جلتم iEP إعادة برمجة عملية قوية وموثوق بها ويمكن الوصول إلى اءة 1%.
تشمل العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤثر على كفاءة إعادة برمجة مرور عدد الخلايا الليفية وشروط الثقافة. نحن مقارنة كفاءة إعادة برمجة الصناديق التي قد تم باساجيد ثلاث مرات أو تسع مرات قبل توصيل. الصناديق الاستئمانية المواضيعية التي قد تم باساجيد تسع مرات (P9) وأظهرت انخفاض كبير في القدرة على إنتاج مجموعات من المقدمة (الشكل 3أ). من المثير للاهتمام، إدراج المصل في وسائل الإعلام إعادة برمجة تماما كتل إعادة برمجة، يحل محل المصل مع السيتوكينات محمر ضروري للسماح للعوامل ترانسدوسيد لقيادة مصير الخلية الجديدة دون إشارات المركبة من المصل. إزالة المصل، والتعبير عن عوامل جديدة داخل الخلية من المرجح أن تكون مرهقة في الخلايا. والواقع أن حظر تنشيط p53 إلى حد كبير زيادة عدد المقدمة التي تم إنشاؤها. كما يتضح هذا التأثير في إعادة برمجة p53 خروج المغلوب الليفية (الشكل 3ب-د). تثبيط p53 إشارات الخلية البقاء على قيد الحياة وإعادة برمجة أفضل يؤدي إلى المزيد وهو أحد الأساليب المصادق عليها لتحسين الغلة. وأخيراً، إعادة برمجة في ظروف التاكسج مواتية لكن ليس حيويا لإنتاج iEP. ومع ذلك، مثقف في نورموكسيا ترانسدوسيد الصناديق أبطأ بكثير لإعادة برمجة ومجموعات iEP بعد 10 أيام بدلاً من خمسة إلى ثمانية أيام (الشكل 3ه).
الشكل 1 : ريبروجرامس التعبير القسري Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة موريني الليفية الكبار في فروعه محمر الذي يحمل خصائص الخلايا محمر حسن النية . (A) التصميم التجريبي للنسخ بوساطة معامل إعادة برمجة مراسل محمر (ابور-Cre R26-ايفب) ذيل نصيحة الليفية (الصناديق الاستئمانية) لابور + إعادة برمجة الخلايا. (ب–و) وقت دورة iEP جيل من الصناديق أونترانسدوسيد (يوم 0) ومعظم الصناديق ترانسدوسيد جتلم في أيام 5 و 8 (ممثل من n = 2-3). وجرى تقييم ترانسديفيرينتييشن بالصور (ب) خلية يعيش، مشرق حقل آبار مفردة (مقياس بار، 50 ميكرومتر)؛ (ج) أيار/مايو--Grünwald-Giemsa تلطيخ الخلوي-سبين (مقياس بار، 20 ميكرومتر)؛ (د) بنزيدين/جيمسا تلطيخ الخلوي-سبين (مقياس بار، 20 ميكرومتر)؛ (ه) التفتيش العيانية الكريات الخلية؛ ويرسم الخلوي تدفق الممثل (و) عرض يفب/التعبير Ter119. (ز) قياس قطر الخلية من المقدمة التي تحصد في أيام 5 و 8 من عدة شرائح الخلوي-سبين، تبين حدوث انخفاض في حجم الخلية في يوم 8. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 21-25)؛ p ≤ 0.0001 من مزاوج تي-اختبار. (ح) الصور البنزيدين الاستبانة الممثل/جيمسى ترانسدوسيد جتلم الصناديق في يوم 8. مقياس بار، 5 ميكرومتر. (ط) التعبير مرناً النسبي من جينات محددة تنتجها الخلايا الليفية ومحمر ذات الصلة بما في ذلك الجينات جلوبين في أونترانسدوسيد الصناديق الاستئمانية المواضيعية (أعمدة رمادية) مقابل معظم الصناديق ترانسدوسيد جتلم (الأعمدة الحمراء) في يوم 8، يحددها qPCR. