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Developmental Biology

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

doi: 10.3791/58464 Published: December 14, 2018

Summary

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Abstract

Erythroiden Zelle Engagement und Differenzierung fahren Sie durch Aktivierung eines Linie beschränkt transkriptionelle Netzwerks orchestriert von einer Gruppe von Zellen Schicksal bestimmen und Reifung Faktoren. Wir wollten früher minimalen Voraussetzungen für die Instruktion der roten Blutkörperchen Entwicklung mit direkten Abstammung Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte erythroiden Vorläuferzellen/Vorstufen (iEPs) definieren. Wir haben gezeigt, dass Überexpression des Gata1, Tal1, Lmo2und c-Myc (GTLM) können schnell konvertieren murinen und menschlichen Fibroblasten direkt zu iEPs, die Bona Fide erythroiden Zellen im Hinblick auf Morphologie, ähneln Phänotyp, und Genexpression. Wir beabsichtigen, dass iEPs ein wertvolles Instrument zur Regulierung der Erythropoese und Zelle Schicksal zu studieren liefern. Hier beschreiben wir den schrittweisen Prozess der Umwandlung murinen Schweif Tipp Fibroblasten in iEPs über Transkription Faktor-driven direkten Abstammung Neuprogrammierung (DLR). In diesem Beispiel führen wir die Umprogrammierung in Fibroblasten von erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse, die das gelbe fluoreszierende Protein (YFP) unter der Kontrolle der Erythropoietin-Rezeptor gen (EpoR) Promotor, ermöglicht die Visualisierung der erythroiden Zelle ausdrücken Schicksal Induktion bei der Umprogrammierung. Nach diesem Protokoll können innerhalb von fünf bis acht Tagen Fibroblasten in iEPs umprogrammiert werden.

Während noch der Prozess verbessert werden kann, zeigen wir, dass Umprogrammierung GTLM vermittelt einen schnellen und direkten Prozess nachgeben Zellen mit Eigenschaften der Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen und Vorläufer Zellen.

Introduction

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Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sind unverzichtbar bei allen Wirbeltieren und 84 % aller Zellen des menschlichen Körpers1ausmachen. Aus embryonalen ins Erwachsenenleben hängt unsere Gesundheit stark genaue Regelung der RBC Homöostase. Die laufende Produktion der Reifen Erythrozyten während der gesamten Entwicklung bis ins Erwachsenenalter wird als Erythropoese bezeichnet. Eine große Herausforderung in der Erythropoese Forschung ist die master Regler definieren, die RBC-Entwicklung und der Wechsel zwischen primitiven und endgültige Erythropoese zu orchestrieren. Direkte Linie Umprogrammierung der erythroiden Vorläuferzellen bietet die Möglichkeit, weitere erythroiden Entwicklung in Vivozu verstehen.

Direkte Linie Neuprogrammierung (DLR), auch bekannt als Transdifferenzierung, ist der Prozess der Umprogrammierung ein Zelltyp direkt ineinander pluripotenten und multipotenten Vorläuferzellen Phasen umgehen. DLR wurde bisher zur zahlreichen Zelltypen, einschließlich neural2, hämatopoetischen3,4,5, hepatische6 und nephrotisches7, Vorläuferzellen zu produzieren. Für Entwicklungs Biologen geworden DLR ein wichtiges Instrument zur abfragenden Aspekte der Linie Engagement und terminal Differenzierung Prozesse8,9. DLR ergänzen und teilweise ersetzen in Vivo Studien für Verständnis Mechanismen der Zelle Schicksal bestimmenden Faktoren bei der Entwicklung. Das DLR-Protokoll für die Umprogrammierung zu erythroiden Vorläuferzellen, die in diesem Dokument beschriebenen bietet Bereich eine kostenlose Methode für Studien der Erythropoese.

Wir haben bereits gezeigt, dass Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ausreichend reprogram murine und menschlichen Fibroblasten direkt an induzierte erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) 10. the GTLM umprogrammiert erythroiden Zellen ähneln stark Bona Fide primitive erythroiden Vorläuferzellen im Hinblick auf Morphologie, Phänotyp und gen Ausdruck10. So iEPs haben eine begrenzte Verbreitung Kapazität und Reifen zu kernhaltigen Erythrozyten ähnlich vorübergehend im frühen Embryo vor Beginn der endgültigen Erythropoese. Durch Änderungen in der Neuprogrammierung Bedingungen (z. B. Punktmutationen in Umprogrammierung Faktoren oder Zugabe von anderen Faktoren), kann man verstehen, wie dies zu Veränderungen in der erythroiden Entwicklung und Differenzierung führt. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass die Zugabe von Klf1 oder Myb GTLM Cocktail das Globin Expressionsmuster von überwiegend embryonalen (primitiv) verändert, vor allem Erwachsene (definitive). Dieser Befund bestätigt die Gültigkeit der mit DLR als Werkzeug zur Definition Entwicklungsfaktoren im Erythropoese.

