Summary
Här presenterar vi våra protokoll för producera inducerad erytroid stamfäder (iEPs) från mus vuxen fibroblaster med transkription faktorn-driven direkt härstamning omprogrammering (DLR).
Abstract
Erytroid cell engagemang och differentiering vidare genom aktivering av ett härstamning-begränsad transkriptionell nätverk iscensatt av en grupp av cell ödet avgöra och mognar faktorer. Vi tidigare anges för att definiera en minimal uppsättning faktorer som behövs för att instruera röda blodkroppar utveckling med hjälp av direkt härstamning omprogrammering av fibroblaster till inducerad erytroid föräldraparets/prekursorer (iEPs). Vi visade att överuttryck av Gata1, Tal1, Lmo2och c-Myc (GTLM) kan snabbt konvertera murina och mänskliga fibroblaster direkt till iEPs som liknar bona fide erytroid celler i form av morfologi, fenotyp, och genuttryck. Vi har för avsikt att iEPs kommer att ge ett ovärderligt verktyg för att studera erytropoesen och cell öde förordning. Här beskriver vi de stegvis processen att omvandla murina tail tip fibroblaster till iEPs via transkription faktorn-driven direkt härstamning omprogrammering (DLR). I det här exemplet utför vi omprogrammering i fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss som uttrycker det gula fluorescerande proteinet (YFP) under kontroll av erytropoietin receptorn gen (EpoR) arrangören, för visualisering av erytroid cell öde induktion vid omprogrammering. Efter detta protokoll, fibroblaster kan omprogrammeras till iEPs inom fem till åtta dagar.
Medan processen kan fortfarande förbättras, visar vi att GTLM-medierad omprogrammering är en snabb och direkt process, ger celler med egenskaperna för bona fide erytroid stamceller och föregångare celler.
Introduction
Röda blodkroppar (RBC) är viktiga i alla ryggradsdjur och 84% av alla celler av mänskliga kroppar1. Från embryonala till vuxna liv är vår hälsa starkt beroende av exakt reglering av RBC homeostas. Pågående produktion av mogna röda blodkroppar under utveckling i vuxenlivet kallas erytropoes. En stor utmaning i erytropoesen forskning är att definiera ledar tillsynsmyndigheterna som dirigera RBC utveckling och växla mellan primitiva och slutgiltiga erytropoes. Direkt härstamning omprogrammering av erytroid föräldraparets utgör en möjlighet att ytterligare förstå erytroid utveckling i vivo.
Direkt härstamning omprogrammering (DLR), även känd som transdifferentiation, är processen att omprogrammera en celltyp direkt in i another, förbi pluripotenta och multipotenta stamceller stadier. DLR har hittills använts för att producera många celltyper inklusive neurala2, hematopoetiska3,4,5, nedsatt6 och nefrotiskt7, stamceller. För utvecklingstoxicitet biologer, har DLR blivit ett viktigt verktyg för förhör aspekter av härstamning engagemang och terminal differentiering processer8,9. DLR kan komplettera och delvis ersätta i vivo studier för förståelse mekanismer i cellen öde avgörande faktorer under utveckling. DLR protokollet för omprogrammering till erytroid stamfäder som beskrivs i detta dokument ger fältet en gratis metod för utvecklande studier av erytropoes.
Vi har tidigare visat att överuttryck av en fyra-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, och c-MYC (GTLM), räcker att programmera både murina och mänskliga fibroblaster direkt till inducerad erytroid stamfäder (individuella) 10. the GTLM-omprogrammeras erytroid celler kraftigt likna bona fide primitiva erytroid föräldraparets vad gäller morfologi, fenotyp och gene expression10. Således iEPs har begränsad spridning kapacitet och mogna till kärnförsedda erytrocyter liknar de övergående produceras i det tidiga embryot innan uppkomsten av slutgiltiga erytropoes. Genom att göra ändringar i omplanering förhållanden (t.ex. punktmutationer i omprogrammering faktorer eller tillägg av andra faktorer), kan man förstå hur detta leder till förändringar i erytroid utveckling och differentiering. Vi har till exempel visat att tillägg av Klf1 eller Myb till GTLM cocktail ändras mönstret globin uttryck från huvudsakligen embryonala (primitiva) främst vuxna (slutgiltiga). Detta konstaterande bekräftar giltigheten av använda DLR som ett verktyg för att definiera utvecklingsmässiga faktorer i erytropoesen.