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 4-6 للمقدمة، n = 2 للصناديق أونترانسدوسيد). الرسم البياني (ي) عرض موجز لتحليل تدفق الوقت بالطبع الخلوي أونترانسدوسيد الصناديق الاستئمانية المواضيعية (يوم 0) ومعظم الصناديق الاستئمانية تحصد في اليوم 2، 4، 6، 8 عرض التعبير يفب، CD45، CD71، و Ter119 ترانسدوسيد جتلم (n = 3). يتم عرض البيانات كما يعني ± التنمية المستدامة. الرقم مقتبس من S غارسيا كابيليرا، وآخرون. 10- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : المتعلق جتلم إنتاج المستعمرات الحمراء وغير الحمراء في فحوصات مستعمرة أولما-ه. (أ) سيتوسبين مشرق الميدان وأيار/مايو--Grünwald-جيمسا الممثل الصور المستمدة من iEP الأحمر وغير الأحمر المستعمرات. تغيير حجم أشرطة، 50 ميكرومتر (مستعمرة الصور) و 10 ميكرومتر (صور الخلوي-سبين). (ب) تهم مستعمرة المتولدة من الصناديق أونترانسدوسيد مطلي، يوم 5 المتعلق بالجملة، والجزء الأكبر يوم 8. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 3)؛ p ≤ 0.0005؛ p ≤ 0.0001 من ANOVA ثنائي الاتجاه. (ج) التعبير مرناً نسبيا من Gata1، Tal1، Lmo2، و حركة ج في أونترانسدوسيد الصناديق والجزء الأكبر الصناديق ترانسدوسيد جتلم تحصد في يوم 5 ويوم 8، يحددها qPCR. وقد صممت كبسولة تفجير حتى أنه يمكن تمييز التعبير الذاتية من مجموع التعبير. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 4-6 للمقدمة، n = 2 للصناديق أونترانسدوسيد). (د) التهم مستعمرة المتولدة من مطلي أونترانسدوسيد الصناديق الاستئمانية المواضيعية، واليوم معظم ولدت 5 المتعلق بمضاعفة نسبة كل عامل من العوامل جتلم. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 3)؛ * * p ≤ 0.001؛ p ≤ 0.0001 من ANOVA ثنائي الاتجاه. (ﻫ) التعبير النسبي من Gata1، Tal1، Lmo2، و حركة ج في الخلايا الليفية أونترانسدوسيد والمستعمرات المنتقاة المتولدة من المقدمة ترانسدوسيد جتلم (الحمراء وغير الحمراء)، 14.5 dpc كبد الجنين والعظام الكبار نخاع، يحددها ميكرواري. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة؛ * p ≤ 0.05؛ * * p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005؛ p ≤ 0.0001 من ANOVA ثنائي الاتجاه. (و) التعبير النسبي للجينات المحددة المعروفة للتعبير عنها في ميجاكاريوسيتي (وسط)، محمر (أعلى) وبلعم الخلايا (أسفل) في الخلايا الليفية أونترانسدوسيد واختار المستعمرات التي تم إنشاؤها من المقدمة ترانسدوسيد جتلم (الحمراء وغير الحمراء)، 14.5dpc الجنينية الكبد ونخاع العظام الكبار، يحددها ميكرواري. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة؛ * p ≤ 0.05؛ * * p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005؛ p ≤ 0.0001 من ANOVA ثنائي الاتجاه. الشكل مقتبس من S كابيليرا جارسيا, et al. 10- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إعادة برمجة جتلم عملية قوية وموثوق بها. (أ) لاحظ الرسم البياني عدد من مجموعات من الصناديق 10,000 وصور الممثل في يوم 5 من جتلم إعادة برمجة ذيل نصيحة الليفية (الصناديق الاستئمانية) التي خضعت للممرات الثلاثة (ف-3) أو تسع فقرات (P9) قبل إعادة برمجة. