Summary
Nous présentons notre protocole pour produire induit progéniteurs érythroïdes (PFE) de fibroblastes adultes de souris à l’aide axée sur le facteur de transcription directement lignée reprogrammation (DLR).
Abstract
Différenciation et l’engagement de cellules érythroïdes procèdent grâce à l’activation d’un réseau transcriptionnel restreints lignée orchestrée par un groupe du sort de la cellule déterminant et facteurs de maturation. Nous avons précédemment énoncés pour définir l’ensemble minimal des facteurs nécessaires pour instruire les globules rouges de développement à l’aide de lignée directe reprogrammation des fibroblastes en progéniteurs/précurseurs érythroïdes induite (PFE). Nous avons montré que la surexpression de Gata1, Tal1 Lmo2et c-Myc (GTLM) peuvent rapidement convertir murins et humains fibroblastes directement aux PFE qui ressemblent à des cellules érythroïdes bona fide en termes de morphologie, phénotype, et l’expression des gènes. Nous avons l’intention que les PEI fournira un outil précieux pour étudier l’érythropoïèse et cellule de régulation sort. Nous décrivons ici le processus progressif de transformer les fibroblastes pointe queue murine PEI via transcription axés sur le facteur lignée directe reprogrammation (DLR). Dans cet exemple, nous effectuons la reprogrammation dans les fibroblastes de souris de traçage lignée érythroïde qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP) sous le contrôle du promoteur du gène (EpoR) érythropoïétine récepteur, permettant la visualisation des cellules érythroïdes induction de sort à la reprogrammation. Suite à ce protocole, les fibroblastes peuvent être reprogrammées en PEI dans les cinq à huit jours.
Tandis que les améliorations peuvent encore être apportées au processus, nous montrons qu’induite par le GTLM reprogrammation est un processus rapid et direct, ce qui donne des cellules avec des propriétés de bona fide cellules progénitrices et précurseurs érythroïdes.
Introduction
Globules rouges (hématies) sont essentiels chez tous les vertébrés et représentent 84 % de toutes les cellules du corps humain1. D’embryonnaire à l’âge adulte, notre santé est fortement tributaire de réglage exact de l’homéostasie de la RBC. La production continue des hématies matures au cours du développement à l’âge adulte est connue comme l’érythropoïèse. Un défi majeur dans la recherche de l’érythropoïèse est de définir les régulateurs maîtres qu’orchestrent le développement de RBC et le commutateur entre érythropoïèse primitive et définitive. Reprogrammation de la lignée directe des progéniteurs érythroïdes présente une opportunité de mieux comprendre érythroïdes développement in vivo.
Lignée directe reprogrammation (DLR), aussi appelé transdifférenciation, est le processus de reprogrammation d’un type de cellule directement dans une autre, contournant pluripotentes et stades de souches multipotentes. DLR a jusqu'à présent été utilisé pour produire de nombreux types de cellules, y compris les neurones2, hématopoïétiques3,4,5, hépatique6 et néphrotique7, cellules progénitrices. Pour les biologistes du développement, DLR est devenu un outil important pour les aspects interrogation d’engagement de la lignée et les processus de différenciation terminale8,9. DLR peut compléter et remplacer partiellement les études in vivo pour la compréhension des mécanismes du destin cellulaire durant le développement des facteurs déterminants. Le protocole DLR de reprogrammation de progéniteurs érythroïdes décrites dans le présent document fournit le champ une méthode gratuite pour les études sur le développement de l’érythropoïèse.
Nous avons démontré précédemment que la surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux progéniteurs érythroïdes induite (PFE) 10. les cellules érythroïdes le GTLM-reprogrammé grandement ressemblent à des progéniteurs érythroïdes primitives bona fide en termes de morphologie, phénotype et gene expression10. Ainsi les PEI ont limité la capacité de prolifération et mature aux érythrocytes nucléés semblables à ceux produits transitoirement dans l’embryon précoce avant l’apparition de l’érythropoïèse définitif. Par des changements dans les conditions de reprogrammation (p. ex., les mutations ponctuelles dans la reprogrammation des facteurs ou l’ajout d’autres facteurs), on peut comprendre comment ceci mène aux changements érythroïdes développement et différenciation. Nous avons montré par exemple qu’Ajout de Klf1 ou Myb au cocktail GTLM passe au modèle d’expression globine de principalement embryonnaire (primitive) à principalement adulte (définitif). Cette constatation confirme la validité de l’utilisation de DLR comme un outil pour définir les facteurs du développement de l’érythropoïèse.