Hier beschreiben wir den Prozess iEPs aus Maus Schweif Tipp Fibroblasten (TTF) zu erzeugen. In unseren repräsentativen Ergebnissen führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26- eYFP) Zellen, die das gelbe fluoreszierende Protein (eYFP) aus den Rosa26 Locus in allen Ausdrücken den Erythropoietin-Rezeptor, ermöglicht einfache Visualisierung des Engagements für die erythroiden Linie ausgedrückt haben. Mit dieser Methode sind bereits fünf Tage nach Transduktion YFP positivere (EpoR +) Zellen vorhanden. Dieses Protokoll bietet daher eine schnelle und robuste Technik für die Generation der erythroiden Vorläuferzellen in Vitro.

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Protocol

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1. Aufbau und die Pflege der primäre Maustaste Tail Tip Fibroblast Kulturen

  1. Bereiten Sie Gelatine beschichtet Gerichte (empfehlen einen 10 cm Teller für ein Tail) durch Abdecken der Oberfläche mit 0,1 % Gelatine und Inkubation der Gerichte für ca. 20 min bei 37 ° C. Aspirieren Sie die Gelatine-Lösung aus der Schale und mindestens 2 Stunden trocknen lassen.
  2. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern. Entfernen Sie die Rute mit einer Schere, Schnitt an der Unterseite der Rute. Setzen Sie die Rute in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS) erst unmittelbar vor Gebrauch.
    Hinweis: Für die besten Ergebnisse sollten Schwänzen Mäuse ca. 6 bis 8 Wochen Alter entnommen werden. Endstücke können Mäuse älter als 8 Wochen alt, aber als die Mäuse-Alter, die Verbreitung der Fibroblasten und die Effizienz der Neuprogrammierung Abnahme11entnommen werden.
  3. Führen Sie alle Schritte dieses Protokolls in einer Gewebekultur Kapuze unter sterilen Bedingungen. Bereiten Sie eine verdünnte Trypsin-Lösung von 0,02 % Trypsin-EDTA in DPBS und 5 mL in einer unbeschichteten 10 cm Schüssel.
  4. Waschen Sie den Schweif, zuerst in 70 % igem Ethanol, dann in DPBS. Legen Sie in eine Schüssel die Rute flach und verwenden Sie Zange, um ihn zu fixieren. Machen Sie einen Schnitt an der Rute entlang seiner Längsachse von der Basis bis zur Spitze.
  5. Fassen Sie die Rute mit ein paar Zangen und senkrecht halten. Mit einer zweiten Zange, greifen Sie die Haut neben der Schnitt an der Unterseite der Rute und ziehen Sie es zurück. Tun Sie dies auf beiden Seiten des Schnittes, bis die Haut durch ziehen nach unten in Richtung der Spitze der Rute abgezogen werden kann.
  6. Halten Sie die geschälte Rute mit einer Pinzette über das Gericht mit der Trypsin-Lösung und schneiden Sie die Rute in etwa 1 cm lange Stücke. Mit der Rute in der Trypsin-Lösung mit einer Schere um die Stücke in kleinere Stücke zu fragmentieren. Inkubieren Sie die Heck-Stücke in die Trypsin-Lösung bei 37 ° C für 10 min.
    Hinweis: Je kleiner die Stücke sind bevorzugt, um jedes Stück eine große Oberfläche, Volumen-Verhältnis bieten.
  7. Die Trypsin mit 2 Bände von Fibroblasten Erweiterung (FEX) Medium zu stillen (High-Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) mit 15 % FBS, 2 mM L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin).
  8. Gesamten Inhalt der Schale in ein 50 mL-Tube und Zentrifuge bei 350 × g für 5 min bei 4 ° c zu sammeln Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Tail-Fragmente in 10 mL frisches FEX Medium.
  9. Tail Fragmente im Medium zu einem Gelatine-beschichtete Gericht übertragen und Inkubation bei 37 ° C in 5 % CO2 und 4 % O2, Hinzufügen frischen FEX Medium alle 2 Tage.
    Hinweis: Nach fünf bis sieben Tage, habe Tail Fragmente an der Unterseite der Schale befestigt und Fibroblasten Abkehr von ihnen gesehen werden können.
  10. Wenn Cluster von Fibroblasten gesichtet werden, schütteln Sie vorsichtig das Gericht um Heck Stücke zu verdrängen und aspirieren Sie das Medium und die Knochenfragmente verlassen die Fibroblasten, die an der Platte befestigt. Fügen Sie neues FEX Medium und Kultur die Fibroblasten bis zum Zusammenfluss.
  11. Um keine Verunreinigung von Fibroblasten von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu gewährleisten, die Zellen von der Platte mit 1 X Trypsin-EDTA für 5 Minuten distanzieren und Zellen zu sammeln. Für Zellen, die mit dem Ausdruck hämatopoetischen Marker zu einem Abbau (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, und Ter-119) eine magnetische Trennung System10verwenden.