Här beskriver vi processen att skapa iEPs från mus tail tip fibroblaster (TTF). I våra representativa resultat, vi utfört omprogrammering på fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss (Epor- Cre R26- eYFP) som uttryckligt det gula fluorescerande proteinet (eYFP) från det Rosa26 locus i alla celler som har uttryckt erytropoietin receptorn, möjliggör enkel visualisering av åtagande att erytroid härstamning. Med den här metoden är positiv YFP (EpoR +) celler närvarande så tidigt som fem dagar efter transduktion. Detta protokoll, därför erbjuder en snabb och robust teknik för generering av erytroid stamfäder i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inrättande och underhåll av primära mus svans tips Fibroblast kulturer
- Förbereda gelatin-belagd rätter (rekommenderar en 10 cm parabolantenn för en svans) genom att täcka ytan med 0,1% gelatin och ruvning rätter för ca 20 min vid 37 ° C. Aspirera gelatin lösningen från skålen och låt den torka i minst 2 h.
- Euthanize möss av cervikal dislokation. Ta bort svansen med sax, skär vid basen av svansen. Sätta svansen i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) med 2% fetalt bovint serum (FBS) förrän du är klar att använda.
Obs: För bästa resultat, svansar tas från möss cirka 6 till 8 veckors ålder. Svansar kan tas från möss som är äldre än 8 veckor ålder, dock som möss ålder, funktionen proliferation av fibroblaster och effektiviteten i omprogrammering minskningen11. - Utföra alla efterföljande steg i detta protokoll i en vävnadskultur huva under sterila förhållanden. Bereda en utspädd trypsin lösning 0,02% trypsin-EDTA i DPBS och tillsätt 5 mL i en obelagd 10 cm skålen.
- Tvätta svansen, först i 70% etanol, sedan i DPBS. I en skål, placera svansen platt och använda pincett för att hålla den på plats. Gör ett snitt på svansen längs dess längdaxel från basen till spetsen.
- Förstå svansen med ett par pincett och håll den lodrätt. Använder ett par pincett, greppa huden bredvid snitt vid basen av svansen och skala den tillbaka. Gör detta på båda sidor av snittet tills huden kan vara skalade bort genom att dra nedåt mot spetsen av svansen.
- Håller skalade svansen med tången över skålen som innehåller trypsin lösningen och skär svansen i ca 1 cm långa bitar. Med svansen bitar i trypsin lösningen, använd sax för att fragmentera bitarna i mindre bitar. Inkubera svans bitarna i trypsin lösningen vid 37 ° C i 10 min.
Obs: Ju mindre bitar är att föredra för att ge varje bit en hög yta volym-förhållande. - Släcka den trypsin använder 2 volymer av fibroblast expansion (FEX) medium (hög-glukos Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM) med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, icke-essentiella aminosyror (NEAA) och 100 U/mL Penicillin/Streptomycin).
- Samla hela innehållet i skålen till en 50 mL tub och centrifugera vid 350 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera svans fragment i 10 mL färsk FEX medium.
- Överföra svans fragment i medium till en gelatin-belagd maträtt och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 och 4% O2, lägga till färsk FEX medium varannan dag.
Obs: Efter fem till sju dagar, svans fragment har fäst på botten av skålen och fibroblaster kan ses flytta bort från dem. - När kluster av fibroblaster är fläckig, skaka försiktigt skålen för att rubba svans bitar och aspirera medium och alla de benfragment som lämnar fibroblaster kopplad till plattan. Lägg till nytt FEX medium och kultur fibroblaster tills konfluenta.
- För att säkerställa att ingen förorening av fibroblaster av hematopoetiska progenitorceller, separera celler från plattan med hjälp av 1 x trypsin-EDTA 5 min och samla celler. Bryter ned för celler som uttrycker hematopoetiska markörer (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, och Ter-119) med hjälp av en magnetisk separation system10.