Ici, nous décrivons le processus de génération de PFE de fibroblastes de souris queue astuce (TTF). Dans nos résultats représentatifs, nous avons effectué la reprogrammation sur les fibroblastes des souris de lignée-traçage érythroïdes (Epor- Cre R26- eYFP) qui expriment la protéine fluorescente jaune (eYFP) du locus Rosa26 dans toutes les cellules qui ont exprimé le récepteur de l’érythropoïétine, ce qui permet de faciliter la visualisation de l’engagement à la lignée érythroïde. En utilisant cette méthode, les cellules positives (EpoR +) YFP sont présents dès que cinq jours après la transduction. Ce protocole, par conséquent, propose une technique rapide et robuste pour la génération de progéniteurs érythroïdes in vitro.
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Protocol
1. la création et l’entretien de queue de souris primaire astuce Cultures de fibroblastes
- Préparer des plats enduit de gélatine (recommande un plat de 10 cm pour une queue) en recouvrant la surface avec de la gélatine de 0,1 % et en incubant les plats pendant environ 20 min à 37 ° C. Aspirer la solution de gélatine du plat et laisser sécher pendant au moins 2 h.
- Euthanasier les souris par dislocation cervicale. Enlever la queue avec des ciseaux, coupant à la base de la queue. Mettre la queue dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) avec 2 % sérum fœtal (SVF) jusqu'à utilisation.
Remarque : Pour des résultats optimaux, queues doit être prélevé souris environ 6 à 8 semaines d’âge. Queue peut être pris des souris âgées de 8 semaines d’âge, cependant, comme l’âge de la souris, la capacité de prolifération des fibroblastes et l’efficacité de la reprogrammation diminution11. - Effectuez toutes les étapes subséquentes du présent protocole dans une hotte de culture de tissus dans des conditions stériles. Préparer une solution de trypsine dilué de 0,02 % trypsine-EDTA au SPD et ajouter 5 mL dans un plat non revêtus de 10 cm.
- Laver la queue, tout d’abord dans l’éthanol à 70 %, puis au SPD. Dans un plat, placer la queue plate et utiliser des pinces pour maintenir en place. Faites une incision sur la queue le long de son axe longitudinal de la base jusqu'à la pointe.
- Saisir la queue avec une paire de pinces et maintenez-le verticalement. En utilisant une deuxième paire de pinces, saisissez la peau à côté de l’incision à la base de la queue et il peler. Pour ce faire sur les deux côtés de l’incision jusqu'à ce que la peau peut être décollée en tirant vers le bas vers l’extrémité de la queue.
- Maintenez la queue Pelée avec une pince sur le plat contenant la solution de trypsine et couper la queue en morceaux d’environ 1 cm de long. Avec les morceaux de queue dans la solution de trypsine, utiliser des ciseaux à fragmenter les morceaux en petits morceaux. Incuber les morceaux de queue dans la solution de trypsine à 37 ° C pendant 10 min.
NOTE : Plus les morceaux sont préférables afin de fournir à chaque pièce une surface importante au rapport de volume. - Étancher la trypsine à l’aide de 2 volumes de fibroblastes expansion (FEX) milieu (milieu de la Eagle modifié d’haute-glucose Dulbecco (DMEM) avec 15 % FBS, 2 mM de L-glutamine, des acides aminés Non essentiels (NEAA) et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine).
- Recueillir l’intégralité du contenu de la capsule dans un tube de 50 mL et centrifuger à 350 × g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les fragments de queue dans 10 mL de milieu frais de FEX.
- Transférer des fragments de queue en moyenne dans un plat enduit de gélatine et laisser incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 4 % O2, ajout d’un milieu FEX frais tous les 2 jours.
Remarque : Après cinq à sept jours, des fragments de queue ont attaché au fond du plat et fibroblastes peuvent être vus à l’éloigne d’eux. - Une fois que les grappes de fibroblastes sont repérés, agiter doucement le plat pour déloger les morceaux de queue et aspirer le milieu et tous les fragments d’OS laissant les fibroblastes fixés à la plaque. Ajouter nouveau média FEX et culture de fibroblastes jusqu’au confluent.