(2) Retrovirus Produktion

  1. Seed retrovirale Verpackungszellen bei etwa 2,5 × 104 Zellen/cm2 (2,0 × 106 Zellen für eine 10 cm Teller) auf einer Gewebekultur behandelt (durch Vakuum-Gas Plasma) Gericht und Kultur über Nacht in hoch-Glukose DMEM mit 10 % FBS, 10 mM Natrium Pyruvat und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C und 5 % CO2.
  2. Am nächsten Morgen ändern Sie das Medium in DMEM ohne Zusatzstoffe mit halber Lautstärke verwendet, um über Nacht Kultur (5 mL für eine 10 cm Teller). Am Nachmittag zu überprüfen, dass die Zellen 70-80 % Zusammenfluss sind und die Transfektion beginnen.
  3. Für jede Neuprogrammierung Faktor bereiten Gata1, Tal1, Lmo2, und c-Myc, eine 2:1-Mischung der Expressionsvektor (pMX) und Helfer Vektor (mit Gene Gag und Pol). Verwenden Sie für eine 10 cm Teller von Fibroblasten 6 µg des Expressionsvektors und 3 µg Helfer Vektor in einem Endvolumen von 100 µL in DMEM Medium.
  4. Bereiten Sie für jede Neuprogrammierung Faktor 300 µL der Raumtemperatur (RT) DMEM in ein steriles Röhrchen aus Polystyrol zu und sorgfältig 27 µL kommerzielle Transfection Reagens.
    Hinweis: Die Transfektion Reagenz sollte RT vor Gebrauch gebracht und muss direkt in das Medium hinzugefügt werden, da die elektrostatischen Eigenschaften der Verbindung an den Kunststoff Wand des Rohres zu halten machen können.
  5. Das Plasmid durchmischen in die Transfektion Reagenz-haltigen Röhre, Wirbel kurz und brüten Transfection Reagens-DNA-Mischung für 15 min bei RT kurz Wirbel die Mischung und die retroviral Verpackungszellen tropfenweise hinzufügen, um die Transfektion Reagenz-DNA-Mischung gleichmäßig über die Kultur und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  6. 24 h nach Transfektion, ändern Sie das Medium in DMEM mit 20 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. 48 h nach Transfektion, den Überstand zu sammeln und durch einen 0,22 µm Porengröße Spritze Filter filtern.
    Hinweis: Virale Überstände können bis-80 ° C eingefroren und gehalten bis erforderlich, obwohl Transduktion ist effizienter, wenn frische virale überstand verwendet wird.

3. GTLM Transduktion und iEP Ernte

  1. Samen der Schweif Tipp Fibroblasten bei 1 × 104 Zellen/cm2 auf 0,1 % Gelatine vorbeschichtet Gerichte in FEX Medium und Inkubation bei 37 ° C für 24 h.
  2. Am nächsten Tag eine Transduktion Mischung wie folgt zubereiten.
    1. 6 Bände der FEX Medium (60 %) fügen Sie 1 Volumen von viralen überstand für jeden Neuprogrammierung Faktor ergänzt mit 4 µg/mL retroviralen Infektion Reagenz (40 % hinzu).
    2. Für eine 10 cm Teller von Fibroblasten, fügen Sie 1 mL jede virale überstand (4 × Viren = 4 mL) mit 4 µg/mL retroviralen Infektion Reagenz zu 6 mL FEX Medium, was eine Gesamtzahl von 10 mL Transduktion Mischung ergänzt.
  3. Aspirieren Sie FEX Medium aus der Fibroblasten-Kultur und ersetzen Sie ihn durch die Transduktion Mischung. Inkubieren Sie die Signalweiterleitung für 4 h bei 37 ° C in hypoxischen Bedingungen (5 % CO2 und 4 % O2).
  4. Die Transduktion Mischung Aspirieren und ersetzen es durch frisches Neuprogrammierung Medium (Expansion serumfreien Medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/Streptomycin, 100 ng/mL murinen Stem Cell Factor (mSCF), 10 ng/mL murinen Interleukin-3 (IL3), 2 U/mL human rekombinanten Erythropoetin (HrEPO) und 100 nM Dexamethason).
  5. 8 Daysat in hypoxischen Bedingungen hinzufügen frischen Neuprogrammierung Medium alle 2 Tage 37 ° C inkubieren. Nach fünf bis acht Tagen erbringt erfolgreiche Reprogrammierung Cluster von Zellen, die getrennt haben aus der Platte.
  6. Zum Sammeln von reprogrammierter Zellen für die Analyse sanft pipette rauf und runter um sie direkt aus der Schale zu ernten. Um untransduced Fibroblasten zum Vergleich zu ernten, die Zellen von der Platte mit 1 X Trypsin-EDTA distanzieren und zu sammeln.

