Summary
Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).
Abstract
Differenziazione e impegno delle cellule eritroidi procedere attraverso l'attivazione di una rete di transcriptional lignaggio-limitata orchestrata da un gruppo di destino delle cellule determinazione e fattori di maturazione. Abbiamo precisato in precedenza per definire il set minimo dei fattori necessari per istruire il globulo rosso sviluppo utilizzando discendenza diretta riprogrammazione dei fibroblasti in progenitori/precursori eritroidi indotta (iEPs). Abbiamo mostrato che la sovraespressione di Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) può rapidamente convertire murine ed umane fibroblasti direttamente a iEPs che assomigliano alle cellule eritroidi bona fide in termini di morfologia, fenotipo, e l'espressione genica. Intendiamo che iEPs fornirà uno strumento prezioso per studiare il regolamento di destino delle cellule e di eritropoiesi. Qui descriviamo il processo graduale di conversione fibroblasti punta coda murino in iEPs tramite trascrizione factor-driven discendenza diretta riprogrammazione (DLR). In questo esempio, eseguiamo la riprogrammazione in fibroblasti dai topi di lignaggio traccia degli eritrociti che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) sotto il controllo del promotore del gene (EpoR) del recettore dell'eritropoietina, consentendo la visualizzazione di cellule eritroidi induzione di destino su riprogrammazione. A seguito di questo protocollo, fibroblasti possono essere riprogrammati in iEPs entro cinque-otto giorni.
Mentre possono ancora essere apportati miglioramenti al processo, indichiamo che GTLM-mediata riprogrammazione è un processo rapido e diretto, producendo cellule con proprietà di bona fide cellule eritroidi progenitrici e precursore.
Introduction
Globuli rossi (RBCs) sono essenziali in tutti i vertebrati e costituiscono l'84% di tutte le cellule dei corpi umani1. Da embrionali alla vita adulta, la nostra salute dipende altamente esatta regolazione dell'omeostasi di RBC. La produzione costante di RBCs maturo nel corso dello sviluppo in età adulta è noto come eritropoiesi. Una sfida importante nella ricerca di eritropoiesi è quello di definire i regolatori matrici che orchestrano sviluppo di RBC e lo switch tra eritropoiesi primitivo e definitiva. Discendenza diretta riprogrammazione dei progenitori eritroidi rappresenta un'opportunità per capire meglio degli eritrociti sviluppo in vivo.
Discendenza diretta riprogrammazione (DLR), noto anche come transdifferenziazione, è il processo di riprogrammazione di un tipo delle cellule direttamente in un altro, bypassando pluripotenti e fasi di progenitrici multipotenti. DLR finora è stato utilizzato per la produzione di numerosi tipi cellulari inclusi neurali2, ematopoietico3,4,5, epatica6 e nefrotica7, cellule progenitrici. Per i biologi dello sviluppo, DLR è diventato uno strumento importante per inquisitorie aspetti dell'impegno di lignaggio e differenziazione terminale processi8,9. DLR possono integrare e sostituire parzialmente in vivo studi per comprendere i meccanismi del destino delle cellule durante lo sviluppo i fattori determinanti. Il protocollo DLR per la riprogrammazione di progenitori eritroidi descritti in questo documento fornisce il campo un metodo gratuito per studi evolutivi dell'eritropoiesi.
Precedentemente abbiamo dimostrato che la sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per riprogrammare i fibroblasti sia murini ed umani direttamente ai progenitori eritroidi indotta (iEPs) 10. cellule eritroidi riprogrammato il GTLM assomigliano notevolmente bona fide degli eritrociti primitivi progenitori in termini di morfologia, fenotipo e gene espressione10. Così iEPs hanno una limitata capacità di proliferazione e matura in eritrociti nucleati simili a quelle prodotte transitoriamente nell'embrione precoce prima dell'inizio della eritropoiesi definitivo. Apportando modifiche nelle condizioni riprogrammazione (per esempio, mutazioni puntiformi nella riprogrammazione fattori o aggiunta di altri fattori), si può capire come questo comporti cambiamenti nello sviluppo degli eritrociti e differenziamento. Ad esempio abbiamo indicato che aggiunta di Klf1 o Myb al cocktail GTLM cambia il modello di espressione della globina da prevalentemente embrionale (primitivo) per principalmente per adulti (definitivo). Questa individuazione conferma la validità dell'utilizzo di DLR come strumento per la definizione dei fattori dello sviluppo nella eritropoiesi.