- Pour ne garantir aucune contamination des fibroblastes de progéniteurs hématopoïétiques, dissocier les cellules de la plaque à l’aide de 1 x trypsine-EDTA pendant 5 minutes et prélever des cellules. Appauvrissent pour les cellules expriment des marqueurs hématopoïétiques (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 et Ter-119) à l’aide d’un système de séparation magnétique10.
2. rétrovirus Production
- Cellules d’emballage retroviral à environ 2,5 × 104 cellules/cm2 (2,0 × 106 cellules pour un plat de 10 cm) sur un plat de culture de tissus traités (par vide-gaz plasma) et de la culture pendant la nuit en haute-glucose DMEM avec 10 % de graines FBS, 10 mM de Sodium Le pyruvate et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Le lendemain matin, remplacez le milieu DMEM sans additif à l’aide de la moitié du volume utilisé pour la culture du jour au lendemain (5 mL pour un plat de 10 cm). Dans l’après-midi, vérifiez que les cellules sont de 70 à 80 % anastomosé et commencent la transfection.
- Pour chaque facteur de reprogrammation, Gata1, Tal1, Lmo2et c-Myc, préparer un mélange de 2:1 du vecteur d’expression (pMX) et vecteur d’assistance (contenant des gènes gag et pol). Pour un plat de 10 cm des fibroblastes, utilisez 6 µg de vecteur d’expression et 3 µg de vecteur d’assistance dans un volume final de 100 µL de milieu DMEM.
- Pour chaque facteur de reprogrammation, préparer 300 µL de la température ambiante (RT) DMEM dans un tube stérile de polystyrène et ajouter avec précaution 27 µL de réactif de transfection commerciale.
Remarque : Le réactif de transfection devrait être ramené à RT avant utilisation et doit être ajouté directement dans le milieu, comme les propriétés électrostatiques du composé peuvent faire collent à la paroi en plastique du tube. - Ajouter le mélange de plasmide dans le tube contenant du réactif de transfection, vortex brièvement et incuber le mélange réactif-ADN de transfection à RT. brièvement vortex le mélange pendant 15 minutes et ajouter goutte à goutte aux cellules emballage retroviral afin que la transfection mélange réactif-ADN est uniformément répartie sur la culture et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- 24h après la transfection, modifier le milieu DMEM avec 20 % FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine. 48 h après la transfection, recueillir le surnageant et filtrer à travers un filtre de seringue de pores de 0,22 µm.
Remarque : Les surnageants virales peuvent être congelés à-80 ° C et gardés jusqu'à leur utilisation, bien que la transduction est plus efficace si frais surnageant viral est utilisé.
3. GTLM transduction et récolte de l’iEP
- Graine de la queue astuce fibroblastes à 1 × 104 cellules/cm2 sur 0,1 % de gélatine préalablement enduit la vaisselle dans un milieu FEX et incuber à 37 ° C pendant 24 h.
- Le lendemain, préparer un mélange de transduction comme suit.
- Ajouter 1 volume de surnageant viral pour chaque facteur reprogrammation additionné de 4 µg/mL de réactif de l’infection rétrovirale (40 %) à 6 volumes de FEX milieu (60 %).
- Pour un plat de 10 cm des fibroblastes, ajouter 1 mL de chaque surnageant viral (4 × virus = 4 mL) additionné de 4 µg/mL de réactif de l’infection rétrovirale à 6 mL de milieu FEX, donnant un total de 10 mL d’un mélange transduction.
- Aspirer le milieu FEX de la culture de fibroblastes et remplacez-le par le mélange de transduction. Incuber la transduction de 4 h à 37 ° C dans des conditions d’hypoxie (5 % de CO2 et 4 % O2).
- Aspirer le mélange de transduction et remplacez-le par un milieu frais reprogrammation (milieu sans sérum Expansion (SFEM), 100 U/Mldepénicilline/streptomycine, 100 ng/mL murine Stem Cell Factor (mSCF), 10 ng/mL murine interleukine-3 (IL3), recombinant humain de 2 U/mL Érythropoïétine (hrEPO) et 100 nM dexaméthasone).
- Incuber pendant 8 daysat 37 ° C dans des conditions d’hypoxie, ajoutant un milieu reprogrammation frais tous les 2 jours. Après cinq à huit jours, reprogrammation réussie donnera l’amas de cellules qui ont détaché de la plaque.