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Representative Results

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Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Protokoll zur Herstellung von iEPs von Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven DLR. Wir bewerten die Zelle Neuprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, koloniebildenden Assays und gen Expressionsanalyse. Um die Visualisierung der Konvertierung erythroiden Zelle Schicksal zu unterstützen, führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26- eYFP) die zum Ausdruck bringen des gelben fluoreszierenden Proteins (eYFP) von den Rosa26 Locus in allen Zellen, die die Erythropoietin-Rezeptor (Epor, Cre klopfte in ein Allel von endogenen Epor Locus) ausdrücken Transkript in jedem Stadium ihrer Entwicklung12,13 ( Abbildung 1A). Nach erfolgreichen Neuprogrammierung des erythroiden Vorläuferzellen induziert, sind YFP positivere (EpoR +) Zellen beobachten bereits fünf Tage nach Transduktion. Bis zum Tag 5 der Neuprogrammierung, Zellen werden Runde heben Sie von der Oberfläche der Platte und beginnen Sie bilden Cluster zu. Tag 5-iEPs anzeigen eine erythroiden Vorläufer-ähnliche Morphologie, das verfügen über einen charakteristischen Kern, grobem Chromatin und blauer Zytoplasma nach May-Grünwald-Giemsa Färbung (Abbildung 1C). Hemoglobinization einige Zellen ist offensichtlich durch positive Benzidine Färbung und eine milde rote Erscheinung, wenn oelletiert (Abbildung 1-E). Darüber hinaus ist ein kleiner Bruchteil der Tag 5-iEPs Co Express YFP und der erythroiden-spezifische Oberfläche Marker Ter119 (Abbildung 1F). Tag 8 können große YFP + Cluster erkennbar. Tag 8iEPs präsentieren einen differenzierteren erythroiden Phänotyp als Tag 5 iEPs; Sie sind deutlich kleiner, mehr Hämoglobin angesammelt haben und auch zeigen deutlich hochreguliert Ausdruck des Ter119 (Abbildung 1 b1 G). Zyto-Spins von Tag 8-iEPs zeigen erythroiden-ähnliche Morphologie, während sehr wenige entkernte Reti (Abbildung 1H) eingehalten werden.

Gen Expressionsanalyse durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Masse iEPs gesammelt am Tag 8 zeigt, dass sie fast Shutdown Expression von Fibroblasten Genen und haben hochreguliert viele erythroiden Gene einschließlich Globin Gene, überwiegend mit dem Ausdruck ihrer embryonalen Typen (Abbildung 1ich). Um festzustellen, ob die umprogrammierten Zellen durch multipotenten Vorläuferzellen Übergang, wir einen zeitlichen Verlauf durchgeführt und analysiert die Expression von hämatopoetischen Marker in der gesamten Umprogrammierung. Wir berichtete zuvor, dass erythroiden Vorläufer Ausgabe höchsten am Tag 6, gefolgt von Tag 8, mit 10,5 % ± 4,6 % und 6,6 % ± 0,5 % von lebenden Zellen YFP + Co CD71 und Ter119, bzw.10zum Ausdruck bringt. Außerdem gibt es eine Population von CD41 positive Zellen vor dem Erscheinen des Ter119 positive Zellen. C-Kit weder CD45 Marker, die in der Regel in hämatopoetischen Vorläuferzellen und herunterreguliert in Erythropoese ausgedrückt werden, werden zu jedem Zeitpunkt die Neuprogrammierung (Abbildung 1J) ausgedrückt. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Zellen nicht gehen durch eine multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen oder früher, aber tun vielleicht Übergang durch eine Megakaryocyte-erythroiden Vorläuferzellen.

Eine zuverlässige Möglichkeit zur Beurteilung der Effizienz der Reprogrammierung soll BFU-E koloniebildenden Assays für die umprogrammierten Zellen ausführen. In Vitro Differenzierung Kapazität von Tag 5- und Tag 8-iEPs war in Methylcellulose ergänzt mit menschlichen Erythropoetin, murinen Stammzellen Faktor und Dexamethason untersucht. Nach 8 Tagen iEPs gebildet zwei Arten von Kolonien: deutlich rot (rote iEP) und nicht-sichtbar rot (non-Red iEP). Während Zellen aus roten Kolonien Erythroblast Morphologie angezeigt, keine Ähnlichkeit mit erythroiden Zellen, Zellen aus non-Red Kolonien und waren unregelmäßig, hatte große tief blau und granulare Zytoplasma (Abb. 2A).