Qui, descriviamo il processo di generazione iEPs da fibroblasti di topo coda punta (TTF). Nei nostri risultati rappresentativi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor- Cre R26- eYFP) che esprimono la proteina fluorescente gialla (eYFP) dal locus Rosa26 in tutte le cellule che hanno espresso il recettore dell'eritropoietina, permettendo facile visualizzazione di impegno per la stirpe degli eritrociti. Utilizzando questo metodo, YFP positivo (EpoR +) cellule sono presenti già cinque giorni dopo la trasduzione. Questo protocollo, pertanto, offre una tecnica veloce e affidabile per la generazione di progenitori eritroidi in vitro.
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Protocol
1. stabilimento ed il mantenimento della coda del Mouse primario suggerimento culture del fibroblasto
- Preparare piatti rivestite con gelatina (consigliamo un piatto di 10 cm per una coda) che copre la superficie con 0,1% di gelatina e incubando i piatti per circa 20 min a 37 ° C. Aspirare la soluzione di gelatina dal piatto e lasciare asciugare per almeno 2 h.
- Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Rimuovere la coda con le forbici, tagliare alla base della coda. Mettere la coda in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con 2% siero bovino fetale (FBS) fino all'uso.
Nota: Per ottenere risultati ottimali, code devono essere prelevate da topi circa 6-8 settimane di età. Tails può essere assunto dai topi più vecchi di 8 settimane di età, tuttavia, come l'età di topi, la capacità di proliferazione dei fibroblasti e l'efficienza della riprogrammazione diminuzione11. - Eseguire tutti i passaggi successivi del presente protocollo in una cappa di coltura del tessuto in condizioni sterili. Preparare una soluzione diluita della tripsina di tripsina-EDTA 0.02% in DPBS e aggiungere 5 mL in un piatto non patinata cm 10.
- Lavare la coda, prima in etanolo al 70%, poi in DPBS. In un piatto, mettere la coda piatte e utilizzare pinze per tenerlo in posizione. Fare un'incisione sulla coda lungo il suo asse longitudinale dalla base alla punta.
- Afferrare la coda con un paio di pinze e tenerlo verticalmente. Utilizzando un secondo paio di pinze, afferrare la pelle accanto l'incisione alla base della coda e staccarla indietro. Effettuare questa operazione su entrambi i lati dell'incisione fino a quando la pelle può essere staccata tirando verso il basso verso la punta della coda.
- Tenere la coda pelata con forcipe sopra il piatto contenente la soluzione di tripsina e tagliare la coda in pezzi lunghi circa 1 cm. Con i pezzi di coda nella soluzione di tripsina, usare le forbici per frammentare i pezzi in pezzi più piccoli. Incubare i pezzi di coda nella soluzione di tripsina a 37 ° C per 10 min.
Nota: Il più piccolo i pezzi sono preferiti in modo da fornire ogni pezzo un'elevata superficie in rapporto al volume. - Placare la tripsina usando 2 volumi di mezzo di espansione (FEX) del fibroblasto (alto-glucosio Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 15% FBS, 2 mM L-Glutammina, gli aminoacidi Non essenziali (NEAA) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina).
- Raccogliere tutto il contenuto del piatto in un tubo da 50 mL e centrifugare a 350 × g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere i frammenti di coda in 10 mL di mezzo FEX fresco.
- Trasferire frammenti di coda in mezzo ad un piatto di gelatina-rivestito e incubare a 37 ° C in 5% CO2 e 4% O2, l'aggiunta di mezzo FEX fresco ogni 2 giorni.
Nota: Dopo cinque-sette giorni, frammenti di coda hanno fissato nella parte inferiore del piatto e fibroblasti possono essere visto allontanarsi da loro. - Una volta che i cluster dei fibroblasti sono macchiati, agitare delicatamente il piatto per sloggiare i pezzi di coda e aspirare il mezzo e tutti i frammenti di osso lasciando i fibroblasti fissati alla piastra. Aggiungere il nuovo terreno FEX e cultura i fibroblasti fino confluenti.
- Per non garantire la contaminazione dei fibroblasti di progenitori ematopoietici, dissociare le cellule dalla piastra con 1 x tripsina-EDTA per 5 minuti e raccogliere le cellule. Impoveriscono per le cellule che esprimono marcatori ematopoietici (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 e Ter-119) utilizzando un sistema di separazione magnetica10.