2. retrovirus produktion
- Utsäde retrovirala förpackning celler på cirka 2,5 × 104 celler/cm2 (2,0 × 106 celler för en 10 cm maträtt) på en vävnadskultur-behandlade (genom vakuum-gas plasma) maträtt och kultur övernattning i hög-glukos DMEM med 10% FBS, 10 mM natrium Pyruvat och 100 U/mL Penicillin/Streptomycin vid 37 ° C och 5% CO2.
- Följande morgon, ändra mediet till DMEM utan tillsatser som använder halva volymen brukade kultur över natten (5 mL för en 10 cm maträtt). På eftermiddagen, kontrollera att cellerna är 70-80% konfluenta och påbörja transfection.
- För varje omplanering faktor förbereda Gata1, Tal1, Lmo2, och c-Myc, en 2:1 blandning uttryck vektor (pMX) och helper vektor (innehållande gag och pol gener). För en 10 cm maträtt av fibroblaster, Använd 6 µg av uttrycket vektor och 3 µg helper vektor i en slutlig volym av 100 µL i DMEM medium.
- För varje omplanering faktor, förbereda 300 µL av rumstemperatur (RT) DMEM i ett sterilt polystyren rör och tillsätt försiktigt 27 µL av kommersiella transfection reagens.
Obs: Transfection reagens bör föras till RT före användning och måste läggas direkt i mediet som de elektrostatiska egenskaperna av föreningen kan göra det. hålla sig till plast väggen i röret. - Lägg till plasmid blandningen i transfection reagens-innehållande röret, vortex kort och inkubera transfection reagens-DNA blandningen i 15 min på RT. kort vortex blandningen och Lägg droppvis till retrovirala förpackning cellerna så att transfection reagens-DNA mix är jämnt fördelad över kulturen och inkubera vid 37 ° C över natten.
- 24 h efter transfection, ändra mediet till DMEM med 20% FBS och 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. 48 h efter transfection, samla supernatanten och filtrera den genom ett 0,22 µm porstorlek spruta filter.
Obs: Viral supernatanterna kan vara fryst till-80 ° C och hållas tills krävs, även om transduktion är effektivare om färska viral supernatanten används.
3. GTLM transduktion och iEP skörd
- Utsäde som svansen spets fibroblaster på 1 × 104 celler/cm2 på 0,1% gelatin pre belagda rätter i FEX medium och inkubera vid 37 ° C under 24 h.
- Följande dag, förbereda en transduktion blandning enligt följande.
- Lägga till 1 volymdel viral supernatanten för varje omplanering faktor som kompletteras med 4 µg/mL retrovirala infektion reagens (40%) i 6 volymer av FEX medium (60%).
- För en 10 cm maträtt av fibroblaster, tillsätt 1 mL varje viral supernatanten (4 × virus = 4 mL) kompletteras med 4 µg/mL retrovirala infektion reagens till 6 mL FEX medium, vilket ger totalt 10 mL transduktion blandning.
- Aspirera FEX medium från fibroblast kultur och ersätta det med transduktion blandningen. Inkubera i transduktion i 4 h vid 37 ° C i hypoxisk villkor (5% CO2 och 4% O2).
- Aspirera transduktion blandningen och ersätta det med frisk omplanering medium (serumfritt Expansion medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/Streptomycin, 100 ng/mL murina Stem Cell faktor (mSCF), 10 ng/mL murina interleukin-3 (IL3), 2 U/mL humant rekombinant Erytropoietin (hrEPO), och 100 nM dexametason).
- Inkubera i 8 daysat 37 ° C i hypoxisk förhållanden, lägga till färsk omplanering medium varannan dag. Efter fem till åtta dagar, kommer att framgångsrika omprogrammering ge kluster av celler som har lossnat från plattan.