Von dem Tag 5-iEPs bildeten ungefähr 1 in 1.000 rote Kolonien, während nur etwa 1: 10.000 Tag 8-iEPs rote Kolonien mit ein viel höheres Verhältnis von non-Red Kolonien gebildet (Abbildung 2B) bildete. Diese Verringerung der koloniebildenden Fähigkeit zwischen 5- und 8-iEPs Tag könnte sein erklärt ByiEPs in Abgrenzung zu 5-8 Tage und die GTLM Expressionsvektoren leiden im Laufe der Zeit zum Schweigen zu bringen. qPCR Analyse bestätigt, dass Ausdruck der exogenen Abschrift von 5 bis 8 Tage deutlich sinkt. Erwartungsgemäß in erfolgreiche Reprogrammierung Ausdruck Niveaus des endogenen Gata1, Tal1, Lmo2und c-Myc induziert, endogene Lmo2 Ausdruck ist jedoch nur sehr niedrigen ausgedrückt (Abbildung 2C).

Ein Hinweis, und eine Einschränkung des Assays, ist, dass non-Red Kolonien mit Makrophagen-ähnliche Zellen die rote hemoglobinized iEP Kolonien gebildet von umprogrammierten Fibroblasten in koloniebildenden überwiegen Assays. Koloniebildenden Fähigkeit, rote iEP Kolonien zu schaffen kann verbessert werden, indem Sie ändern die stöchiometrischen Verhältnisse GTLM Faktoren. Transducing die Zellen mit doppelt so viel Tal1 und Lmo2 Expressionsvektoren führte zu einem leichten Anstieg über das Verhältnis von roten Kolonien über non-Red Kolonien, während zusätzliche Gata1 zu einem deutlichen Anstieg der Bildung von roten Kolonien führte und fast eine vollständige Beseitigung der non-Red Kolonien unterstützen die wichtige Rolle für diese Faktoren bei der Erythropoese (Abbildung 2D). Interessanterweise erhöht die Expression von c-Myc drastisch die Produktion der non-Red Kolonien trotz unverzichtbar für eine Anpassung. Um reine induzierte erythroiden Vorläuferzellen für nachgelagerte Analyse zu erhalten, können Kolonien von koloniebildenden Assays isoliert werden. Führten wir gen Expressionsanalyse in Form von Microarray auf rot und non-Red Kolonien von Tag 5-iEPs und Kolonien von 14,5 Tage post Koitus (Dpc) fetalen Leber (FL) und Erwachsenen Knochenmark (BM) zum Vergleich. Die Microarray-Daten sind zugänglich durch NCBI Gene Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Wir haben bereits gezeigt, dass rot-iEP Kolonien die Bona Fide erythroiden Kolonien (FL und BM) gen Ausdruck10ähneln. Prüfung des Ausdrucks von Gata1, Tal1, Lmo2, und c-Myc in jeder Kolonie zeigt, dass während der roten Kolonien ähnliche Niveaus der Ausdruck aller vier Faktoren FL und BM zeigen, non-Red Kolonien niedriger Ausdruck alle Faktoren, vor allem Gata1 (Abb. 2E). Um zu verstehen, was sind die non-Red Kolonien, Makrophagen-wie Zellen enthalten, wir die Expression von Zelle Typ-spezifischen Genen in den jeweiligen Kolonie von Microarray Daten befragt. Wie bereits berichtet drücken die roten Kolonien viele erythroiden-spezifische Gene, ähnlich dem von FL und BM. Nach Überprüfung der Daten, ist es klar, dass die non-Red Kolonien hohe Expression verschiedener Gene charakteristisch für Makrophagen Zellen14 (Abbildung 2F zeigen). Weder rote noch non-Red Kolonien zeigen deutlich erhöhten Ausdruck der typischen Megakaryocyte Gene15. Zusammen, diese Daten deuten darauf hin, dass die non-Red Kolonien mehr Makrophagen als Erythrozyten ähneln. Da non-Red Kolonien nie eingehalten werden, wenn einer der Faktoren, GTLM werden entfernt, scheinen diese Makrophagen-ähnliche Zellen gebildet werden, wenn der Ausdruck eines oder mehrerer der Neuprogrammierung Faktoren Gata1, Tal1, Lmo2 niedriger sind erforderlich für eine Anpassung an den iEPs. Zusammen, dies deutet darauf hin, dass der Ausdruck Niveaus aller vier GTLM Faktoren wichtig in TTF, iEP Neuprogrammierung und Heterogenität erklärt wird, durch unvollständige Reprogrammierung von einzelnen Zellen, die möglicherweise durch die Einstellung korrigiert werden können stöchiometrischen Verhältnisse.

Um Effizienz und Robustheit unserer Protokoll zu beurteilen, wir testeten die Fähigkeit einer festgelegten Anzahl von Fibroblasten, nach 5 Tagen sichtbar Cluster iEP Zellen produzieren wenn in 384-Well Platten kultiviert. Wir stellten fest, dass aus 24 Transductions von 20, 30, 40 und 50 TTFs, Anzahl der Bohrungen mit mindestens einem iEP Cluster 3 (0,6 % der Platten Fibroblasten), 15 (2,0 % der Platten Fibroblasten), 15 (1,6 % der Platten Fibroblasten) und 13 (1,1 % der Platten Fibroblasten) , beziehungsweise. Dies deutet darauf hin, dass GLTM iEP Neuprogrammierung ist ein robustes und zuverlässiges Verfahren, die einen Wirkungsgrad von 1 % erreichen können.