2. retrovirus produzione
- Cellule di imballaggio retrovirali a circa 2,5 × 104 cellule/cm2 (2,0 × 106 celle per un piatto di 10 cm) su una piastra di coltura del tessuto-trattati (a vuoto-gas plasma) e cultura pernottamento in alto-glucosio DMEM con 10% di semi FBS, 10 mM sodio Piruvato e 100 U/mL di penicillina/streptomicina a 37 ° C e 5% CO2.
- La mattina seguente, è necessario modificare il mezzo in DMEM senza additivi utilizzando la metà del volume usata per coltura durante la notte (5 mL per un piatto di 10 cm). Nel pomeriggio, verifica che le cellule sono 70-80% confluenti e iniziano la transfezione.
- Per ogni fattore di riprogrammazione, Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc, preparare una miscela 2:1 del vettore di espressione (pMX) e vettore di supporto (che contiene geni gag e pol). Per un piatto di 10 cm di fibroblasti, utilizzare 6 µ g di vettore di espressione e 3 µ g del vettore helper in un volume finale di 100 µ l in mezzo DMEM.
- Per ogni fattore di riprogrammazione, preparare 300 µ l di temperatura ambiente (TA) DMEM in una provetta sterile in polistirolo e attentamente 27 µ l di reagente di transfezione commerciale.
Nota: Il reagente di transfezione prima dell'uso deve essere portato a RT e deve essere aggiunto direttamente nel mezzo come la proprietà elettrostatiche del composto può rendere attaccano alla parete del tubo di plastica. - Aggiungere il mix di plasmide nel tubo contenenti reagente di transfezione, vortex brevemente e incubare la miscela reagente-DNA di transfezione per 15 min a RT. brevemente vortice la miscela e aggiungere goccia a goccia per le cellule di imballaggio retrovirali affinché la transfezione mix di reagente-DNA è uniformemente sopra la coltura e incubare a 37 ° C durante la notte.
- 24 ore dopo la trasfezione, modificare il mezzo in DMEM con 20% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro di formato del poro siringa da 0,22 µm.
Nota: Surnatanti virali possono essere congelati a-80 ° C e tenuti fino a quando richiesto, anche se la trasduzione è più efficiente se fresco surnatante virale viene utilizzato.
3. GTLM trasduzione e raccolto iEP
- Seme la coda punta fibroblasti 1 × 104 cellule/cm2 su 0,1% gelatina prepatinato piatti nel mezzo di FEX e incubare a 37 ° C per 24 h.
- Il giorno seguente, preparare una miscela di trasduzione come segue.
- Aggiungere 1 volume del surnatante virale per ogni fattore di riprogrammazione completati con 4 µ g/mL di reagente di infezione retrovirale (40%) a 6 volumi di mezzo FEX (60%).
- Per un piatto di 10 cm di fibroblasti, aggiungere 1 mL di ciascuna surnatante virale (virus × 4 = 4 mL) completati con 4 µ g/mL di reagente di infezione retrovirale da 6 mL di mezzo di FEX, dando un totale di 10 mL di miscela di trasduzione.
- Aspirare il mezzo di FEX dalla coltura del fibroblasto e sostituirlo con la miscela di trasduzione. Incubare la trasduzione per 4 h a 37 ° C in condizioni di ipossia (5% CO2 e 4% O2).
- Aspirare la miscela di trasduzione e sostituirlo con fresco riprogrammazione medio (medium privo di siero espansione (SFEM), 100 U/mLPenicillin/streptomicina, 100 ng/mL murino Stem Cell Factor (mSCF), 10 ng/mL murino interleukin-3 (IL3), ricombinante umano di 2 U/mL Eritropoietina (hrEPO) e 100 nM desametasone).
- Incubare per 8 giornata 37 ° C in condizioni di ipossia, aggiungendo mezzo riprogrammazione fresco ogni 2 giorni. Dopo cinque-otto giorni, riprogrammazione riuscita resa di aggregati di cellule che hanno staccato dalla piastra.
- Per raccogliere le cellule riprogrammate per l'analisi, pipettare delicatamente su e giù per raccoglierle direttamente dal piatto. Per raccogliere untransduced fibroblasti per il confronto, dissociare le cellule dalla piastra con 1 x tripsina-EDTA e raccogliere.
