Summary
Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).
Abstract
Erythroid cel inzet en differentiatie doorlopen activering van een bloedlijn-beperkte transcriptionele netwerk georkestreerd door een groep van het lot van de cel bepalen en factoren rijpen. We eerder uiteengezet te definiëren de minimale benodigde factoren voor het instrueren van de rode bloedcellen ontwikkelen met behulp van directe bloedlijn herprogrammering van fibroblasten in geïnduceerde erythroid progenitoren/precursoren (iEPs). We toonden dat overexpressie van Gata1, Tal1, Lmo2en c-Myc (GTLM) kunnen snel converteren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks aan iEPs die lijken op de bona fide erythroid cellen in termen van morfologie, fenotype, en genexpressie. Wij zijn van plan dat iEPs een instrument van onschatbare waarde om te studeren Erytropoëse en cel lot verordening zal bieden. Hier beschrijven we de stapsgewijze proces van het omzetten van lymfkliertest staart tip fibroblasten in iEPs via transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR). In dit voorbeeld voeren wij de herprogrammering in fibroblasten van erythroid afkomst-tracing muizen die uitdrukking geven aan de gele fluorescerende proteïne (YFP) onder de controle van de Erytropoëtine receptor gen (EpoR) promotor, visualisatie van erythroid cel inschakelen lot inductie op herprogrammering. Naar aanleiding van dit protocol, fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in iEPs binnen vijf tot acht dagen.
Terwijl verbeteringen kunnen nog steeds worden gemaakt aan het proces, laten we zien dat GTLM-gemedieerde herprogrammering is een snelle en directe proces, opbrengst van cellen met eigenschappen van bona fide erythroid voorlopercellen en voorloper cellen.
Introduction
Rode bloedcellen (RBC) zijn essentieel in alle gewervelden en make-up 84% van alle cellen van het menselijk lichaam1. Van embryonale tot volwassen leven is onze gezondheid sterk afhankelijk van de exacte regeling van RBC homeostase. De voortdurende productie van rijpe RBC in de gehele ontwikkeling naar volwassenheid staat bekend als de Erytropoëse. Een belangrijke uitdaging in de Erytropoëse onderzoek is vast te stellen van de master toezichthouders dat ontwikkeling van de RBC en de switch tussen primitieve en definitieve Erytropoëse orkestreren. Directe bloedlijn herprogrammering van erythroid voorlopercellen biedt een kans om verder te begrijpen erythroid ontwikkeling in vivo.
Directe bloedlijn herprogrammering (DLR), ook bekend als transdifferentiatie, is het proces van herprogrammering één celtype rechtstreeks naar de andere, het omzeilen van pluripotente en multipotente voorlopercellen stadia. DLR heeft tot nu toe is gebruikt voor de productie van vele celtypes, met inbegrip van neurale2, hematopoietische3,4,5, hepatische6 en nefrotisch7, voorlopercellen. Voor ontwikkelingsstoornissen biologen, DLR uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor Larive aspecten van lineage inzet en terminal differentiatie processen8,9. DLR kan aanvullen en gedeeltelijk vervangen in vivo studies voor het begrijpen van mechanismen van het lot van de cel bepalende factoren tijdens de ontwikkeling. De DLR-protocol voor de herprogrammering te erythroid progenitoren beschreven in dit document levert het veld een gratis methode voor bestudering van de ontwikkelings van de Erytropoëse.
Wij hebben eerder aangetoond dat overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), voldoende om te herprogrammeren van zowel menselijke als lymfkliertest fibroblasten rechtstreeks naar geïnduceerde erythroid voorlopercellen (iEPs) 10. the GTLM-geherprogrammeerd erythroid cellen lijken sterk op bona fide primitieve erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype en gen expressie10. Dus iEPs hebben beperkte capaciteit van de proliferatie en vervallen en genucleëerde vergelijkbaar zijn met die Transient geproduceerd in het vroege embryo vóór aanvang van de definitieve Erytropoëse erythrocyten. Door wijzigingen in de herprogrammering voorwaarden (bijvoorbeeld puntmutaties in herprogrammering factoren of toevoeging van andere factoren), kan men begrijpen hoe dit leidt tot veranderingen in de erythroid ontwikkeling en differentiatie. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat toevoeging van Klf1 of Myb aan de cocktail GTLM het globine-expressiepatroon van overwegend embryonale (primitieve verandert) vooral volwassen (definitieve). Deze bevinding bevestigt de geldigheid van het gebruik van DLR als een instrument voor het definiëren van ontwikkelingsstoornissen factoren in de Erytropoëse.