Weitere Faktoren, die Effizienz der Neuprogrammierung beeinflussen können sind die Durchgangsnummer die Fibroblasten und die Kulturbedingungen. Wir verglichen die Neuprogrammierung Effizienz der TTFs, die drei mal passagiert wurden hatte oder neunmal vor Transduktion. TTFs, die neun mal passagiert schon hatte (P9) zeigte eine dramatische Reduktion in der Fähigkeit, Cluster von iEPs(Abbildung 3). Interessanterweise ist Aufnahme von Serum in die Neuprogrammierung Medien komplett Blöcke Neuprogrammierung, ersetzen Serum mit erythroiden Zytokine erforderlich, damit die transduced Faktoren, die neue Zelle Schicksal ohne Compoundierung Signale aus dem Serum zu fahren. Entfernung des Serums und der Ausdruck der neuen Faktoren innerhalb der Zelle werden voraussichtlich auf die Zellen stressig sein. In der Tat stieg blockiert p53 Aktivierung stark die Zahl der iEPs generiert. Dieser Effekt kann auch in Reprogrammierung von p53 Ko Fibroblasten (Abbildung 3B-D) gesehen werden. Hemmung von p53 Signalisierung führt zu mehr Zelle überleben und besser Neuprogrammierung und ist eine validierte Methode zur Verbesserung der Ausbeute. Schließlich ist die Umprogrammierung in hypoxischen Bedingungen günstig, aber nicht unbedingt notwendig für die Produktion von iEP. Allerdings ausgestrahlt TTFs kultiviert in Normoxiezustand sind viel langsamer reprogram und iEP Cluster werden nach 10 Tagen anstelle von fünf bis acht Tagen (Abbildung 3E) beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1 : Erzwungene Ausdruck von Gata1, Tal1, Lmo2und c-Myc programmiert murine Erwachsenen Fibroblasten in erythroiden Vorläuferzellen, die Eigenschaften von Bona Fide erythroiden Zellen aufweisen. (A) Versuchsanordnung für Transkription Faktor-vermittelten Umprogrammierung der erythroiden Reporter (Epor-Cre R26-eYFP) tail Tipp Fibroblasten (TTF) EpoR + umprogrammiert Zellen. (BF) Zeit Kurs iEP Generation von untransduced TTFs (Tag 0) und bulk-GTLM ausgestrahlt TTFs an den Tagen 5 und 8 (repräsentativ für n = 2-3). Transdifferenzierung war bewertet (B) Leben-Zelle, Hellfeld Bilder der einzelnen Vertiefungen (Skala bar, 50 µm); (C) May-Grünwald - Giemsa Färbung Zyto-Spin (Maßstabsleiste, 20 µm); (D) Benzidine/Giemsa Färbung Zyto-Spin (Maßstabsleiste, 20 µm); (E) makroskopische Untersuchung der Zelle Pellets; und (F) repräsentative Durchflusszytometrie Grundstücke zeigen YFP / Ter119 Ausdruck. (G) Zelle Durchmesser des iEPs geerntet an den Tagen 5 und 8 von mehreren Zyto-Spin Dias, zeigen einen Rückgang der Zellengröße am 8. Tag gemessen. Daten werden als ± SD bedeuten präsentiert (n = 21-25); p ≤ 0,0001 ungepaarten t-test. (H) repräsentative hochauflösende Benzidine/Giemsa Bilder von GTLM ausgestrahlt TTFs am 8. Tag. Maßstabsleiste, 5 µm. (I) Relative mRNA Expression von relevanten Fibroblasten und erythroiden-spezifischen Genen einschließlich Globin-Gene in der untransduced TTFs (graue Säulen) gegen Masse GTLM ausgestrahlt TTFs (rote Säulen) am Tag 8, durch qPCR ermittelt. Daten werden als ± SD bedeuten präsentiert (n = 4-6 für iEPs, n = 2 für untransduced TTFs). (J) Diagramm, Zusammenfassung der Zeitverlauf Flow Cytometry Analyse untransduced TTF (Tag 0) und Masse GTLM ausgestrahlt TTF geerntet am Tag 2, 4, 6 und 8 zeigt YFP, CD45, CD71 und Ter119 Ausdruck (n = 3). Daten werden dargestellt als Mittelwert ± SD Figur angepasst aus Capellera-Garcia S, Et Al. 