- Samla in Omstyrda celler för analys, försiktigt Pipettera upp och ner för att skörda dem direkt från skålen. För att skörda untransduced fibroblaster för jämförelse, separera celler från plattan med hjälp av 1 x trypsin-EDTA och samla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi ett reproducerbart protokoll för produktion av iEPs från vuxna fibroblaster med transkription faktorn-driven DLR. Vi utvärderar cell omprogrammering med flödescytometri, kolonibildande analyser och gen uttryck analys. För att bistå i visualisering av omvandlingen till erytroid cell öde, vi utfört omprogrammering på fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss (Epor- Cre R26- eYFP) som uttryckligt det gula fluorescerande proteinet (eYFP) från det Rosa26 locus i alla celler som uttrycker erytropoietin receptorn (Epor, Cre knackat in en allel av den endogena Epor locus) Avskrift i något skede av sin utveckling12,13 ( Figur 1A). Efter framgångsrika omprogrammering av inducerad erytroid stamfäder, är YFP positiva (EpoR +) celler observerbara så tidigt som fem dagar efter transduktion. Av dag 5 av omprogrammering, cellerna blir runda, lyft från ytan av plattan och börja bilda kluster. Dag 5-iEPs visas en erytroid föregångare-liknande morfologi, som har en karakteristisk centrala kärnan, grova kromatin och blå cytoplasman efter maj-Grünwald-Giemsa färgning (figur 1C). Hemoglobinization av vissa celler är uppenbart av positiva benzidin färgning och ett milt rött utseende när pelleterat (Figur 1 d-E). Dessutom en bråkdel av dag 5-iEPs samtidig express YFP och erytroid-specifika ytan markören Ter119 (figur 1F). Dag 8, kan stora YFP + kluster ses. Dag 8iEPs presentera en mer differentierad erytroid fenotyp än dag 5 iEPs; de är betydligt mindre, har samlat mer hemoglobin och också Visa kraftigt uppreglerad uttryck för Ter119 (figur 1B–1 G). CYTO-dragningar på dag 8-iEPs avslöja erytroid morfologi, medan mycket få utan retikulocyter observeras (figur 1H).
Gen uttryck analys av kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) av bulk iEPs samlas in vid dag 8 visar att de har nästan avstängning uttryck av fibroblast gener och har uppreglerad många erytroid gener inklusive globinzinkinsulin gener, huvudsakligen att uttrycka embryonala typer (figur 1jag). För att bedöma om de omprogrammerade cellerna övergång genom multipotenta stamfäder, vi utfört en dags kurs och analyseras uttryck för hematopoetiska markörer i hela omprogrammering. Vi har tidigare rapporterat att erytroid föregångare var produktionen högsta på dag 6, följt av dag 8, med 10,5% ± 4,6% och 6,6% ± 0,5% av levande YFP +-celler som uttrycker Co CD71 och Ter119, respektive10. Det finns också en befolkning på CD41 positiva celler för utseendemässigt av Ter119 positiva celler. Varken c-kit eller CD45 markörer, vilket uttrycks vanligen i hematopoetiska stamceller och nedreglerade i erytropoes, uttrycks vid någon omprogrammering (figur 1J). Dessa data tyder på att cellerna inte går via en multipotenta hematopoetiska stamceller eller tidigare skede, men gör kanske övergången genom en megakaryocyt-erytroid stamceller.
Ett tillförlitligt sätt att bedöma effektiviteten av omprogrammering är att utföra BFU-E kolonibildande analyser på omprogrammerade cellerna. In vitro differentiering dag 5- och kapacitet dag 8-iEPs var analyseras i metylcellulosa kompletteras med humant erytropoietin, murina stamceller faktor och dexametason. Efter 8 dagar, iEPs bildade två typer av kolonier: distinkt röd (röd iEP) och inte-synligt rött (icke-röd iEP). Medan celler från röda kolonier visas erytroblast morfologi, celler från icke-röd kolonierna likna inte erytroid celler, och var oregelbunden, hade stora djupblå och granulat cytoplasman (figur 2A).