- Pour prélever des cellules reprogrammés pour analyse, pipetez doucement monter et descendre pour leur récolte directement à partir de la capsule. Pour récolter des fibroblastes untransduced à titre de comparaison, dissocier les cellules de la plaque à l’aide de 1 x trypsine-EDTA et de percevoir.
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Representative Results
Nous présentons ici un protocole reproductible pour la production de PFE de fibroblastes adultes à l’aide de DLR pilotée par facteur de transcription. Nous évaluons la reprogrammation de cellules à l’aide de la cytométrie en flux, formatrices dosages et gène analyse de l’expression. Afin d’aider à la visualisation de la conversion au destin des cellules érythroïdes, nous avons effectué la reprogrammation sur les fibroblastes des souris de lignée-traçage érythroïdes (Epor- Cre R26- eYFP) qui expriment la protéine fluorescente jaune (eYFP) du locus Rosa26 dans toutes les cellules qui expriment le récepteur de l’érythropoïétine (Epor, Cre frappé dans un allèle du locus Epor endogène) transcription à n’importe quel stade de leur développement12,13 ( Figure 1A). Après que reprogrammation réussie d’induit des progéniteurs érythroïdes, YFP positive (EpoR +) des cellules sont observables dès que cinq jours après la transduction. Jour 5 de reprogrammation, les cellules deviennent ronds, soulever la surface de la plaque et commencent à former des grappes. Jour 5-PEI affichent une morphologie comme précurseurs érythroïdes, qui disposent d’un noyau central caractéristique, la chromatine grosse et cytoplasme bleu après May-Grünwald-Giemsa coloration (Figure 1C). Hemoglobinization de certaines cellules est évidente par la coloration de la benzidine positive et un aspect légèrement rouge quand même (Figure 1-E). En outre, une petite fraction de journée 5-PEI express co YFP et le marqueur de surface érythroïdes spécifiques Ter119 (Figure 1F). Jour 8, grands clusters YFP + peuvent être vu. Jour 8iEPs présentent un phénotype érythroïdes plus différencié que 5 jour PEI ; Ils sont sensiblement plus petites, ont accumulé plus d’hémoglobine et montrent aussi significativement augmentée expression de Ter119 (Figure 1 b–1 G). Cyto-tours de jour 8-PEI révèlent morphologie érythroïdes, tandis que très peu de réticulocytes énucléés sont observés (Figure 1H).
Analyse de l’expression génique par quantitative polymerase chain reaction (qPCR) de PEI en vrac prélevés à jour 8 montre qu’ils ont presque arrêt expression des gènes de fibroblastes et sont surexprimés nombreux gènes érythroïdes, y compris les gènes de globine, principalement exprimant des types embryonnaires (Figure 1j’ai). Pour déterminer si les cellules reprogrammés de transition par le biais de cellules souches multipotentes, nous avons effectué une évolution temporelle et analysé l’expression des marqueurs hématopoïétiques tout au long de la reprogrammation. Nous avons déjà indiqué que sortie de précurseurs érythroïdes était plus élevé au jour 6, suivi par jour 8, avec 10,5 % ± 4,6 % et 6,6 % ± 0,5 % de co exprimant CD71 et Ter119, respectivement10YFP + cellules vivantes. Il y a également une population de cellules CD41 avant l’apparition des cellules positives Ter119. C-kit, ni CD45 marqueurs, qui sont généralement exprimés dans les cellules souches hématopoïétiques et réprimés dans l’érythropoïèse, sont exprimés en un point quelconque dans la reprogrammation (Figure 1J). Ces données suggèrent que les cellules ne vont pas à travers un progéniteurs hématopoïétiques multipotentes ou plus tôt, si faire peut-être la transition à travers un progéniteur mégacaryocyte-érythroïdes.
Un moyen fiable pour évaluer l’efficacité de la reprogrammation consiste à effectuer des essais de formatrices BFU-E sur les cellules reprogrammés. Capacité de différenciation in vitro des jour 5 - jour 8-PEI a été mesurée chez méthylcellulose additionné d’érythropoïétine humaine, facteur des cellules souches murines et dexaméthasone. Après 8 jours, Pei a formé deux types de colonies : distinctement rouge (rouge iEP) et non-visible rouge (iEP non rouge). Tandis que les cellules provenant de colonies rouges affichent morphologie érythroblaste, cellules de colonies non rouge ne pas ressembler à des cellules érythroïdes et ont été irrégulières, avaient grand cytoplasme bleu profond et granulaire (Figure 2A).