We schetsen hier, het proces van het genereren van iEPs van muis staart tip fibroblasten (TTF). In onze representatieve resultaten, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor- Cre R26- eYFP) die express de gele fluorescerende proteïne (eYFP) van de Rosa26 locus in alle cellen die geuit de Erytropoëtine-receptor, waardoor eenvoudige visualisatie van betrokkenheid bij de erythroid afkomst. Met behulp van deze methode, zijn positieve YFP (EpoR +) cellen aanwezig zo spoedig vijf dagen na transductie. Dit protocol, daarom biedt een snelle en robuuste techniek voor de generatie van erythroid voorlopercellen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oprichting en onderhoud van primaire muis staart Tip Fibroblast culturen
- Bereid gelatine beklede gerechten (adviseren een 10 cm schotel voor één staart) door die betrekking hebben op het oppervlak met 0,1% gelatine en het broeden van de gerechten gedurende ongeveer 20 minuten bij 37 ° C. Gecombineerd de oplossing van de gelatine van de schotel en laat ze drogen voor ten minste 2 uur.
- De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren. Verwijder de staart met een schaar, snijden aan de voet van de staart. Zet de staart in de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 2% foetale runderserum (FBS) tot klaar voor gebruik.
Opmerking: Voor de beste resultaten, staarten moet worden genomen van muizen ongeveer 6 tot 8 weken oud. Staarten kunnen muizen ouder dan 8 weken leeftijd, echter, als de leeftijd van de muizen, het vermogen van de proliferatie van de fibroblasten en de efficiëntie van herprogrammering afname11worden onttrokken. - Voer alle volgende stappen van dit protocol in de kap van een weefselkweek onder steriele omstandigheden. Bereid een verdunde trypsine-oplossing van 0,02% trypsine-EDTA in DPBS en voeg 5 mL in een ongecoate 10 cm schotel.
- Wassen van de staart, eerst in 70% ethanol en vervolgens in DPBS. Plaats de staart plat in een schotel, en pincet gebruiken tot het op zijn plaats houden. Maak een incisie op de staart langs de longitudinale as van de basis tot aan de vingertop.
- Pak de staart met een paar pincet en houd het verticaal. Met behulp van een tweede paar pincet, greep de huid naast de incisie aan de voet van de staart en schil het terug. Doe dit aan beide zijden van de incisie totdat de huid kan worden geschild af door te trekken naar beneden naar het puntje van de staart.
- Houd de gepelde staart met een tang boven de schotel met de oplossing van de trypsine en snijd de staart in ongeveer 1 cm lange stukken. Met de staart stukken in de oplossing van de trypsine, kunt schaar fragment van de stukken in kleinere stukken. Incubeer de staart stukken in de oplossing van de trypsine bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: Hoe kleiner de stukken zijn voorkeur zodat elk stuk een hoge oppervlak volumeverhouding. - Doven van de trypsine 2 volumes van fibroblast expansie (FEX) medium gebruiken (hoge-glucose Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 15% FBS, 2 mM L-glutamine, niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 100 U/mL penicilline/streptomycine).
- Verzamelen van de gehele inhoud van de schotel in een tube 50 mL en centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de staart fragmenten in 10 mL verse FEX voedingsbodem.
- Staart fragmenten in medium overbrengen in een gelatine beklede schotel en Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 en 4% O2, het toevoegen van verse FEX medium om de 2 dagen.
Opmerking: Na vijf tot zeven dagen, staart fragmenten hebt gekoppeld aan de onderkant van de schotel en fibroblasten gezien kunnen worden afgestapt van hen. - Zodra de clusters van fibroblasten zijn bevlekt, schud zachtjes de schotel te verjagen staart stukken en gecombineerd het medium en alle de botfragmenten verlaten van de fibroblasten die is gekoppeld aan de plaat. Voeg nieuwe FEX medium en cultuur van de fibroblasten tot heuvels.
- Om ervoor te zorgen geen besmetting van fibroblasten door hematopoietische progenitorcellen, distantiëren van de cellen van de plaat met behulp van 1 x trypsine-EDTA voor 5 minuten en het verzamelen van cellen. Afbreken voor cellen uiten van hematopoietische markeringen (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, en Ter-119) met behulp van een magnetische scheiding systeem10.
