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Developmental Biology

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

doi: 10.3791/58464 Published: December 14, 2018

Summary

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

Abstract

Erythroid 셀 헌신 및 분화 세포 운명 결정 및 성숙 요인의 그룹에 의해 조율 된 혈통 제한 transcriptional 네트워크의 활성화를 통해 진행 됩니다. 우리는 직접 혈통 유도 erythroid 창시자/선구자 (Iep)으로 섬유 아 세포의 프로그래밍을 사용 하 여 적혈구 개발 지시에 필요한 요인의 최소 집합을 정의 하려면 이전 밖으로 설정. 우리 보여 그 overexpression Gata1Tal1, Lmo2c-Myc (GTLM) 수 변환 murine와 인간의 섬유 아 세포 직접 Iep 유사한 형태학, 측면에서 보 나 fide erythroid 셀을 빠르게 표현 형, 그리고 유전자 발현입니다. 우리는 Iep 적혈구와 세포 운명 조절 연구에 귀중 한 도구를 제공할 것입니다 것입니다. 여기는 Iep 통해 전사 요소 기반 직접 혈통 (DLR) 프로그래밍 murine 꼬리 팁 fibroblasts 변환의 단계적 과정에 설명 합니다. 이 예제에서 erythroid 셀의 시각화 수 있도록 리스로 수용 체 유전자 (EpoR) 발기인의 통제 노란 형광 성 단백질 (YFP)을 나타내는 erythroid 계보 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 프로그래밍에 따라 운명 감 응 작용입니다. 이 프로토콜에 따라 5 ~ 8 일 이내 fibroblasts Iep에 재설정 수 있습니다.

개선 과정에 아직도 할 수 있다, 우리 표시 프로그래밍 GTLM 중재 하는 것이 신속 하 고 직접적인 프로세스는 저조한 진실 fide 의 속성을 가진 셀 erythroid 조상 및 선구자 세포.

Introduction

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적혈구 (Rbc)는 모든 척추 동물에 필수적인 고 인체1의 모든 셀의 84%. 성인 생활에 배아에서 우리의 건강 높은 RBC 항상성의 정확한 규칙에 따라 달라 집니다. 성인으로 개발에 걸쳐 성숙한 RBCs의 지속적인 생산 적혈구로 알려져 있다. 적혈구 연구의 주요 과제 RBC 개발 및 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치 조정 마스터 레 귤 레이 터를 정의 하는 것입니다. 직접 혈통 erythroid 창시자의 프로그래밍 erythroid 개발 비보를 더욱 이해 하는 기회를 선물 한다.

직접 혈통 프로그래밍 (DLR), transdifferentiation, 일컬어 프로그래밍 한 셀 형식을 직접으로, 만능 multipotent 조상 단계를 우회 하는 프로세스입니다. DLR은 지금까지 신경2조 혈3,,45, 간장6 , 신7, 조상 세포를 포함 하 여 수많은 셀 유형을 일으킬 사용 되었습니다. 발달 생물학에 대 한 DLR 혈통 헌신과 터미널 차별화 프로세스8,9의 질의 측면에 대 한 중요 한 도구가 되고있다. DLR 보완 하 고 vivo에서 연구 개발 하는 동안 요소를 결정 하는 세포 운명의 이해 메커니즘에 대 한 부분적으로 대체할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 erythroid 창시자에 프로그래밍에 대 한 DLR 프로토콜 필드에 게 적혈구의 개발 연구에 대 한 무료 방법의 제공 한다.

우리는 이전 4-팩터 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2,c-MYC (GTLM), erythroid 유도 창시자에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 한지 증명 하고있다 (Iep) 10. erythroid는 GTLM 재설정 셀 크게 닮은 형태, 표현 형, 그리고 유전자 식10면에서 보 나 타고 난 기본 erythroid 창시자. 따라서 Iep 확산 수 용량을 제한 하 고 뚜렷이 확실 한 적혈구의 발병 하기 전에 초기 배아에서 생산 된 것과 유사한 nucleated 적혈구 성숙. 재활 조건 (예를 들어, 요소 또는 다른 요소의 추가 프로그래밍에서 점 돌연변이)에서 변경 하 여, 하나는이 erythroid 개발 및 차별화에 변화를 리드 하는 방법을 이해할 수 있다. 우리는 예를 표시 GTLM 칵테일에 Klf1 또는 Myb 의 추가 주로 배아 (기본)에서 globin 식 패턴 변경 주로 성인 (최종). 이 이는 적혈구에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 DLR을 사용 하 여 유효성을 뒷받침.