Des journée 5-PEI, environ 1 à 1 000 formaient des colonies rouges, tandis que seulement environ 1/10 000 jour 8-PEI ont formé des colonies rouges, avec un ratio beaucoup plus élevé de colonies non rouge formé (Figure 2B). Cette réduction de formatrices capacité entre jour 5 et jour 8-PEI pourrait être expliqué byiEPs en cours de différenciation de jours 5-8 et les vecteurs d’expression GTLM souffrant silencieux au fil du temps. qPCR analyse a confirmé que l’expression de la transcription exogène diminue de manière significative de 5 à 8 jours. Comme prévu dans la reprogrammation réussie, les niveaux d’expression endogène Gata1 Tal1, Lmo2et c-Myc sont induits, cependant, endogène Lmo2 expression est seulement très humbles expresse (Figure 2C).
Un point de la note et une limitation de l’essai, sont que les colonies non rouge contenant des cellules de type macrophages dépassent en nombre les colonies rouges iEP hemoglobinized formés par les fibroblastes reprogrammés en formant des colonies des essais. Formatrices la possibilité de créer des colonies de l’iEP rouge peut être améliorée en changeant les rapports stoechiométriques de facteurs GTLM. Transduction les cellules avec le double des vecteurs d’expression Tal1 et Lmo2 a conduit à une légère augmentation du ratio de colonies rouges sur colonies non rouge, tandis que supplémentaire Gata1 a conduit à une augmentation significative de la formation de colonies rouges et presque une élimination complète des colonies non rouge soutenant le rôle important de ces facteurs dans l’érythropoïèse (Figure 2D). Fait intéressant, augmentant l’expression de c-Myc considérablement augmente la production de colonies non rouge bien qu’il soit indispensable pour la reprogrammation. Pour obtenir des progéniteurs érythroïdes induite pur pour analyse en aval, les colonies peuvent être isolés dans les dosages de formatrices. Nous avons effectué analyse d’expression de gène sous forme de puces sur rouge et colonies non rouge du jour 5-PFE et 14,5 jours post coït foie fœtal (dpc) (FL) et la moelle osseuse adulte (BM) à titre de comparaison. Les données microarray sont accessibles par le biais de NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) : GSE73344. Nous avons déjà montré que rouge-iEP colonies ressemblent à des colonies érythroïdes de bona fide (FL et BM) par gene expression10. Examen de l’expression de Gata1, Tal1, Lmo2 et c-Myc dans chaque colonie montre que, alors que les colonies rouges montrent des niveaux d’expression de tous les quatre facteurs similaires à FL et BM, non rouge colonies ont une expression inférieure de tous les facteurs, en particulier Gata1 (Figure 2E). Pour comprendre ce que les colonies non rouge contenant des cellules de type macrophages sont, nous avons étudié l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire dans chaque type de colonie à partir des données de microarray. Comme indiqué précédemment, les colonies rouges expriment de nombreux gènes érythroïdes spécifiques, semblables à celle des FL et BM. Après réexamen des données, il est clair que les colonies non rouge montrent la forte expression de plusieurs gènes caractéristique des macrophages cellules14 (Figure 2F). Colonies ni rouges ni non rouge montrent une augmentation significative expression typique mégacaryocyte gènes15. Ensemble, ces résultats suggèrent que les colonies non rouge ressemblent plus aux macrophages que les érythrocytes. Puisque les colonies non rouge ne sont jamais observés lorsque l’un des facteurs GTLM sont retirés ces cellules macrophages semblent se former lorsque les niveaux d’expression d’un ou plusieurs des facteurs reprogrammation Gata1, Tal1, Lmo2 sont inférieurs requis pour la reprogrammation aux PFE. Ensemble, cela suggère que les niveaux d’expression de tous les quatre facteurs GTLM sont importantes en TTF pour iEP reprogrammation et que l’hétérogénéité s’explique par la reprogrammation incomplète des cellules individuelles, ce qui peuvent potentiellement être corrigés en ajustant rapports stoechiométriques.