2. retrovirus productie
- Zaad retrovirale verpakking cellen op ongeveer 2,5 × 104 cellen/cm2 (2.0 × 106 cellen voor een 10 cm schotel) op een schotel Weefselkweek behandeld (door vacuüm-gasplasma) en cultuur overnachting in hoge-glucose DMEM met 10% FBS, 10 mM natrium Pyruvaat en 100 U/mL penicilline/streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2.
- De volgende ochtend, Wijzig op het medium DMEM met geen additieven met behulp van halve het volume dat wordt gebruikt om 's nachts cultuur (5 mL voor een 10 cm schotel). Controleer of de cellen 70-80% heuvels zijn en de transfectie beginnen in de middag.
- Voor elke herprogrammering factor bereiden Gata1, Tal1, Lmo2, en c-Myc, een mengsel 2:1 van de expressie vector (pMX) en helper vector (met gag en pol genen). Voor een 10 cm schotel van fibroblasten, door 6 µg expressie vector en 3 µg helper vector in een eindvolume van 100 µL in DMEM medium te gebruiken.
- Voor elke herprogrammering factor, bereiden van 300 µL van kamertemperatuur (RT) DMEM in een steriele polystyreen buis en voeg voorzichtig 27 µL van commerciële transfectiereagens.
Opmerking: Het transfectiereagens moet worden voorgelegd aan RT gebruik en rechtstreeks in het medium moet worden toegevoegd als de elektrostatische eigenschappen van de stof kunnen maken het vasthouden aan de kunststof wand van de buis. - Toevoegen van de plasmide mix in de transfectie reagens-bevattende buis, vortex kort en Incubeer de transfectie reagens-DNA mengsel gedurende 15 minuten op RT. kort vortex het mengsel en ontkleuring toevoegen aan de cellen retrovirale verpakking zodat de Transfectie reagens-DNA mix is gelijkmatig verspreid over de cultuur en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
- 24 uur na de transfectie, omzetten in het medium DMEM met 20% FBS en 100 U/mL penicilline/streptomycine. 48 uur na de transfectie, verzamelen het supernatant en filtreer het door een 0,22 µm poriegrootte spuit filter.
Opmerking: Virale supernatant kunnen worden bevroren tot-80 ° C en bewaard totdat vereist, hoewel transductie efficiënter is als verse virale supernatant wordt gebruikt.
3. GTLM transductie en iEP oogst
- De staart tip fibroblasten op 1 × 10-4 -cellen/cm2 op 0,1% gelatine vooraf gecoat zaad gerechten in FEX medium en Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- De volgende dag, bereiden een mengsel van signaaltransductie als volgt.
- Voeg 1 volume van virale supernatans dat voor elke herprogrammering factor aangevuld met 4 µg/mL retrovirale infectie reagens (40%) tot 6 volumes van FEX medium (60%).
- Voor een 10 cm schotel van fibroblasten, voeg 1 mL van elk virale supernatans (4 × virussen = 4 mL) aangevuld met 4 µg/mL retrovirale infectie reagens tot 6 mL van FEX medium, gevend een totaal van 10 mL transductie mengsel.
- FEX medium uit de fibroblast cultuur gecombineerd en te vervangen door het mengsel transductie. Incubeer de signaaltransductie gedurende 4 uur bij 37 ° C in hypoxische voorwaarden (5% CO2 en 4% O2).
- Het mengsel transductie gecombineerd en vervangen door verse herprogrammering medium (serumvrij uitbreiding medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/streptomycine, 100 ng/mL lymfkliertest stamcel Factor (mSCF), 10 ng/mL lymfkliertest interleukine-3 (IL3), 2 U/mL menselijke recombinant Erytropoëtine (hrEPO), en 100 nM dexamethason).
- Incubeer gedurende 8 daysat 37 ° C in hypoxische voorwaarden, het toevoegen van verse herprogrammering medium om de 2 dagen. Na vijf tot acht dagen, het succesvolle herprogrammering zal opleveren clusters van cellen die hebben losgemaakt van de plaat.