Av den dag 5-iEPs bildade ungefär 1 av 1 000 röda kolonier, medan endast ungefärligt 1:10,000 dag 8-iEPs bildas röda kolonier, med en mycket högre andel av icke-röd kolonier bildas (figur 2B). Denna minskning av kolonibildande förmåga mellan dag 5 och dag 8-iEPs kunde vara förklaras byiEPs genomgår differentiering från dagarna 5-8 och GTLM uttryck vektorer lidande ljuddämpning över tid. qPCR-analys bekräftat att uttrycket av exogena avskriften minskar betydligt från 5 till 8 dagar. Som förväntat i framgångsrika omprogrammering, uttrycksnivåerna för endogena Gata1, Tal1, Lmo2och c-Myc induceras, endogena Lmo2 uttryck är dock endast mycket ödmjuk uttryckt (figur 2C).
En punkt att notera, och en begränsning av analysen, är att icke-röd kolonier som innehåller makrofag-liknande celler är fler än de röda hemoglobinized iEP kolonierna bildade av omprogrammerade fibroblaster i kolonibildande analyser. Kolonibildande förmåga att skapa röda iEP kolonier kan förbättras genom att ändra de stökiometriska förhållanden för GTLM faktorer. Transducing cellerna med dubbla mängden Tal1 och Lmo2 uttryck vektorer ledde till en liten ökning i förhållandet mellan röda kolonier över icke-röd kolonier, medan extra Gata1 ledde till en betydande ökning i bildandet av röda kolonier och nästan en fullständig eliminering av icke-röd kolonier stödja viktiga roll för dessa faktorer i erytropoes (figur 2D). Intressant nog ökar ökar uttrycket av c-Myc drastiskt produktionen av icke-röd kolonier trots att den är oumbärlig för omprogrammering. För att få ren inducerad erytroid stamfäder för efterföljande analys, kan kolonier isoleras från de kolonibildande analyserna. Vi genomförde gen uttryck analys i form av microarray på rött och icke-röd kolonier från dag 5-iEPs och kolonier från 14,5 dagar efter coitus (dpc) fostrets lever (FL) och vuxen benmärg (BM) för jämförelse. Microarray data är tillgängliga genom NCBI'S Gene Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Vi har tidigare visat att röd-iEP kolonier liknar bona fide erytroid kolonierna (FL och BM) av gene expression10. Granskning av uttrycket av Gata1, Tal1, Lmo2, och c-Myc i varje koloni visar att medan de röda kolonierna visar liknande uttryck för alla fyra faktorer till FL och BM, icke-röd kolonier har lägre uttryck för alla faktorer, särskilt Gata1 (figur 2E). För att förstå vad är de icke-röd kolonierna som innehåller makrofag-liknande celler, vi tillfrågade uttrycket av cell typspecifika gener i varje typ av kolonin från microarray data. Som tidigare rapporterats uttrycker röd kolonierna många erytroid-specifika gener, liknande den i FL och BM. Efter återbesök data, är det tydligt att icke-röd kolonierna visar hög uttrycket av en rad gener karakteristiska makrofag celler14 (figur 2F). Varken röd eller icke-röd kolonier visar signifikant ökat uttryck av typiska megakaryocyt gener15. Tillsammans, tyder dessa data på att de icke-röd kolonierna mer liknar makrofager än erytrocyter. Eftersom icke-röd kolonier observeras aldrig när en av faktorerna som GTLM avlägsnas verkar dessa makrofag-liknande celler bildas när uttrycksnivåerna för en eller flera av de omplanering faktorerna Gata1, Tal1, Lmo2 är lägre än krävs för omprogrammering till iEPs. Sammantaget tyder detta på att uttrycksnivåerna av alla fyra GTLM faktorer är viktiga i TTF till iEP omprogrammering och att heterogenitet förklaras av ofullständig omprogrammering av enskilda celler, som potentiellt kan rättas genom att justera stökiometriska förhållanden.
För att bedöma effektivitet och tålighet i våra protokoll, vi testade set antal fibroblaster förmåga att producera synliga kluster av iEP celler efter 5 dagar när odlade i 384 brunnar. Vi fast beslutna att antalet brunnar med minst en iEP kluster av 24 transductions av 20, 30, 40 och 50 TTFs, var 3 (0,6% av plattor fibroblaster), 15 (2,0% av plattor fibroblaster), 15 (1,6% av plattor fibroblaster) och 13 (1,1% av plattor fibroblaster) , respektive. Detta tyder på att GLTM iEP omprogrammering är en robust och pålitlig process som kan nå en verkningsgrad på 1%.