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : GTLM iEPs produzieren rote und non-Red Kolonien im BFU-E Kolonie Assays. (A) repräsentative Hellfeld und May-Grünwald-Giemsa Cytospin Bilder des iEP abgeleitet rot und non-Red Kolonien. Maßstabsbalken, 50 µm (Kolonie Bilder) und 10 µm (Zyto-Spin Bilder). (B) Kolonie zählt generiert aus vergoldeten untransduced TTFs bulk-5.Tag iEPs und bulk-Tag 8. Daten werden als ± SD bedeuten präsentiert (n = 3); p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 durch zwei-Wege-ANOVA. (C) Relative mRNA Expression von Gata1, Tal1, Lmo2, und c-Myc in untransduced TTF und Bulk geerntet GTLM ausgestrahlt TTF an Tag 5 und 8, von qPCR bestimmt. Primer wurden so konzipiert, dass endogene Ausdruck von insgesamt Ausdruck unterschieden werden könnte. Daten werden als ± SD bedeuten präsentiert (n = 4-6 für iEPs, n = 2 für untransduced TTF). (D) Kolonie zählt generiert aus vernickelt untransduced TTFs und Masse Tag 5 iEPs generiert durch das Verhältnis der einzelnen GTLM Faktoren zu verdoppeln. Daten werden als ± SD bedeuten präsentiert (n = 3); ** p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 durch zwei-Wege-ANOVA. (E) relativen Ausdruck von Gata1, Tal1, Lmo2, und c-Myc in untransduced Fibroblasten und gepflückten Kolonien erzeugt vom GTLM ausgestrahlt iEPs (rot und nicht rot), 14,5 Dpc fetalen Leber und adult Knochen Knochenmark, von Microarray bestimmt. Daten werden präsentiert, da ± SD bedeuten; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 durch zwei-Wege-ANOVA. (F) Relative Expression ausgewählter Gene bekannt für ihren Ausdruck in erythroiden (oben), Megakaryocyte (Mitte) und Makrophagen (unten) Zellen in untransduced Fibroblasten und gepflückten Kolonien von GTLM ausgestrahlt iEPs (rot und nicht rot) erzeugt, 14.5dpc fetalen Leber und Erwachsenen Knochenmark durch Microarray bestimmt. Daten werden ausgewiesen, weil meine ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 durch zwei-Wege-ANOVA. Beläuft sich auf Capellera-Garcia S, Et al. 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : GTLM Umprogrammierung ist ein robustes und zuverlässiges Verfahren. (A) Kurve der Anzahl von Clustern beobachtet von 10.000 TTFs und repräsentative Bilder am Tag 5 der GTLM Neuprogrammierung der Schweif Tipp Fibroblasten (TTF), die drei Passagen (P3) oder neun Passagen (P9) vor Umprogrammierung unterzogen wurden. Daten werden als ± SD bedeuten präsentiert (n = 6); Maßstabsleisten sind 50 µm. (BD) repräsentative Bilder des iEP Cluster 6 Tage nach (B) GTLM Umprogrammierung der Schweif Tipp Fibroblasten; (C) GTLM Umprogrammierung der TTFs mit Zusatz von p53DN Expressionsvektor; (D) GTLM Reprogrammierung von p53 Ko TTFs (skalieren Balken = 50 µm). (E) repräsentative Bilder von iEP Clustern nach 10 Tagen GTLM Umprogrammierung inklusieve Bedingungen durchgeführt (Maßstabsleiste = 50 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ist ausreichend, um murinen und menschlichen Fibroblasten direkt an iEPs10neu zu programmieren. Die umprogrammierten erythroiden Zellen ähnelte stark Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen hinsichtlich Morphologie, Phänotyp, Genexpression und koloniebildenden Fähigkeit. Dieser Befund bestätigt die Begründung der Verwendung direkter Reprogrammierung als Werkzeug für die Definition von Entwicklungsfaktoren in Hämatopoese. Um die Wirksamkeit dieser Methode zu unterstützen, können iEPs auch mit GTLM Induktion der Maus embryonalen Fibroblasten und menschliche Vorhaut Fibroblasten, zeigen, dass es für Fibroblasten unterschiedlicher Herkunft und in Arten10 funktionierterzeugt werden. In diesem Bericht veranlassen wir Reprogrammierung von Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Maus als ein Werkzeug, um die Umstellung auf eine erythroiden Zellen visualisieren. Diese Maus ist nützlich, aber nicht entscheidend für das Protokoll. Wir routinemäßig durchführen Neuprogrammierung mit mehreren Arten von Fibroblasten aus verschiedenen Mausstämme und iEPs durch Zelle Oberfläche Marker Expression von Ter119 und CD71 zu identifizieren.