- Het verzamelen van geherprogrammeerde cellen voor analyse, zachtjes Pipetteer omhoog en omlaag om te oogsten hen rechtstreeks vanaf de schotel. Om te oogsten untransduced fibroblasten voor vergelijking, distantiëren van de cellen van de plaat met 1 x trypsine-EDTA en verzamelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we een reproduceerbare protocol voor de productie van iEPs van volwassen fibroblasten met behulp van transcriptie factor gestuurde DLR. We evalueren de cel herprogrammering met stroom cytometry, kolonie-vormende testen en gen expressie analyse. Om te helpen bij de visualisatie van de conversie naar erythroid cel lot, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor- Cre R26- eYFP) die express de gele fluorescerende proteïne (eYFP) uit de Rosa26 locus in alle cellen die uitdrukking geven aan de receptor Erytropoëtine (Epor, Cre klopte in één allel voor de endogene Epor locus) transcript in elk stadium van hun ontwikkeling12,13 ( Figuur 1A). Na succesvolle herprogrammering van erythroid progenitorcellen geïnduceerde, zijn positieve YFP (EpoR +) cellen waarneembare zo spoedig vijf dagen na transductie. Op dag 5 van herprogrammering, cellen worden ronde, opheffen van het oppervlak van de plaat en beginnen met het vormen van clusters. Dag 5-iEPs weer een erythroid precursor-achtige morfologie, die beschikken over een karakteristiek kern, grof chromatine en blauwe cytoplasma na mei-Grünwald-Giemsa-kleuring (Figuur 1C). Hemoglobinization van sommige cellen is duidelijk door positieve benzidine kleuring en een licht rode uiterlijk wanneer Ingehuld (Figuur 1 d-E). Bovendien, een kleine fractie van dag 5-iEPs Co express YFP en de erythroid-specifieke oppervlakte markering Ter119 (Figuur 1F). Door dag 8, kunnen grote YFP + clusters worden gezien. Dag 8iEPs presenteren een meer gedifferentieerde erythroid fenotype dan dag 5 iEPs; zij aanzienlijk kleiner zijn, hebben meer hemoglobine opgebouwd en ook Toon aanzienlijk upregulated uitdrukking van Ter119 (figuur 1B-1 G). Cyto-Draaiingen van dag 8-iEPs onthullen erythroid-achtige morfologie, terwijl zeer weinig enucleated Retikulocyten zijn waargenomen (Figuur 1H).
Gen expressie analyse door kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) van bulk iEPs verzameld op dag 8 blijkt dat ze bijna afsluiten expressie van genen die fibroblast en upregulated vele erythroid genen met inbegrip van globine genen, overwegend uitdrukken van embryonale typen (Figuur 1ik). Om te beoordelen of de geherprogrammeerde cellen overgang door middel van multipotente voorlopercellen, wij uitgevoerd een tijdsverloop en de expressie van hematopoietische markers in de hele herprogrammering geanalyseerd. Eerder meldden wij dat erythroid voorloper van uitvoer was het hoogst op dag 6, gevolgd door dag 8, met 10,5% ± 4,6% en 6,6% ± 0,5% van het levende YFP + cellen mede uiting van CD71 en Ter119, respectievelijk10. Er is ook een bevolking van CD41 positieve cellen vóór de verschijning van Ter119 positieve cellen. C-kit noch CD45 markers, die doorgaans in de hematopoïetische voorlopercellen en werden in de Erytropoëse uitgedrukt zijn, worden uitgedrukt op elk punt in de herprogrammering (Figuur 1J). Deze gegevens duiden erop dat de cellen gaan niet via een multipotente voorlopercellen van hematopoietische of een vroeger stadium, echter doen misschien overgang door middel van een voorvader van Megakaryocyt-erythroid.
Een betrouwbare manier om te beoordelen van de efficiëntie van de herprogrammering is BFU-E kolonievormend tests uitvoeren op de geherprogrammeerde cellen. In vitro differentiatie capaciteit van dag 5- en 8-iEPs van de dag was vehiculumcontrolegroep in methylcellulose aangevuld met menselijke Erytropoëtine, lymfkliertest stamcel factor en dexamethason. Na 8 dagen, vormde iEPs twee soorten koloniën: duidelijk rode (rode iEP) en niet-zichtbaar rood (niet-rood iEP). Terwijl cellen uit rode kolonies erytroblast morfologie weergegeven, deed niet lijken op de erythroid cellen, cellen uit niet-rood kolonies en waren onregelmatige, had grote diepe blauw en korrelig cytoplasma(Figuur 2).