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 6)؛ هي أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. (ب–د) مجموعات الصور التمثيلية ل iEP 6 أيام بعد جتلم (ب) إعادة برمجة ذيل نصيحة الليفية؛ (ج) جتلم إعادة برمجة الصناديق مع إضافة ناقلات التعبير p53DN؛ (د) إعادة برمجة جتلم p53 خروج المغلوب الصناديق الاستئمانية المواضيعية (مقياس أشرطة = 50 ميكرومتر). (ه) صور الممثل iEP الكتل بعد 10 أيام من إعادة برمجة جتلم تجري في ظروف نورموكسيك (مقياس بار = 50 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، غير كافية لإعادة برمجة الخلايا الليفية مورين والبشرية مباشرة إلى المقدمة10. الخلايا محمر أعيدت برمجتها تشبه إلى حد كبير حسن النية محمر موروث من حيث مورفولوجيا والنمط الظاهري، والتعبير الجيني، والقدرة على تشكيل مستعمرة. ويؤكد هذا الاستنتاج أن الأساس المنطقي لاستخدام إعادة برمجة المباشر كأداة لتحديد العوامل التنموية في هيماتوبويسيس. لدعم صحة هذه الطريقة، المقدمة كما يمكن إنشاء باستخدام تعريفية جتلم الليفية الجنينية الماوس والليفية القلفة البشرية، تبين أنه يعمل للخلايا الليفية من أصول مختلفة وعبر الأنواع10. ونحن في هذا التقرير، الحث على إعادة برمجة الخلايا الليفية من الماوس تعقب النسب محمر كأداة لتصور عملية التحويل إلى خلية محمر. يتم استخدام هذا الماوس مفيدة ولكنها ليست حاسمة للبروتوكول. ونحن بشكل روتيني إجراء إعادة برمجة باستخدام أنواع متعددة من تنتجها الخلايا الليفية من سلالات مختلفة من الماوس وتحديد المتعلق بالتعبير علامة سطح الخلية Ter119 و CD71.
أسلوبنا الحالي يولد المقدمة أن المعرض النمط الظاهري محمر بدائية مقارنة النمط الظاهري نهائي الكبار. واحد والفرق الرئيسي بين هذه المراحل من التنمية هو التعبير عن الجينات جلوبين مختلفة. ومع ذلك، أننا أظهرنا تلك الإضافة Klf1 و Myb لنمط التعبير جلوبين المقدمة التغييرات كوكتيل جتلم من الدرجة الأولى الجنينية للكبار أساسا10،14. من المثير للاهتمام، Gata2 و Runx1 بالإضافة إلى أربعة-عامل كوكتيل وثرومبوبويتين على المديين المتوسط والتحيز في عملية إعادة برمجة نحو النسب ميجاكاريوسيتيك16.
المقدمة التي يسببها جتلم إنتاج المتكفل محمر مع توقيع تعبير الجيني بدائية وقدرة التكاثري محدودة. وعلاوة على ذلك، المتعلق إنتاج الكريات الحمراء انوكليتيد قليلة جداً. توسيع السلف محمر الفقيرة مفسرة بالفشل في إعادة برمجة لمجموعة + الخلايا محمر نهائي، الذي يمكن أن يحتمل أن يتحقق مع إضافة عوامل أخرى يحفز إعادة برمجة مباشرة إلى المقدمة باستخدام تعبير جينات نهائي البرنامج.
البيانات المتوفرة لدينا تشير أيضا إلى كفاءة enucleation الفقيرة هو يفسره المتعلق جتلم الناجمة عن توليد السلائف مع بدائية، بدلاً من برنامج تعبير الجيني نهائي. جرت عدة محاولات لتحسين ظروف الثقافة دون تحسين انوكلييشن. ولذلك تركز المحاولات الجارية لزيادة كفاءة انتشار و enucleation السلف على حد سواء في تحديد العوامل المفقودة لحفز إعادة برمجة للمقدمة نهائية.