Unsere aktuellen Methode generiert iEPs, die einen primitiven erythroiden Phänotyp im Gegensatz zu einer endgültigen Erwachsenen Phänotyp aufweisen. Einer der Hauptunterschiede zwischen diesen Phasen der Entwicklung ist der Ausdruck der verschiedenen Globin-Gene. Wir haben jedoch diesen Zusatz von Klf1 und Myb GTLM cocktail Änderungen iEPs Globin Expressionsmuster von überwiegend embryonalen bis vor allem Erwachsene10,14gezeigt. Interessanterweise, Vorurteile zusätzlich Gata2 und Runx1 zu den vier-Faktoren-Cocktail und Thrombopoietin im Medium den Neuprogrammierung Prozess in Richtung der Megakaryopoese Linie16.

Die GTLM-induzierte iEPs produzieren erythroiden Vorläuferzellen mit einer primitiven gen Ausdruck Signatur und eine begrenzte proliferative Kapazität. Darüber hinaus produzieren die iEPs sehr wenige entkernte Erythrozyten. Die Armen erythroiden Vorläuferzellen Expansion erklärt sich durch das Scheitern reprogram Kit + definitive erythroiden Zellen, die potenziell mit Zusatz von anderen Faktoren induzieren, direkte Reprogrammierung zu iEPs mit einem definitiven Genexpression erreicht werden können Programm.

Unsere Daten deuten auch schlechte Enukleation Effizienz erklärt durch die Tatsache, dass GTLM-induzierte iEPs Vorstufen mit einer primitiven, anstatt eine definitive gen-Ausdruck-Programm generieren. Mehrere Versuche zur Optimierung der Kulturbedingungen wurden ohne verbesserte Enukleation versucht. Laufende Versuche, beide Stammvater Proliferation und Enukleation Effizienzsteigerung richten sich daher auf die Identifizierung von fehlenden Faktoren zur Induktion zur endgültigen iEPs Umprogrammierung.

Für die optimale Produktion von roten iEP Kolonien ist es wichtig, dass die Zellen sind mit allen vier Vektoren ausgestrahlt und GTL Gene sind auf hohem Niveau zum Ausdruck gebracht. Die derzeit effizienteste Methode erlaubt leider keine Vorabkontrolle der Vektor-Titer. Ein Versuch zur Verbesserung der Effizienz mit Bicistronic Lentivirale Vektoren war nicht erfolgreich, möglicherweise aufgrund von Problemen mit minderwertigen Stöchiometrie oder unzureichender Ausdruck. Während Arbeit ist im Gange, Neuprogrammierung Vektoren zu verbessern, produziert bleibt die effizienteste Methode unter Verwendung von Kombinationen der frisch Vektor überstand mit der zuvor beschriebenen retroviralen Vektoren mit dem Ausdruck nur ein Faktor und keine Auswahl-Marker-gen.

GTLM Umprogrammierung zu iEPs ist das einzige gemeldete Protokoll erythroiden Vorläuferzellen-wie Zellen aus einer engagierten somatischen Zellen zu produzieren. Wie iEP Forschungsmethode Tool das DLR hat daher einige Vorteile gegenüber anderen erythroiden Zellsystemen Modell wie die erythroiden Zelle Linien HiDEPs/HuDEP Zellen (PMID: 23533656)17. Während HiDEPs/HuDEP Zellen bequemer Werkzeuge für die Produktion der großen Skala Erythrozyten und Genfunktion während terminal Erythropoese Bewertung sind, ist der einzigartige Vorteil GTLM Umprogrammierung zu iEPs die Fähigkeit, direkt von den Kern transkriptionelle Programme erythroiden Zelle Schicksal. GTLM Umprogrammierung bietet eine wertvolle Plattform für das Studium sowohl Erythropoese bei Mensch und Maus, zum Beispiel, um das Wechseln zwischen primitiven und endgültige Erythropoese zu studieren. Das Verständnis dieser Schalter ist von großem Interesse bei der möglichen Behandlung von Hämoglobinopathien, wie z. B. Sichelzellanämie, in denen Forscher streben, den Schalter bei Erwachsenen zu fetalen Hämoglobins, die Krankheit zu lindern rückgängig zu machen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu berichten.

Acknowledgments

Wir danken Evelyn Wang und Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) für das Klonen und Harvey Lodish (Whitehead Institut) für die Bereitstellung vieler der Plasmide, die für die Generierung der retroviralen Bibliothek verwendet. Wir danken Kavitha Siva und Sofie Singbrant (Abteilung für Molekularmedizin und Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson und Shamit Soneji (Abteilung für molekulare Hämatologie, Universität Lund) für ihre Rolle bei der Beschreibung des iEP Produktion. Wir würden auch gerne anerkennen und danke Julian Pulecio (Zentrum für Regenerationsmedizin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent Institute of Medical Research und Departement für Medizin, St. Vincent Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (katalanische Institution für Forschung und Weiterbildung, Barcelona) und Vijay G. Sankaran (Broad Institute des Massachusetts Institute of Technology und Harvard, Cambridge ) für ihre bisherigen Beiträge zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Ragnar Söderberg Stiftung (j.f.); die Swedish Research Council (, j.f.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (, j.f.); die schwedische Stiftung für strategische Forschung (, j.f.); Åke Wiberg Stiftung (j.f.); ein Marie Curie Integration Stipendium (j.f.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

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References

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Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen
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Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).More

Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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