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Representative Results
Qui presentiamo un protocollo riproducibile per la produzione di iEPs dai fibroblasti adulti utilizzando trascrizione factor-driven DLR. Valutiamo la riprogrammazione delle cellule tramite flusso cytometry, formanti colonie saggi e gene analisi di espressione. Al fine di facilitare la visualizzazione della conversione al destino delle cellule eritroidi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor- Cre R26- eYFP) che esprimono la proteina fluorescente gialla (eYFP) dal locus Rosa26 in tutte le cellule che esprimono il recettore dell'eritropoietina (Epor, Cre buttato in un allele del locus endogeno Epor ) trascrizione in qualsiasi fase del loro sviluppo12,13 ( Figura 1A). Dopo successo riprogrammazione di indotto progenitori eritroidi, YFP (EpoR +) le cellule positive sono osservabili già cinque giorni dopo la trasduzione. Dal giorno 5 di riprogrammazione, le cellule diventano rotonde, sollevare dalla superficie della piastra e cominciare a formare ammassi. Giorno 5-iEPs visualizzare una precursore-come la morfologia degli eritrociti, che presentano un caratteristico nucleo centrale, cromatina grossolana e citoplasma blu dopo May-Grünwald-Giemsa colorazione (Figura 1C). Hemoglobinization di alcune cellule è evidente dalla macchiatura positiva benzidina e un aspetto leggermente rosso quando pellettato (Figura 1-E). Inoltre, una piccola frazione del giorno 5-iEPs YFP co-express e il marcatore di superficie eritroide-specifico Ter119 (Figura 1,F). Giorno 8, cluster di grandi dimensioni YFP + può essere veduto. Giorno 8iEPs presentano un fenotipo differenziato degli eritrociti di giorno 5 iEPs; sono significativamente più piccole, hanno accumulato più di emoglobina e mostrano anche significativamente aumentata espressione di Ter119 (Figura 1B–1 G). CYTO-giri di giorno 8-iEPs rivelano degli eritrociti-come la morfologia, mentre molto pochi reticulocytes enucleated sono osservati (Figura 1H).
Analisi di espressione genica mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) di massa iEPs raccolti al giorno 8 dimostra che essi hanno quasi arresto di espressione dei geni dei fibroblasti e sono sovraregolati molti geni degli eritrociti, compreso i geni della globina, prevalentemente esprimendo tipi embrionali (Figura 1ho). Per valutare se le cellule riprogrammate transizione attraverso progenitori multipotenti, abbiamo effettuato un corso a tempo ed abbiamo analizzato l'espressione di marcatori ematopoietici in tutto di riprogrammazione. Precedentemente abbiamo segnalato che uscita precursore eritroide era più alto il giorno 6, seguita da giorno 8, con il 10,5% ± 4.6% e 6,6% ± 0,5% del live YFP + cellule cheesprimono CD71 e Ter119, rispettivamente10. C'è anche una popolazione di cellule positive CD41 prima della comparsa di cellule positive Ter119. C-kit, né CD45 marcatori, che solitamente sono espressi in cellule progenitrici ematopoietiche e downregulated nella eritropoiesi, sono espressi in qualsiasi punto la riprogrammazione (Figura 1,J). Questi dati suggeriscono che le cellule non andare attraverso un emopoietiche multipotenti o la fase precedente, però fare forse la transizione attraverso un megacariocita-eritroidi progenitrici.
Un modo affidabile per valutare l'efficienza della riprogrammazione è quello di effettuare saggi di formazione di colonie di BFU-E sulle cellule riprogrammate. Capacità di differenziazione in vitro di giorno 5 - e giorno 8-iEPs è stata analizzata in metilcellulosa completato con eritropoietina umana, fattore di cellule staminali murine e desametasone. Dopo 8 giorni, iEPs formano due tipi di colonie: distintamente rosso (rosso iEP) e non-visibilmente rosso (non rosso iEP). Mentre visualizzate le celle da colonie rosse morfologia eritroblasti, cellule dalle colonie non rosso non assomigliavano cellule eritroidi ed erano irregolari, avevano grande citoplasma granulare e profondo blu (Figura 2A).