Van de dag 5-iEPs gevormd ongeveer 1 in 1000 rode kolonies, terwijl slechts ongeveer 1:10,000 dag 8-iEPs gevormd rode kolonies, met een veel hoger percentage van niet-rood kolonies gevormd (Figuur 2B). Deze vermindering van kolonievormend vermogen tussen dag 5- en 8-iEPs van de dag kon worden uitgelegd byiEPs ondergaan differentiatie van 5-8 dagen en de GTLM expressievectoren lijden silencing na verloop van tijd. qPCR analyse bevestigd dat de uitdrukking van de exogene transcript aanzienlijk van 5 tot 8 dagen afneemt. Zoals verwacht in succesvolle herprogrammering, expressie niveaus van endogene Gata1, Tal1, Lmo2en c-Myc zijn geïnduceerd, endogene Lmo2 expressie is echter alleen zeer nederig uitgesproken (Figuur 2C).
Een punt van de nota, en een beperking van de test, is dat niet-rood kolonies met macrofaag-achtige cellen talrijker zijn dan de rode hemoglobinized iEP kolonies gevormd door geherprogrammeerde fibroblasten in de kolonie-vormende testen. Kolonievormend vermogen maken rode iEP kolonies kan worden verbeterd door het veranderen van de stoichiometrische verhoudingen van GTLM factoren. Transducing van de cellen met het dubbele van het bedrag van Tal1 en Lmo2 expressievectoren leidde tot een lichte stijging van de verhouding tussen rode kolonies over niet-rood kolonies, terwijl extra Gata1 heeft geleid tot een aanzienlijke toename van de vorming van rode kolonies en bijna een volledige eliminatie van niet-rood kolonies de belangrijke bijrol voor deze factoren in de Erytropoëse (Figuur 2D). Interessant, verhoogt de uitdrukking van het c-Myc drastisch de productie van niet-rood kolonies ondanks het feit dat onmisbaar is voor het herprogrammeren. Voor het verkrijgen van zuivere geïnduceerde erythroid progenitoren downstream p.a., kunnen kolonies worden geïsoleerd van de kolonie-vormende testen. We gen expressie analyse uitgevoerd in de vorm van microarray op rood en niet-rood kolonies van dag 5-iEPs en kolonies van 14,5 dagen na coïtus (dpc) foetale lever (FL) en volwassen beenmerg (BM) voor vergelijking. De microarray gegevens zijn toegankelijk via de NCBI Gene Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Wij hebben eerder aangetoond dat rode-iEP kolonies op de bona fide erythroid koloniën (FL en BM) door gen expressie10 lijken. Onderzoek van de uitdrukking van Gata1, Tal1, Lmo2, en c-Myc in elke kolonie laat zien dat, terwijl de rode kolonies vergelijkbare niveaus van meningsuiting van alle vier factoren aan FL en BM tonen, niet-rood kolonies lagere uitdrukking van hebben alle factoren, met name Gata1 (Figuur 2). Om te begrijpen wat zijn de kolonies van de niet-rood met macrofaag-achtige cellen, we de expressie van cel type-specifieke genen in elk soort kolonie uit de gegevens van microarray ondervraagde. Zoals eerder gemeld express de rode kolonies vele erythroid-specifieke genen, vergelijkbaar met die van FL en BM. Na het herzien van de gegevens, is het duidelijk dat de niet-rood kolonies Toon hoge uitdrukking van een aantal genen karakteristiek van macrofaag cellen14 (Figuur 2F). Rode noch niet-rood kolonies Toon aanzienlijk verhoogde expressie van typische Megakaryocyt genen15. Samen, blijkt deze gegevens dat de niet-rood kolonies nauwer macrofagen dan erytrocyten lijken. Aangezien niet-rood kolonies zijn nooit waargenomen wanneer een van de factoren GTLM worden verwijderd lijken deze macrofaag-achtige cellen te worden gevormd wanneer expressie niveaus van een of meer van de herprogrammering factoren Gata1, Tal1, Lmo2 lager dan zijn vereist voor herprogrammering te iEPs. Samen, suggereert dit dat de niveaus van de expressie van alle vier GTLM factoren belangrijk in TTF voor iEP herprogrammering zijn en dat heterogeniteit te verklaren is door de onvolledige herprogrammering van afzonderlijke cellen, die potentieel kunnen worden gecorrigeerd door aanpassing de stoichiometrische verhoudingen.
Om te beoordelen van de efficiëntie en robuustheid van onze protocol, we kunnen instellen aantal fibroblasten produceren zichtbare clusters van iEP cellen na 5 dagen getest wanneer gekweekt in 384-Wells-platen. We bepaald dat uit 24 transductions van 20, 30, 40 en 50 TTFs, het aantal putjes met ten minste één iEP cluster 3 (0,6% van platen fibroblasten), 15 (2,0% van platen fibroblasten), 15 (1,6% van platen fibroblasten) en 13 (1,1% van platen fibroblasten) , respectievelijk. Dit suggereert dat GLTM iEP herprogrammering een robuust en betrouwbaar proces dat een rendement van 1 is % kan bereiken.