Afin d’évaluer l’efficacité et la robustesse de notre protocole, nous avons testé la capacité de régler nombre de fibroblastes pour produire des grappes visibles des cellules iEP après 5 jours lorsqu’il est cultivé en plaques 384 puits. Nous avons déterminé que hors 24 transductions de 20, 30, 40 et 50 éléments techniques, le nombre de puits au moins un iEP cluster 3 (0,6 % des fibroblastes de plaques), 15 (2,0 % des fibroblastes de plaques), 15 (1,6 % des fibroblastes de plaques) et 13 (1,1 % des fibroblastes de plaques) , respectivement. Ceci suggère que Justine iEP reprogrammation est un processus fiable et robuste qui peut atteindre un rendement de 1 %.
Autres facteurs qui peuvent affecter l’efficacité de la reprogrammation comprennent le nombre de passage de fibroblastes et les conditions de culture. Nous avons comparé l’efficacité de reprogrammation des thématiques qui avaient été repiquées trois fois ou neuf fois avant la transduction. Les éléments techniques qui ont été repiquées neuf fois (P9) a montré une réduction spectaculaire de la capacité à produire des grappes de PFE (Figure 3A). Fait intéressant, inclusion de sérum dans les médias reprogrammation complètement blocs reprogrammation, remplaçant sérum avec érythroïdes cytokines sont nécessaires pour permettre les facteurs transduits à conduire le nouveau sort de cellule sans signaux composées du sérum. Enlèvement du sérum et l’expression de nouveaux facteurs au sein de la cellule sont susceptibles d’être stressant sur les cellules. En effet, bloquant l’activation de p53 considérablement augmenté le nombre de PFE générée. Cet effet peut également être vu dans reprogrammation des fibroblastes de knockout p53 (Figure 3B-D). Inhibition de p53 signalisation mène à plus survie et mieux la reprogrammation des cellules et est une méthode validée pour améliorer le rendement. Enfin, la reprogrammation dans des conditions d’hypoxie est favorable mais pas vital pour la production de l’iEP. Cependant, cultivées en normoxie transduits thématiques sont beaucoup plus lents à reprogrammer et iEP grappes sont observés après 10 jours au lieu de cinq à huit jours (Figure 3E).
Figure 1 : Expression forcée de Gata1, Tal1 Lmo2et c-Myc reprogramme les fibroblastes murins adultes dans des progéniteurs érythroïdes qui présentent des propriétés des cellules érythroïdes bona fide . (A) protocole expérimental pour la transcription médiée par les facteurs reprogrammation du reporter érythroïdes (Epor-Cre R26-eYFP) queue astuce fibroblastes (TTF) aux cellules reprogrammées EpoR +. (B–F) Temps de parcours des iEP génération d’untransduced thématiques (jour 0) et en vrac GTLM-transduites thématiques 5 et 8 jours (représentatif de n = 2-3). Transdifférenciation a été évaluée par des images de cellules vivantes, lumineux-zone (B) , de puits unique (échelle bar, 50 µm) ; (C) - Giemsa de May-Grünwald coloration cyto-spin (barre d’échelle, 20 µm) ; (D) la Benzidine/coloration au Giemsa cyto-spin (barre d’échelle, 20 µm) ; Macroscopique (E) de pellets de cellule ; et cytométrie en flux représentatif (F) des parcelles montrant YFP / expression Ter119. (G) diamètre de la cellule de PEI récoltées les jours 5 et 8 mesurée à partir de plusieurs diapositives cyto-spin, montrant une diminution de la taille des cellules le jour 8. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 21-25) ; p ≤ 0,0001 par non apparié t-test. (H) représentant la benzidine/Giemsa à haute résolution des images de GTLM-transduites thématiques le jour 8. Echelle, 5 µm. (I) l’expression des gènes spécifiques pertinentes des fibroblastes et érythroïdes incluant les gènes de la globine en untransduced les éléments techniques (colonnes gris) versus vrac GTLM-transduites thématiques (colonnes rouge) le jour 8, déterminées par qPCR ARNm Relative. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 4-6 pour les PEI, n = 2 pour les éléments techniques untransduced). (J) graphique montrant la synthèse de l’analyse en cytométrie de flux temps flux d’untransduced TTF (jour 0) et en vrac TTF GTLM-transduites récolté au jour 2, 4, 6 et 8 montrant expression YFP, CD45, CD71 et Ter119 (n = 3). Les données sont présentées comme moyenne ± SD. Figure est une adaptation de Capellera-Garcia S, et al. 10. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : PEI GTLM produisent des colonies rouges et non rouge lors d’essais de colonie BFU-E. (A) images représentant cytospin lumineux-zone et May-Grünwald-Giemsa de dérivés iEP rouge et non rouge colonies. Bars, 50 µm (images de la colonie) et 10 µm (images de cyto-spin) de l’échelle. (B) les comptages de colonies produits des thématiques untransduced plaqués en bloc J5 PEI et en vrac jour 8. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 3) ; p ≤ 0,0005 ; p ≤ 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle. (C) expression de l’ARNm Relative de Gata1, Tal1, Lmo2 et c-Myc dans untransduced TTF et vrac GTLM-transduites TTF récoltée à jours 5 et 8, déterminée par qPCR. Amorces ont été conçues de sorte qu’expression endogène peut être distinguée de l’expression totale. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 4-6 pour les PEI, n = 2 pour untransduced TTF). (D) générés à partir des comptages de colonies plaqué untransduced thématiques et en vrac jour 5 PEI générés par un doublement du taux de chacun des facteurs GTLM. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 3) ; * p ≤ 0,001 ; p ≤ 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle. (E) expression Relative de Gata1, Tal1, Lmo2 et c-Myc dans les fibroblastes untransduced et cueillies colonies provenant GTLM-transduites PEI (rouges et non rouge), 14,5 dpc foie fœtal et osseuse adulte moelle, déterminée par microarray. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type ; * p ≤ 0,05 ; * p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005 ; p ≤ 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle. (F) Relative expression de certains gènes connus pour leur expression érythroïdes (en haut), mégacaryocyte (au milieu) et macrophages des cellules (en bas) dans les fibroblastes untransduced et cueillies colonies produits des PFE GTLM-transduites (rouge et non rouge), 14.5dpc le foie fœtal et la moelle osseuse adulte, déterminée par microarray. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type ; * p ≤ 0,05 ; * p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005 ; p ≤ 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle. Est une adaptation de Capellera-Garcia S, et al. 10. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : GTLM reprogrammation est un processus fiable et robuste. (A) graphique du nombre de clusters observée de 10 000 éléments techniques et photos représentant le jour 5 de GTLM reprogrammation des fibroblastes de bout de queue (TTF) qui ont subi trois passages (P3) ou neuf passages (P9) avant la reprogrammation. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 6) ; barreaux de l’échelle est 50 µm. (B–D) photos représentatives des iEP clusters 6 jours après (B) GTLM reprogrammation des fibroblastes de queue de pointe ; (C) GTLM reprogrammation des thématiques avec addition de vecteur d’expression de p53DN ; (D) GTLM reprogrammation de p53 knockout thématiques (échelle bars = 50 µm). Photos représentant (E) des grappes d’iEP après 10 jours de GTLM reprogrammation effectuée à des conditions normoxiques (barre d’échelle = 50 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux PFÉ10. Les cellules érythroïdes reprogrammé ressemblait beaucoup aux progéniteurs érythroïdes bona fide en ce qui concerne la morphologie, phénotype, expression génique et capacité de formatrices. Cette constatation corrobore la justification de l’utilisation de reprogrammation directe comme un outil permettant de définir les facteurs du développement dans l’hématopoïèse. Pour appuyer la validité de cette méthode, PEI peuvent également être générées à l’aide d’induction GTLM des fibroblastes embryonnaires de souris et des fibroblastes humains prépuce, montrant que cela fonctionne pour les fibroblastes d’origines différentes et à travers les espèces10. Dans ce rapport, nous induire la reprogrammation des fibroblastes de la souris de traçage lignée érythroïde comme un outil pour visualiser la conversion vers une cellule érythroïde. Utilisation de cette souris est utile mais pas critique au protocole. Régulièrement, nous effectuons reprogrammation en utilisant plusieurs types de fibroblaste de diverses souches de souris et identifier les PEI par expression marqueur de surface cellulaire de Ter119 et CD71.
Notre méthode actuelle génère les PEI qui présentent un phénotype érythroïdes primitives par opposition à un phénotype adult définitif. Une différence majeure entre ces phases de développement est l’expression des gènes de globine différents. Cependant, nous avons montré que l’addition de Klf1 et Myb au modèle d’expression de la PFE changements cocktail GTLM globine principalement embryonnaire à principalement adulte10,,14. Fait intéressant, ajout de Gata2 et Runx1 aux quatre facteurs cocktail et thrombopoïétine dans le milieu biaise le processus de reprogrammation vers la lignée megakaryocytic16.