여기, 우리 iEPs를 마우스 꼬리 팁 섬유 아 세포 (TTF)에서 생성 하는 과정을 설명 합니다. 우리의 대표 결과에 우리 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍을 수행 (Epor-Cre R26-eYFP) 세포는 모든 Rosa26 소재 시에서 노란 형광 성 단백질 (eYFP)를 표현 erythroid 계보에 헌신의 쉽게 시각화 수 있도록 리스로 수용 체를 표현 했다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 (EpoR +) YFP 긍정적인 존재 하는 변환 후 5 일입니다. 이 프로토콜을 따라서, erythroid 창시자에서 생체 외에서의 세대에 대 한 신속 하 고 강력한 기술을 제공합니다.

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Protocol

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1. 설립 및 기본 마우스 꼬리의 유지 보수 팁 섬유 문화

  1. 0.1% 젤라틴으로 표면을 커버 하 고 37 ° c.에서 약 20 분 동안 요리를 배양 하 여 젤라틴 코팅 요리 (한 꼬리 10 cm 접시 추천)를 준비 접시에서 젤라틴 솔루션을 발음 하 고 적어도 2 시간 동안 건조 하 있습니다.
  2. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 꼬리의 기지에서 절단가 위 꼬리를 제거 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)에서 꼬리를 넣어.
    참고: 최상의 결과 얻으려면 꼬리 취해야 한다 쥐에서 나이의 약 6 ~ 8 주. 그러나 꼬리는 쥐 쥐 나이는 섬유 아 세포의 확산 능력과 감소11프로그래밍의 효율성으로 나이,,의 8 주 이상에서 가져올 수 있습니다.
  3. 무 균 조건 하에서 조직 문화 후드에이 프로토콜의 모든 이후 단계를 수행 합니다. 0.02 %DPBS 트립 신-EDTA의 희석된 trypsin 솔루션을 준비 하 고 코팅된 10 cm 접시에 5 mL을 추가.
  4. 70% 에탄올, 다음 DPBS 먼저 꼬리를 씻어. 한 접시에는 꼬리를 평면 놓고 집게를 사용 하 여 제자리에. 끝에 기지에서 세로 축 따라 꼬리에 절 개를 확인 합니다.
  5. 한 쌍의 집게와 꼬리를 잡고를 수직으로 잡고. 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여, 꼬리의 기지에 절 개 옆에 피부를 다시 껍질. 이렇게 절 개의 양쪽에는 꼬리의 끝을 향해 아래쪽으로 당겨 피부를 벗 수 때까지.
  6. 벗 겨 꼬리 집게와 트립 신 솔루션이 포함 된 요리 위에 고 약 1 cm 긴 조각으로 꼬리를 잘라. 트립 신 솔루션에서 꼬리 조각으로 더 작은 조각으로 조각 조각에 위를 사용 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 trypsin 용액에 꼬리 조각 품 어.
    참고: 작은 조각 각 볼륨 비율 높은 표면적을 제공 하기 위해 선호 됩니다.
  7. 구와 확장 (FEX) 매체의 2 개를 사용 하 여 트립 신을 끄다 (높은 포도 당 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 15 %FBS, 2 mM L-글루타민, 비 필수 아미노산 (NEAA) 및 100 U/mL 페니실린/스).
  8. 50 mL 튜브와 4 ° c.에서 5 분 동안 350 × g 에서 원심 분리기로 접시의 전체 내용을 수집합니다 상쾌한 발음 하 고 신선한 FEX 매체의 10 mL에 꼬리 조각 resuspend.
  9. 젤라틴 코팅 접시 중간에 꼬리 조각 전송 및 5% CO2 와 4% O2를 2 일 마다 신선한 FEX 매체 추가에서 37 ° C에서 품 어.
    참고: 5 ~ 7 일 후, 꼬리 조각 연결 된 접시의 바닥에 그리고 그들을 멀어 섬유 아 세포를 볼 수 있습니다.
  10. 섬유 아 세포의 송이 발견, 일단 부드럽게 꼬리 조각 꺼내와 발음 매체와 접시에 부착 된 섬유 아 세포를 떠나는 모든 뼈 조각이 접시를 흔들. 새로운 FEX 매체를 추가 하 고 합칠 때까지 섬유 아 세포 문화.
  11. 을 보장 하기 위해 조 혈 창시자에 의해 섬유 아 세포의 오염 없이 5 분에 대 한 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 세포를 수집 합니다. 조 혈 마커를 표현 하는 셀에 대 한 고갈 (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, 안티-Gr-1 (Ly-6 G/C), 7-4, 그리고 Ter-119) 자기 분리 시스템10를 사용 하 여.