Andere factoren die van invloed kunnen zijn op de efficiëntie van herprogrammering bevatten het nummer van de passage van de fibroblasten en de kweekomstandigheden. We vergeleken de herprogrammering efficiëntie van TTFs die had al drie keer gepasseerd of negen keer vóór transductie. TTFs dat had negen keer is gepasseerd (P9) toonde een dramatische vermindering in het vermogen te produceren van clusters van iEPs (Figuur 3A). Interessant is dat opneming van serum in de herprogrammering media volledig blokken herprogrammering, vervangt serum met erythroid cytokines is nodig zijn om de getransduceerde factoren om te rijden de nieuwe cel lot zonder compounding signalen van het serum. Verwijdering van het serum en de uitdrukking van nieuwe factoren binnen de cel dreigt te worden stressvolle op de cellen. Inderdaad, blokkeren p53 activering sterk verhoogde het aantal iEPs gegenereerd. Dit effect kan ook worden gezien in de herprogrammering van de p53 knockout fibroblasten (Figuur 3B-D). De remming van de p53 signalering leidt tot meer cell survival en beter herprogrammering en is een gevalideerde methode voor de verbetering van rendement. Ten slotte, herprogrammering in hypoxische voorwaarden is gunstig, maar niet essentieel is voor de productie van de iEP. Echter getransduceerde TTFs gekweekt in normoxia zijn veel langzamer om te herprogrammeren en iEP clusters worden waargenomen na 10 dagen in plaats van vijf tot acht dagen (Figuur 3E).
Figuur 1 : Gedwongen uitdrukking van Gata1, Tal1, Lmo2en c-Myc reprograms lymfkliertest volwassen fibroblasten in erythroid progenitoren die eigenschappen van bona fide erythroid cellen vertonen. (A) proefopzet voor transcriptie factor-gemedieerde herprogrammering van de verslaggever van de erythroid (Epor-Cre R26-eYFP) staart tip fibroblasten (TTF) naar EpoR + geherprogrammeerd cellen. (B-F) Tijd loop van iEP generatie van untransduced TTFs (dag 0) en bulk GTLM-getransduceerde TTFs op dag 5 en 8 (vertegenwoordiger van n = 2-3). Transdifferentiatie werd beoordeeld door (B) live-cel, helder-field beelden van één wells (schaal bar, 50 µm); (C) mei-Grünwald - Giemsa-kleuring cyto-spin (schaal bar, 20 µm); (D) Benzidine/Giemsa-kleuring cyto-spin (schaal bar, 20 µm); (E) macroscopische inspectie cel pellets; en (F) vertegenwoordiger stroom cytometry percelen weergegeven: YFP / Ter119 expressie. (G) cel diameter van iEPs geoogst op dagen 5 en 8 gemeten vanaf verschillende cyto-spin-dia's, een afname van de celgrootte tonen op dag 8. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD (n = 21-25); p ≤ 0,0001 door ongepaarde t-test. (H) vertegenwoordiger high-resolution benzidine/Giemsa beelden van GTLM-getransduceerde TTFs op dag 8. Schaal bar, 5 µm. (I) relatieve mRNA uitdrukking van relevante fibroblast - en erythroid-specifieke genen, met inbegrip van globine genen in untransduced TTFs (grijze kolommen) versus bulk GTLM-getransduceerde TTFs (rode kolommen) op dag 8, bepaald door de qPCR. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD (n = 4-6 voor iEPs, n = 2 voor untransduced TTFs). (J) grafiek die samenvatting van tijdsverloop stroom cytometry analyse van untransduced TTF (dag 0) en bulk GTLM-getransduceerde TTF geoogst op dag 2, 4, 6 en 8 weergegeven: YFP, CD45, CD71 en Ter119 expressie (n = 3). Gegevens worden gepresenteerd zoals gemiddelde ± SD. figuur aangepast van Capellera-Garcia S is, et al. 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : GTLM iEPs produceren rood en niet-rood kolonies in BFU-E kolonie testen. (A) vertegenwoordiger helder-veld en mei-Grünwald-Giemsa cytospin beelden van rode iEP-afgeleide en niet-rood kolonies. Schaal bars, 50 µm (kolonie afbeeldingen) en 10 µm (cyto-spin beelden). (B) kolonie graven gegenereerd op basis van vergulde untransduced TTFs, bulk dag 5 iEPs en bulk dag 8. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 door two-way ANOVA. (C) relatieve mRNA uitdrukking van Gata1, Tal1, Lmo2, en c-Myc in untransduced TTF en bulk GTLM-getransduceerde TTF geoogst op dag 5 en dag 8, bepaald door de qPCR. Inleidingen werden zo ontworpen dat endogene expressie kan worden onderscheiden van totale expressie. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD (n = 4-6 voor iEPs, n = 2 voor untransduced TTF). (D) gegenereerd op basis van de graven van de kolonie vergulde untransduced TTFs en bulk dag 5 iEPs gegenereerd door een verdubbeling van de verhouding tussen elk van de GTLM factoren. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD (n = 3); ** p ≤ 0.001; p ≤ 0,0001 door two-way ANOVA. (E) relatieve expressie van Gata1, Tal1, Lmo2, en c-Myc in untransduced fibroblasten en geplukt kolonies gegenereerd vanuit GTLM-getransduceerde iEPs (rode en niet-rood), 14,5 dpc foetale lever en volwassen bot beenmerg, bepaald door microarray. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 door two-way ANOVA. (F) relatieve expressie van geselecteerde genen bekend om hun uitdrukking in erythroid (boven), Megakaryocyt (midden) en macrofaag (onder) cellen in untransduced fibroblasten en geplukt kolonies gegenereerd op basis van GTLM-getransduceerde iEPs (rode en niet-rood), 14.5dpc foetale lever en volwassen beenmerg, bepaald door microarray. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 door two-way ANOVA. Figuur is aangepast van Capellera-Garcia S, et al.. 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : GTLM herprogrammering is een robuust en betrouwbaar proces. (A) grafiek van het aantal clusters waargenomen van 10.000 TTFs en representatieve foto's op dag 5 van GTLM herprogrammering van staart tip fibroblasten (TTF), die drie passages (P3) of negen passages (P9) voorafgaand aan herprogrammering hebben ondergaan. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD (n = 6); schaal bars zijn 50 µm. (B-D) representatieve foto's van iEP clusters 6 dagen na het (B) GTLM herprogrammering van staart tip fibroblasten; (C) GTLM herprogrammering van TTFs met toevoeging van p53DN expressie vector; (D) GTLM herprogrammering van p53 knock-out TTFs (schaal bars = 50 µm). (E) representatieve foto's van iEP clusters na 10 dagen GTLM te herprogrammeren uitgevoerd op normoxic voorwaarden (schaal bar = 50 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), is voldoende om te herprogrammeren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks naar iEPs10. De cellen geherprogrammeerde erythroid leek sterk op bona fide erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype, genuitdrukking en kolonievormend vermogen. Deze bevinding bevestigt de grondgedachte van het gebruik van directe herprogrammering als een instrument voor het definiëren van ontwikkelingsstoornissen factoren in Haematopoiese. Ter ondersteuning van de geldigheid van deze methode, kunnen ook iEPs worden gegenereerd met behulp van GTLM inductie van muis embryonale fibroblasten en menselijke voorhuid fibroblasten, laat zien dat het werkt voor fibroblasten van verschillende oorsprong en over soorten10. In dit verslag veroorzaken wij herprogrammering van fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muis als een instrument om te visualiseren de conversie naar een erythroid cel. Gebruik van deze muis is nuttig, maar niet essentieel zijn voor het protocol. We routinematig uitvoeren met behulp van meerdere soorten fibroblast uit verschillende stammen van de muis te herprogrammeren en identificeren van iEPs door de cel oppervlakte marker uitdrukking van Ter119 en CD71.
Onze huidige werkwijze genereert iEPs dat het fenotype van een primitieve erythroid in tegenstelling tot een definitieve volwassen fenotype vertonen. Een belangrijk verschil tussen deze fasen van ontwikkeling is de uitdrukking van verschillende globine genen. We hebben echter aangetoond dat toevoeging van Klf1 en Myb de GTLM cocktail wijzigingen iEPs globine-expressiepatroon van overwegend embryonale aan vooral volwassen10,14. Interessant, vooroordelen toevoeging van Gata2 en Runx1 aan de vier-factor cocktail en thrombopoietin in het medium de herprogrammering proces op weg naar de megakaryocytic afstamming16.