لإنتاج أمثل من المستعمرات iEP أحمر، من الحيوي أن الخلايا هي ترانسدوسيد مع كل أربع ناقلات، ويتم التعبير عن الجينات سوائل عند مستويات مرتفعة. للأسف الطريقة الأكثر فعالية حاليا لا يسمح بالرقابة المسبقة من التتر متجه. محاولة لتحسين كفاءة استخدام ناقلات لينتيفيرال بيسيسترونيك لم تكن ناجحة، ربما بسبب قضايا مع ستويتشيوميتري أقل شأنا أو مستويات التعبير غير كافية. بينما يجري العمل لتحسين إعادة برمجة ناقلات، أنتجت بقايا الأسلوب الأكثر كفاءة استخدام تركيبات من طازجة المادة طافية ناقلات ناقلات النسخ العكسي هو موضح سابقا معربا عن عامل واحد فقط وليس الجينات علامة التحديد.
إعادة برمجة جتلم للمقدمة هو بروتوكول تم الإبلاغ عنها فقط قادرة على إنتاج محمر السلف مثل الخلايا من خلية جسدية ملتزمة. كما أسلوب iEP أداة DLR بحوث ولذلك مزايا عديدة على سائر محمر خلية نظم نموذجية مثل الخلية محمر خطوط الخلايا هيديبس/هديب (PMID: 23533656)17. بينما الخلايا هيديبس/هوديب أدوات أكثر ملاءمة لإنتاج كرات الدم الحمراء كبيرة الحجم، وتقييم وظيفة الجينات خلال المحطة الطرفية تكون الكريات الحمر، ميزة فريدة من نوعها لإعادة برمجة جتلم للمقدمة هو القدرة على دراسة مباشرة للب النسخي البرامج تحديد مصير الخلية محمر. إعادة برمجة جتلم يوفر منبرا لا تقدر بثمن لدراسة كلا تكون الكريات الحمر في البشر، والماوس، وعلى سبيل المثال، لدراسة التبديل بين البدائية ونهائية تكون الكريات الحمر. فهم رمز التبديل هذا من مصلحة كبيرة في علاج محتمل هيموجلوبينوباثيس، مثل الأنيميا المنجلية، التي يسعى الباحثين لعكس اتجاه التحول في البالغين إلى الهيموغلوبين الجنيني للتخفيف من حدة المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في التقرير.
Acknowledgments
ونشكر وانغ إيفلين وهايد غريغوري (معهد وايتهيد، كامبريدج، ماجستير) للاستنساخ وهارفي لوديش (معهد وايتهيد) لتوفير العديد من البلازميدات المستخدمة لإنشاء مكتبة للفيروسات الرجعية. ونحن نشكر مجاهد سيفا وصوفي سينجبرانت (قسم الطب الجزيئي والعلاج الجيني، وجامعة لوند) وكارلسون غوران سونيجي شامية (قسم أمراض الدم الجزيئية، جامعة لوند) لأدوارها في وصف لإنتاج iEP. ونود أيضا تقر وأن تشكر بوليسيو جوليان (مركز الطب التجديدي، ومجمع البحوث الطبية الحيوية برشلونة)، فيوليتا رايون-استرادا (روكفلر جامعة نيويورك)، وكارل والكليي (معهد "البحوث الطبية في" سانت فنسنت و قسم للطب، مستشفى سانت فنسنت، جامعة ملبورن)، أنخل الراية (المؤسسة الكتلانية للبحوث والدراسات المتقدمة، برشلونة)، وفيجاي غ. سانكاران (معهد واسع من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد، كمبردج ) لمساهماتها السابقة في هذا العمل. هذا العمل كان يدعمها راغنار سودربيرغ المؤسسة (J.F.)؛ البحوث السويدية مجلس (J.F.)؛ هيروكي ستيفتيلسين انجكفيست Byggmästare (إلى J.F.)؛ المؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية (ل J.F.)؛ المؤسسة أك ويبيرج (J.F.)؛ ماري كوري تكامل منحة (J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