Del giorno 5-iEPs, circa 1 in 1.000 formano colonie rosse, mentre solo circa 1: 10.000 giorno 8-iEPs formano colonie rosse, con un rapporto molto più alto di colonie non rosso formato (Figura 2B). Questa riduzione di formazione di colonie capacità tra il giorno 5 - e il giorno 8-iEPs potrebbe essere spiegato byiEPs in fase di differenziazione da giorni 5-8 e i vettori di espressione GTLM sofferenza silenziamento nel corso del tempo. analisi qPCR ha confermato che l'espressione della trascrizione esogena diminuisce in modo significativo da 5 a 8 giorni. Come previsto nella riprogrammazione di successo, i livelli di espressione di endogeno Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc sono indotti, tuttavia, espressione endogena Lmo2 è solo molto umile espressa (Figura 2C).
Un punto di nota e una limitazione del test, è che non rosso colonie contenenti macrofago-come le cellule superano in numero le colonie di rosso hemoglobinized iEP formate da fibroblasti riprogrammati in formanti colonie saggi. Formanti colonie capacità di creare colonie iEP rosso può essere migliorata modificando i rapporti stechiometrici relativi fattori GTLM. Trasduzione delle cellule con il doppio dei vettori di espressione Tal1 e Lmo2 ha condotto ad un leggero aumento nel rapporto di colonie rosse sopra colonie non rosso, mentre supplementare Gata1 ha portato ad un significativo aumento nella formazione di colonie rosse e quasi una completa eliminazione delle colonie non rosso sostenendo il ruolo importante per questi fattori nella eritropoiesi (Figura 2D). È interessante notare che, aumentando l'espressione di c-Myc drasticamente aumenta la produzione di colonie non rosso pur essendo indispensabile per la riprogrammazione. Per ottenere i progenitori eritroidi indotto puro per analisi a valle, colonie possono essere isolati da analisi della formazione di colonie. Abbiamo effettuato analisi di espressione genica in forma di microarray su colore rosso e non rosso colonie dal giorno 5-iEPs e colonie da 14,5 giorni post coito (dpc) fegato fetale (FL) e adulti del midollo osseo (BM) per il confronto. I dati di microarray sono accessibili attraverso di NCBI Gene Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Precedentemente abbiamo indicato che rosso-iEP colonie simili colonie eritroidi bona fide (FL e BM) di gene espressione10. L'esame dell'espressione di Gata1, Tal1, Lmo2 e c-Myc in ogni colonia dimostra che, mentre le colonie rosse mostrano simili livelli di espressione di tutti i quattro fattori di FL e BM, non rosso colonie hanno espressione più bassa di tutti i fattori, soprattutto Gata1 (Figura 2E). Per capire che cosa sono le colonie non rosso contenente macrofago-come le cellule, abbiamo esaminato l'espressione di geni specifici del tipo delle cellule in ogni tipo di Colonia dai dati di microarray. Come precedentemente segnalato, le colonie rosse esprimono molti geni eritroide-specifico, simile a quella di FL e BM. Dopo rivisitando i dati, è chiaro che le colonie non rosso mostrano un'alta espressione di un numero di geni caratteristici di macrofago cellule14 (Figura 2F). Né rossi né non-rosso colonie mostrano significativamente aumentata espressione dei tipici megacariocita geni15. Insieme, questi dati suggeriscono che le colonie non rosso assomigliano più molto attentamente macrofagi di eritrociti. Poiché non rosso colonie non sono mai osservati quando uno dei fattori GTLM vengono rimossi questi macrofago-come le cellule sembrano essere formata quando i livelli di espressione di uno o più dei fattori di riprogrammazione Gata1, Tal1, Lmo2 sono inferiori necessaria per la riprogrammazione di iEPs. Insieme, questo suggerisce che i livelli di espressione di quattro GTLM tutti i fattori sono importanti in TTF per iEP riprogrammazione e che eterogeneità si spiega riprogrammando incompleta delle singole celle, che potenzialmente possono essere corretto regolando rapporti stechiometrici.
Per valutare l'efficienza e la robustezza del nostro protocollo, abbiamo verificato la capacità di impostare numeri dei fibroblasti a produrre visibili aggregati di cellule iEP dopo 5 giorni quando coltivate in piastre da 384 pozzetti. Abbiamo stabilito che fuori 24 trasduzioni di 20, 30, 40 e 50 TTFs, il numero di pozzetti con iEP almeno un cluster era 3 (0,6% dei fibroblasti piastre), 15 (2.0% dei fibroblasti piastre), 15 (1,6% dei fibroblasti piastre) e 13 (1.1% dei fibroblasti piastre) , rispettivamente. Ciò suggerisce che GLTM iEP riprogrammazione è un processo robusto e affidabile che può raggiungere un'efficienza pari all'1%.