De GTLM-geïnduceerde iEPs produceren erythroid progenitoren met een primitieve gen expressie handtekening en een beperkte proliferatieve capaciteit. Bovendien, de iEPs produceren zeer weinig enucleated erytrocyten. De arme erythroid voorlopercellen uitbreiding is te verklaren door het uitblijven van herprogrammeren aan kit + definitieve erythroid cellen, die potentieel kon worden bereikt met toevoeging van andere factoren inducerende directe herprogrammering te iEPs met een definitieve genexpressie programma.
Onze gegevens suggereren ook arme enucleation efficiëntie is verklaard door het feit dat GTLM-geïnduceerde iEPs genereren met een primitieve voorlopers, in plaats van een definitieve gen expressie programma. Verschillende pogingen om het optimaliseren van de kweekomstandigheden werden geprobeerd zonder verbeterde enucleation. Voortdurende pogingen om beide voorlopercellen proliferatie en enucleation efficiënter zijn daarom gericht op het identificeren ontbrekende factoren voor inducerende herprogrammering naar definitieve iEPs.
Voor de optimale realisatie van rode iEP kolonies is het van vitaal belang dat de getransduceerde cellen zijn met alle vier vectoren en de GTL genen worden uitgedrukt op een hoog niveau. De momenteel meest efficiënte methode staat helaas geen voorafgaande controle van vector titers. Een poging tot verbetering van de efficiëntie met behulp van bicistronic lentivirale vectoren was niet succesvol, mogelijk als gevolg van problemen met inferieure stoichiometrie of onvoldoende expressie niveaus. Terwijl gewerkt wordt aan het verbeteren van herprogrammering vectoren, geproduceerd met behulp van combinaties van vers blijft van de meest efficiënte methode vector supernatant met de eerder beschreven retrovirale vectoren uiting van slechts één factor en geen selectie marker gene.
GTLM herprogrammering te iEPs is het enige gerapporteerde protocol kunnen produceren van erythroid voorlopercellen-achtige cellen uit een vastgelegd aantal somatische cellen. Zoals een onderzoeksmethode voor gereedschap de DLR iEP heeft dus diverse voordelen ten opzichte van andere erythroid cel modelsystemen zoals de erythroid-cel lijnen HiDEPs/HuDEP cellen (PMID: 23533656)17. Terwijl HiDEPs/HuDEP cellen handiger hulpmiddelen voor grootschalige erytrocyt productie en de evaluatie van de genfunctie tijdens terminal Erytropoëse zijn, is het unieke voordeel van GTLM herprogrammering aan iEPs de mogelijkheid om rechtstreeks te bestuderen van de kern transcriptionele programma's erythroid cel lot bepalen. GTLM herprogrammering biedt een waardevol platform voor het bestuderen van beide Erytropoëse in mens en muis, bijvoorbeeld om te studeren het schakelen tussen primitieve en definitieve Erytropoëse. Inzicht in deze schakeloptie is van enorm belang in de mogelijke behandeling van Hemoglobinopathieën, zoals sikkelcelanemie, waarin onderzoekers streven om de schakelaar in de volwassenen terug te nemen fetal hemoglobine te verlichten van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang verslag.
Acknowledgments
Wij danken Evelyn Wang en Gregory Hyde (Instituut Whitehead, Cambridge, MA) voor klonen en Harvey Lodish (Instituut Whitehead) voor het verstrekken van veel van de plasmiden gebruikt voor het genereren van de retrovirale bibliotheek. Wij danken Kavitha Siva en Sofie Singbrant (afdeling van moleculaire geneeskunde en Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson en Shamit Soneji (departement voor moleculaire hematologie, Lund University) voor hun rollen in beschrijving van iEP productie. Wij willen ook te erkennen en dank Julian Pulecio (centrum voor regeneratieve geneeskunde, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Instituut voor medisch onderzoek en Vakgroep Geneeskunde, St Vincent's Hospital, Universiteit van Melbourne), Ángel Raya (Catalaanse instelling voor onderzoek en geavanceerde Studies, Barcelona) en Vijay G. Sankaran (Broad Instituut van het Massachusetts Institute of Technology en Harvard, Cambridge ) voor hun vorige bijdrage aan dit werk. Dit werk werd gesteund door de Ragnar Söderberg Stichting (JF); het Zweedse onderzoek Raad (aan J.F.); Stichting Olle Engkvist Byggmästare (aan J.F.); de Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek (JF); Åke Wiberg van Stichting (JF); een toekenning van de integratie Marie Curie (aan J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