Andra faktorer som kan påverka effektiviteten i omprogrammering inkluderar passage antalet fibroblaster och odlingsbetingelserna. Vi jämförde omplanering effektiviteten av TTFs som hade varit anpassade tre gånger eller nio gånger före transduktion. TTFs som hade varit överförda nio gånger (P9) visade en dramatisk minskning av förmågan att producera kluster av iEPs (figur 3A). Intressant, införande av serum i omplanering media helt block omprogrammering, ersätter serum med erytroid cytokiner är nödvändigt att tillåta de transduced faktorerna att driva den nya cellen öde utan kompoundering signaler från serumet. Borttagning av serum och uttrycket av nya faktorer inom cellen sannolikt vara stressigt på cellerna. Faktiskt, blockerar p53 aktiveringen kraftigt ökade antalet iEPs genereras. Denna effekt kan också ses i omprogrammering av p53 knockout fibroblaster (figur 3B-D). Hämning av p53 signalering leder till mer cell överlevnad och bättre omprogrammering och är en validerad metod för att förbättra avkastningen. Slutligen, omprogrammering i hypoxisk villkor är gynnsam men inte avgörande för iEP produktion. Men sensorik TTFs odlade i normoxia är mycket långsammare att omprogrammera och iEP kluster observeras efter 10 dagar i stället för fem till åtta dagar (figur 3E).
Figur 1 : Tvingad uttryck för Gata1, Tal1, Lmo2och c-Myc omprogrammerar murina vuxen fibroblaster in erytroid stamfäder som uppvisar egenskaper av bona fide erytroid celler. (A) experimentell design för transkription faktorn-medierad omprogrammering av erytroid reporter (Epor-Cre R26-eYFP) svans tip fibroblaster (TTF) till EpoR + omprogrammerade celler. (B–F) Tid kursen av iEP generation av untransduced TTFs (dag 0) och bulk GTLM-sensorik TTFs på dag 5 och 8 (representant för n = 2-3). Transdifferentiation utvärderades genom (B) live-cell, ljusa fält bilder av enstaka brunnar (skala bar, 50 µm); (C) maj-Grünwald - Giemsa färgning cyto-spin (skalstapeln, 20 µm); (D) benzidin/Giemsa färgning cyto-spin (skalstapeln, 20 µm); (E) makroskopiska inspektion av cell pelletar; och (F) representativa flödescytometri tomter visar YFP / Ter119 uttryck. (G) Cell diameter iEPs skördas på dag 5 och 8 mätt från flera cyto-spin diabilder, visar en minskning av Cellstorlek på dag 8. Data presenteras som genomsnitt ± SD (n = 21-25); p ≤ 0,0001 av oparat t-test. (H) representativa högupplösta benzidin/Giemsa bilder av GTLM-sensorik TTFs dag 8. Skalstapeln, 5 µm. (I) relativ mRNA uttryck för relevanta fibroblast - och erytroid-specifika gener inklusive globinzinkinsulin gener i untransduced TTFs (grå kolumner) kontra bulk GTLM-sensorik TTFs (röda kolumner) på dag 8, bestäms av qPCR. Data presenteras som genomsnitt ± SD (n = 4-6 för iEPs, n = 2 för untransduced TTFs). (J) diagrammet visar Sammanfattning av tidsförlopp Flödesanalys flödescytometri av untransduced TTF (dag 0) och bulk GTLM-sensorik TTF skördas på dag 2, 4, 6 och 8 visar YFP, CD45, CD71 och Ter119 uttryck (n = 3). Data presenteras som medelvärde ± SD. figur är anpassad från Capellera-Garcia S, et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : GTLM iEPs producerar röda och icke-röd kolonier i BFU-E kolonin analyser. (A) representativa ljusa-området och maj-Grünwald-Giemsa cytospin bilder av iEP-derived röd och icke-röd kolonier. Skala barer, 50 µm (koloni bilder) och 10 µm (cyto-spin bilder). (B) kolonin räknas genereras från guldpläterade untransduced TTFs, bulk dag 5 iEPs och bulk dag 8. Data presenteras som genomsnitt ± SD (n = 3); p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 av tvåvägs ANOVA. (C) relativ mRNA uttryck av Gata1, Tal1, Lmo2, och c-Myc i untransduced TTF och bulk GTLM-sensorik TTF skördas på dag 5 och dag 8, bestäms av qPCR. Primers utformades så att