Le PFE induite par le GTLM produire des progéniteurs érythroïdes avec une signature d’expression de gène primitif et une capacité limitée de prolifération. En outre, les PEI produisent très peu érythrocytes énucléés. L’expansion de progéniteurs érythroïdes pauvres s’explique par l’incapacité à reprogrammer à kit + cellules érythroïdes définitif, qui pourraient potentiellement être atteint grâce à l’ajout d’autres facteurs induisant une reprogrammation directe aux PFE avec une expression de gène définitif programme.
Nos résultats suggèrent aussi efficacité pauvre énucléation s’explique par le fait PEI induite par le GTLM génèrent des précurseurs avec une primitive, plutôt qu’un programme d’expression de gène définitif. Plusieurs tentatives à optimiser les conditions de culture ont été tentés sans amélioration énucléation. Tentatives visant à accroître l’efficacité les deux progéniteurs de prolifération et énucléation visent donc à identifier les facteurs manquants pour induire la reprogrammation aux PFE définitif.
Pour la production optimale de colonies rouges iEP, il est essentiel que les cellules sont transduites avec tous les quatre vecteurs et GTL gènes sont exprimés à des niveaux élevés. Malheureusement la méthode actuellement la plus efficace ne permet pas un contrôle au préalable des titres de vecteur. Une tentative d’améliorer l’efficacité à l’aide de vecteurs lentiviraux bicistronique n’a pas réussie, peut-être en raison de problèmes de stoechiométrie inférieure ou les niveaux d’expression insuffisante. Tandis que les travaux sont en cours pour améliorer la reprogrammation de vecteurs, les restes de méthode plus efficaces en utilisant des combinaisons de fraîchement produit vectoriel surnageant avec les vecteurs rétroviraux décrites précédemment, n'exprimant qu’un seul facteur et aucune gène marqueur de sélection.
GTLM reprogrammation aux PFE est le seul protocole déclaré en mesure de produire des cellules progénitrices érythroïdes d’une cellule somatique engagée. Comme une méthode d’iEP recherche outil le DLR a donc plusieurs avantages par rapport aux autres érythroïdes cellule systèmes modèles tels que la cellule érythroïde lignes des cellules HiDEPs/HuDEP (PMID : 23533656)17. Alors que les cellules HiDEPs/HuDEP sont des outils plus commodes pour la production d’érythrocytes à grande échelle et l’évaluation de la fonction du gène au cours de l’érythropoïèse terminal, l’avantage unique de GTLM reprogrammation aux PFE est la possibilité d’étudier directement du noyau programmes de transcriptionnelles pour le devenir de cellules érythroïdes. GTLM reprogrammation fournit une plate-forme précieuse pour étudier les deux érythropoïèse chez les humains et les souris, par exemple, pour étudier le commutateur entre érythropoïèse primitive et définitive. Comprendre ce commutateur est de grand intérêt pour le traitement potentiel des hémoglobinopathies, telles que l’anémie falciforme, dans lequel les chercheurs s’efforcent renverser le commutateur chez les adultes d’hémoglobine foetale pour atténuer la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts au rapport.
Acknowledgments
Nous remercions Evelyn Wang et Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge (Massachusetts) pour le clonage et Harvey Lodish (Whitehead Institute) fournissant plusieurs des plasmides utilisés pour générer la bibliothèque rétrovirale. Nous remercions Kavitha Siva et Sofie Singbrant (département de médecine moléculaire et Gene Therapy, Université de Lund), Göran Karlsson et Shamit Soneji (département d’hématologie moléculaire, Université de Lund) pour leur rôle dans la description de la production de l’iEP. Nous tenons également à remercier Julian Pulecio (Centre de la médecine régénératrice, Barcelone Biomedical Research Park), Violeta rayonne-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Institut de recherche médicale de St. Vincent et Département de médecine, hôpital St Vincent, Université de Melbourne), Ángel Raya (Institution catalane pour la recherche et des études supérieures, Barcelone) et Vijay G. Sankaran (Broad Institute de la Massachusetts Institute of Technology et Harvard, Cambridge ) pour leurs contributions antérieures à ce travail. Ce travail a été soutenu par la fondation de Söderberg de Ragnar (à J.F.) ; les Suédois Research Council (à J.F.) ; Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (à J.F.) ; la fondation suédoise pour la recherche stratégique (à J.F.) ; Fondation de Åke Wiberg (à J.F.) ; une subvention de l’intégration de Marie Curie (à J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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