Altri fattori che possono influenzare l'efficienza della riprogrammazione includono il numero di passaggio dei fibroblasti e delle condizioni di cultura. Abbiamo confrontato l'efficienza di riprogrammazione della TTFs che erano state attraversate tre volte o nove volte prima di trasduzione. TTFs che erano state attraversate nove volte (P9) hanno mostrato una drastica riduzione nella capacità di produrre grappoli di iEPs (Figura 3A). Interessante, l'inclusione del siero nei media che riprogramma completamente isolati riprogrammazione, sostituzione del siero con citochine degli eritrociti sono necessari consentire i fattori trasdotte guidare il nuovo destino della cellula senza segnali composti dal siero. Rimozione del siero e l'espressione di nuovi fattori all'interno della cellula è probabile che sia stressante sulle cellule. Infatti, bloccando l'attivazione di p53 notevolmente aumentato il numero di iEPs generato. Questo effetto può essere visto anche nella riprogrammazione dei fibroblasti di knockout p53 (Figura 3B-D). Inibizione di p53 segnalazione conduce a più sopravvivenza e meglio riprogrammazione delle cellule ed sono un metodo convalidato per migliorare il rendimento. Infine, riprogrammazione in condizioni di ipossia è favorevole ma non vitale per la produzione di iEP. Tuttavia, trasdotte TTFs coltivate in normoxia sono molto più lento di riprogrammare e iEP mazzi sono osservati dopo 10 giorni invece di cinque-otto giorni (Figura 3E).
Figura 1 : Espressione forzata di Gata1, Tal1, Lmo2, c-Myc e riprogramma fibroblasti murini adulti nei progenitori eritroidi che esibiscono proprietà di cellule eritroidi bona fide . (A) disegno sperimentale per trascrizione fattore-mediata riprogrammazione del reporter degli eritrociti (Epor-Cre R26-eYFP) punta fibroblasti (TTF) di coda a EpoR + riprogrammato cellule. (B–F) Tempo di corso della generazione di iEP di TTFs untransduced (giorno 0) e alla rinfusa trasdotte GTLM TTFs nei giorni 5 e 8 (rappresentante di n = 2-3). Transdifferenziazione è stata valutata da immagini di cellule vive, campo chiaro (B) dei singoli pozzetti (barra della scala, 50 µm); (C) - Giemsa di May-Grünwald colorazione cyto-spin (barra della scala, 20 µm); (D) benzidina/Giemsa colorazione cyto-spin (barra della scala, 20 µm); (E) ispezione macroscopica delle palline delle cellule; e (F) rappresentante flusso cytometry diagrammi che mostrano YFP / Ter119 espressione. (G) diametro delle cellule di iEPs raccolte nei giorni 5 e 8 misurata da diverse diapositive cyto-spin, mostrando una diminuzione nel formato delle cellule il giorno 8. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 21-25); p ≤ 0,0001 di spaiato t-test. (H) rappresentante ad alta risoluzione della benzidina/Giemsa immagini di trasdotte GTLM TTFs il giorno 8. Barra della scala, 5 µm. (I) l'espressione del mRNA relativa dei geni dei fibroblasti ed eritroide-specifico relativo compreso i geni della globina in untransduced TTFs (colonne grigie) contro massa trasdotte GTLM TTFs (colonne rosse) il giorno 8, determinati da qPCR. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 4-6 per iEPs, n = 2 per untransduced TTFs). (J) grafico Mostra riepilogo di analisi di citometria a flusso di tempo-corso di untransduced TTF (giorno 0) e massa GTLM trasdotte TTF raccolte al giorno 2, 4, 6 e 8 mostrano espressione di YFP, CD45, CD71 e Ter119 (n = 3). I dati sono presentati come media ± SD. figura è adattato da Capellera-Garcia S, et al. 10. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : GTLM iEPs producono colonie rosse e non rosso nelle analisi di BFU-E Colonia. (A) rappresentante campo chiaro e May-Grünwald-Giemsa cytospin immagini di iEP-derivato rosso e non rosso colonie. Barre della scala, 50 µm (immagini di Colonia) e 10 µm (immagini cyto-spin). (B) conteggi di Colonia generati da TTFs untransduced placcato, giorno 5 iEPs di massa e massa giorno 8. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 mediante ANOVA a due vie. (C) espressione del mRNA relativa di Gata1, Tal1, Lmo2 e c-Myc in untransduced TTF e massa GTLM trasdotte TTF raccolte al giorno 5 e 8, determinato da qPCR. Gli iniettori sono stati progettati affinché espressione endogena potrebbe essere distinto dall'espressione totale. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 4-6 per iEPs, n = 2 per untransduced TTF). (D) conteggi di Colonia generati da placcato TTFs untransduced e alla rinfusa giorno 5 iEPs generato raddoppiando il rapporto di ciascuno dei fattori GTLM. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 3); * * p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 mediante ANOVA a due vie. (E) l'espressione relativa di Gata1, Tal1, Lmo2 e c-Myc in fibroblasti untransduced e colonie raccolte generato da GTLM trasdotte iEPs (rosso e non rosso), 14,5 fegato fetale dpc e adulta dell'osso midollo, determinato mediante microarray. I dati sono presentati come media ± deviazione standard; * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0,005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 mediante ANOVA a due vie. (F) espressione relativa dei geni selezionati conosciuti per la loro espressione in eritroidi (in alto), megacariocita (al centro) e del macrofago cellule (in basso) in fibroblasti untransduced e raccolte nelle colonie generate da GTLM trasdotte iEPs (rosso e non rosso), 14.5dpc fegato fetale e del midollo osseo adulto, determinato mediante microarray. I dati sono presentati come media ± deviazione standard; * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0,005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 mediante ANOVA a due vie. Figura è adattata da Capellera-Garcia S, et al. 10. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : GTLM riprogrammazione è un processo robusto e affidabile. (A) il grafico del numero di cluster osservato da 10.000 TTFs e immagini rappresentative il giorno 5 della GTLM riprogrammazione dei fibroblasti di punta coda (TTF) che sono stati sottoposti a tre passaggi (P3) o nove passaggi (P9) prima della riprogrammazione. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 6); barre della scala sono 50 µm. (B–D) immagini rappresentative di un iEP cluster 6 giorni dopo (B) GTLM riprogrammazione dei fibroblasti di punta coda; (C) GTLM riprogrammazione di TTFs con aggiunta di vettore di espressione p53DN; (D) GTLM riprogrammazione di TTFs knockout p53 (scala bar = 50 µm). (E) immagini rappresentative dei cluster iEP dopo 10 giorni di GTLM riprogrammazione eseguita in condizioni di normossia (barra della scala = 50 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per la riprogrammazione di fibroblasti murini ed umani direttamente a iEPs10. Cellule eritroidi riprogrammate notevolmente ha assomigliato a bona fide progenitori eritroidi in termini di morfologia, fenotipo, espressione genica e possibilità di formazione di colonie. Questa scoperta conferma il razionale dell'utilizzo di riprogrammazione diretta come uno strumento per definire i fattori dello sviluppo nell'ematopoiesi. Per supportare la validità di questo metodo, iEPs può essere generato anche utilizzando induzione GTLM di fibroblasti embrionali del topo e fibroblasti umani del prepuzio, mostrando che funziona per i fibroblasti di origini diverse e attraverso specie10. In questo rapporto, induciamo riprogrammazione dei fibroblasti dal mouse lignaggio traccia degli eritrociti come uno strumento per visualizzare la conversione a un cellulare degli eritrociti. L'uso di questo mouse è utile ma non fondamentale per il protocollo. Abbiamo regolarmente eseguire riprogrammazione utilizzando più tipi del fibroblasto da vari ceppi di topi e identificare iEPs da espressione di superficie dell'indicatore delle cellule di Ter119 e CD71.
Il nostro metodo corrente genera iEPs che presentano un fenotipo eritroide primitivo al contrario di un fenotipo adulto definitivo. La principale differenza tra queste fasi dello sviluppo è l'espressione dei geni della globina differenti. Tuttavia, abbiamo dimostrato che l'aggiunta di Klf1 e Myb al modello di espressione della globina del iEPs GTLM cocktail modifiche dal prevalentemente embrionale per principalmente per adulti10,14. È interessante notare che, aggiunta di Gata2 e Runx1 per il cocktail di quattro-fattore e trombopoietina nel medium biases il processo riprogrammante verso la stirpe megakaryocytic16.