endogena uttryck skulle kunna skiljas från totala uttryck. Data presenteras som genomsnitt ± SD (n = 4-6 för iEPs, n = 2 för untransduced TTF). (D) kolonin räknas genereras från klädd untransduced TTFs, och bulk dag 5 iEPs genereras genom att fördubbla förhållandet mellan var och en av faktorerna som GTLM. Data presenteras som genomsnitt ± SD (n = 3); ** p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 av tvåvägs ANOVA. (E) relativ uttryck av Gata1, Tal1, Lmo2, och c-Myc i untransduced fibroblaster och plockade kolonier genereras från GTLM-sensorik iEPs (röd och icke-röd), 14,5 dpc fostrets lever och vuxen ben märg, bestäms av microarray. Data presenteras som genomsnitt ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 av tvåvägs ANOVA. (F) relativ uttryck för valda gener kända för deras uttryck i erytroid (överst), megakaryocyt (mitten) och makrofag (nederst) celler i untransduced fibroblaster och plockade kolonier genereras från GTLM-sensorik iEPs (röd och icke-röd), 14.5dpc fostrets lever och benmärg från vuxna, bestäms av microarray. Data presenteras som genomsnitt ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 av tvåvägs ANOVA. Figur är anpassad från Capellera-Garcia S, et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : GTLM omprogrammering är en robust och tillförlitlig process. (A) Graf över antalet kluster observeras från 10.000 TTFs och representativa bilder på dag 5 av GTLM omprogrammering av tail tip fibroblaster (TTF) som har genomgått tre passager (P3) eller nio passager (P9) före omprogrammering. Data presenteras som genomsnitt ± SD (n = 6); skala barer är 50 µm. (B–D) representativa bilder av iEP clusters 6 dagar efter (B) GTLM omprogrammering av tail tip fibroblaster; (C) GTLM omprogrammering av TTFs med tillsats av p53DN uttryck vektor. (D) GTLM omprogrammering av p53 knockout TTFs (skala barer = 50 µm). (E) representativa bilder av iEP kluster efter 10 dagar av GTLM omprogrammering utfört på normoxic villkor (skalstapeln = 50 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Överuttryck av en fyra-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, och c-MYC (GTLM), räcker att omprogrammera murina och mänskliga fibroblaster direkt till iEPs10. Omprogrammerade erytroid cellerna liknade kraftigt bona fide erytroid föräldraparets vad gäller morfologi, fenotyp, genuttryck och kolonibildande förmåga. Detta konstaterande bekräftar den logiska grunden för att använda direkta omprogrammering som ett verktyg för att definiera utvecklingsmässiga faktorer i blodbildningen. För att stödja giltigheten av denna metod, kan iEPs också genereras använder GTLM induktion av mus embryonala fibroblaster och mänskliga förhud fibroblaster, visar att det fungerar för fibroblaster av olika ursprung och över arter10. I denna rapport framkalla vi omprogrammering av fibroblaster från erytroid härstamning-tracing musen som ett verktyg för att visualisera omvandlingen till en erytroid cell. Användning av den här musen är användbart men inte kritiska till protokollet. Vi rutinmässigt utför omprogrammering med flera typer av fibroblast från olika mus stammar och identifiera iEPs genom cell surface markör uttryck för Ter119 och CD71.
Vår nuvarande metoden genererar iEPs som uppvisar en primitiv erytroid fenotyp i motsats till en slutgiltig vuxen fenotyp. En stor skillnad mellan dessa faser av utveckling är ett uttryck för olika globinzinkinsulin gener. Vi har dock visat att tillägg av Klf1 och Myb till 'den GTLM cocktail förändringar iEPs globin uttryck mönster från huvudsakligen embryonala till främst vuxna10,14. Intressant, biaskällor tillägg av Gata2 och Runx1 till fyra-faktor cocktail och trombopoetin medium omprogrammering processen mot de megakaryocytic härstamning16.