Il iEPs indotta da GTLM produrre progenitori eritroidi con una firma di espressione genica primitivo e una capacità proliferativa limitata. Inoltre, il iEPs producono pochissimi eritrociti enucleated. L'espansione di progenitori eritroidi povero è spiegato dal fallimento di riprogrammare per kit + cellule eritroidi definitivo, che potenzialmente potrebbero essere realizzate con aggiunta di altri fattori che inducono riprogrammazione diretta a iEPs con un'espressione genica definitivo programma.
I nostri dati suggeriscono anche efficienza di enucleazione povero è spiegato dal fatto indotta da GTLM iEPs generare precursori con una primitiva, piuttosto che un programma di espressione genica definitiva. Parecchi tentativi di ottimizzazione delle condizioni di coltura sono stati tentati senza enucleazione migliorata. In corso tentativi per aumentare l'efficienza di proliferazione e il enucleation entrambi progenitore pertanto sono focalizzati a identificare i fattori mancanti per l'induzione della riprogrammazione a iEPs definitivo.
Per la produzione ottimale di rosso iEP colonie, è fondamentale che le cellule vengono trasdotti con tutti i quattro vettori e GTL geni sono espressi ad alti livelli. Purtroppo il metodo attualmente più efficiente non consente un controllo preventivo dei titoli di vettore. Un tentativo di migliorare l'efficienza mediante vettori lentivirali sialophosphoprotein non è riuscito, probabilmente a causa di problemi con stechiometria inferiore o i livelli di espressione insufficiente. Mentre sta lavorando per migliorare la riprogrammazione vettori, i resti di metodo più efficienti utilizzando combinazioni di appena prodotto surnatante di vettore con i vettori retrovirali precedentemente descritti esprimendo un solo fattore e nessun gene marcatore di selezione.
GTLM riprogrammazione a iEPs è l'unico protocollo segnalato in grado di produrre eritroidi progenitrici-come le cellule da una cellula somatica impegnata. Come un metodo di ricerca strumento DLR iEP pertanto presenta parecchi vantaggi sopra altri degli eritrociti delle cellule sistemi modello come HiDEPs/HuDEP cellule di cellula eritroide (PMID: 23533656)17. Mentre le cellule HiDEPs/HuDEP sono strumenti più conveniente per la produzione su larga scala dell'eritrocito e valutare la funzione del gene durante terminale eritropoiesi, il vantaggio unico di GTLM riprogrammazione a iEPs è la possibilità di studiare direttamente del nucleo programmi trascrizionali determinazione di destino delle cellule degli eritrociti. GTLM riprogrammazione fornisce una piattaforma di valore inestimabile per studiare entrambi eritropoiesi negli esseri umani e del mouse, ad esempio, per studiare il passaggio tra la eritropoiesi primitivo e definitiva. La comprensione di questo interruttore è di enorme interesse per il trattamento potenziale di emoglobinopatie, come Anemia falciforme, in cui i ricercatori si sforzano di invertire l'interruttore negli adulti di emoglobina fetale ad alleviare la malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse al rapporto.
Acknowledgments
Ringraziamo Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) per la clonazione e Harvey Lodish (Whitehead Institute) per fornire molti dei plasmidi utilizzati per generare la libreria retrovirale. Ringraziamo Riccardo Siva e Sofie Singbrant (dipartimento di medicina molecolare e Gene Therapy, Università di Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (dipartimento di ematologia molecolare, Università di Lund) per i loro ruoli nella descrizione della produzione iEP. Inoltre vorremmo citare e ringraziare Julian Pulecio (centro di medicina rigenerativa, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Istituto di ricerca medica di St. Vincent e Dipartimento di medicina, ospedale di St Vincent, Università di Melbourne), Ángel Raya (Istituto Catalano per la ricerca e studi avanzati, Barcellona) e Vijay G. Sankaran (Broad Institute del Massachusetts Institute of Technology e Harvard, Cambridge ) per i loro contributi precedenti a questo lavoro. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Söderberg Ragnar (di J.F.); la svedese di ricerca Consiglio (di J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (di J.F.); la Fondazione svedese per la ricerca strategica (a J.F.); Fondazione di Åke Wiberg (di J.F.); una borsa Marie Curie di integrazione (di J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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