De GTLM-inducerad iEPs producera erytroid föräldraparets med en primitiv gen uttryck signatur och en begränsad proliferativ kapacitet. Dessutom producerar iEPs mycket få utan erytrocyter. Den fattiga erytroid stamceller expansionen förklaras av misslyckandet med att programmera kit + slutgiltiga erytroid cellerna, vilket potentiellt skulle kunna uppnås med tillägg av andra faktorer som förmå direkt omprogrammering till iEPs med en slutgiltig genuttryck programmet.
Våra data tyder också på dålig enucleation effektivitet förklaras av det faktum GTLM-inducerad iEPs generera prekursorer med en primitiv, i stället för en slutgiltig gen uttryck program. Flera försök att optimera odlingsbetingelserna försökte utan förbättrad enucleation. Pågående försök att öka båda stamceller spridning och enucleation effektivitet är därför inriktad på att identifiera saknade faktorer för att inducera omprogrammering till slutgiltig iEPs.
För optimal produktion av röda iEP kolonier är det viktigt att cellerna är sensorik med alla fyra vektorer och GTL gener uttrycks på höga nivåer. Den för närvarande mest effektiva metoden tillåter tyvärr inte förhandskontroll av vektor-titrar. Det lyckades inte ett försök att förbättra effektiviteten med hjälp av bicistronic lentiviral vektorer, möjligen på grund av problem med sämre stökiometri eller otillräckliga nivåer. Medan arbetet pågår att förbättra omplanering vektorer, produceras mest effektiva metod resterna med kombinationer av färska vektor supernatanten med de tidigare beskrivna retrovirala vektorer uttrycker endast en faktor och inga urval markörgen.
GTLM omprogrammering till iEPs är det enda rapportera protokollet kan producera erytroid stamceller-liknande celler från en engagerad somatiska celler. Eftersom en forskningsmetod verktyg DLR iEP därför har flera fördelar över andra erytroid cell modellsystem som cellen erytroid linjer HiDEPs/HuDEP celler (PMID: 23533656)17. Medan HiDEPs/HuDEP celler är mer praktiskt verktyg för storskalig erytrocyt produktion och utvärdera genfunktion under terminal erytropoes, är den unika fördelen GTLM omprogrammering till iEPs förmågan att direkt studera av kärnan transkriptionell program fastställa erytroid cell öde. GTLM omprogrammering ger en ovärderlig plattform för att studera både erytropoes i människor och mus, till exempel för att studera växla mellan primitiva och slutgiltiga erytropoes. Förstå denna växel är av stort intresse för potentiell behandling av hemoglobinopathies, såsom Sickle-Cell anemi, där forskarna strävar efter att vända växeln hos vuxna till fetalt hemoglobin att lindra sjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter till rapport.
Acknowledgments
Vi tackar Evelyn Wang och Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) för kloning och Harvey Lodish (Whitehead Institute) för att ge många av plasmidsna används för att generera retrovirala biblioteket. Vi tackar Lillemor Siva och Sofie Singbrant (Institutionen för molekylärmedicin och Gene Therapy, Lunds universitet), Göran Karlsson och Shamit Soneji (Institutionen för molekylär hematologi, Lunds universitet) för sina roller i Beskrivning av iEP produktion. Vi vill också erkänna och tacka Julian Pulecio (centrum för regenerativ medicin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Institutet för medicinsk forskning och Institutionen för medicin, St Vincent's Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (katalanska institutionen för forskning och avancerade studier, Barcelona) och Vijay G. Sankaran (Broad Institute i Massachusetts Institute of Technology och Harvard, Cambridge ) för deras tidigare bidrag till detta arbete. Detta arbete stöds av Ragnar Söderbergs stiftelse (till J.F.); Vetenskapsrådet (till J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (till J.F.); Stiftelsen för strategisk forskning (till J.F.); Åke Wibergs stiftelse (till J.F.); Marie Curie integration bidrag (till J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