2. 레트로 바이러스 생산

  1. 약 2.5 × 104 셀/cm2 (2.0 × 106 셀 10 cm 요리에 대 한) 10%로 높은 포도 당 DMEM에서 하룻밤 문화와 조직 문화-(에 의해 처리 진공 가스 플라즈마) 접시에 retroviral 포장 셀 씨 FBS, 10mm 나트륨 Pyruvate, 고 37 ° C, 5% CO2100 U/mL 페니실린/스.
  2. 다음 아침에 변경 매체 DMEM 절반 볼륨 하룻밤 배양 하는 데 사용 (5 mL 10 cm 요리에 대 한)를 사용 하 여 아무 첨가물. 오후에 확인 세포는 70-80% 합칠은 transfection를 시작 합니다.
  3. 각 재활 요소 Gata1, Tal1, Lmo2c-Myc, 표정 벡터 (pMX) 및 도우미 벡터 (개 그 및 pol 유전자 포함)의 2:1 혼합물 준비. 섬유 아 세포의 10 cm 접시, 표정 벡터의 6 µ g과 DMEM 매체에서 100 µ L의 최종 볼륨에 도우미 벡터의 3 µ g를 사용 하 여.
  4. 각 재활 요소에 대 한 살 균 폴리스 티 렌 튜브에서 실 온 (RT) DMEM의 300 µ L를 준비 하 고 신중 하 게 상업 transfection 시 약의 27 µ L를 추가 합니다.
    참고: transfection 시 약 사용 하기 전에 rt 가져와야 한다 하 고 화합물의 정전기 속성 튜브의 플라스틱 벽에 붙어 그것을 만들 수 있는 매체에 직접 추가 해야 합니다.
  5. Transfection 시 약 포함 된 튜브, 짧게 소용돌이에 플라스 미드 혼합을 추가 하 고 실시간 짧게 소용돌이 혼합물에 15 분 동안 transfection 시 DNA 혼합물을 품 어 dropwise retroviral 포장 셀에 추가 되도록 transfection는 시 약-DNA 혼합 문화에 걸쳐 균등 하 게 되 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
  6. transfection, 후 24 h 20 %DMEM 매체 변경 FBS 및 100 U/mL 페니실린/스. transfection, 후 48 h는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 필터링.
    참고: 바이러스 supernatants-80 ° c 냉동 고 변환 신선한 바이러스 상쾌한 사용 하는 경우 더 효율적 이지만, 필요할 때까지 보관 될 수 있습니다.

3. GTLM 변환 및 iEP 수확

  1. 꼬리 팁 1 × 104 셀/c m2 에서 fibroblasts에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 종자 FEX 매체에서 요리를 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  2. 다음 날는 다음과 같이 변환 혼합물을 준비 하 고.
    1. 6 양의 FEX 매체 (60%)에 각 재활 요소 retroviral 감염 시 약 (40%)의 4 µ g/mL와 보완에 대 한 바이러스 성 상쾌한의 1 볼륨을 추가 합니다.
    2. 섬유 아 세포의 10 cm 요리에 대 한 각 바이러스 상쾌한의 1 mL를 추가 (4 × 바이러스 = 4 mL) 10 mL 변환 혼합물의 총 주는 4 µ g/mL FEX 매체의 6 mL를 retroviral 감염 시 약의 보충.
  3. 구와 문화에서 FEX 매체를 발음 하 고 변환 혼합 합니다. Hypoxic 조건 (5% CO2 와 4% O2)에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 변환 품 어.
  4. 변환 혼합물을 발음 하 고 신선한 재활 매체 (혈 청 무료 확장 매체 (SFEM), 100 U/mLPenicillin/스, 100 ng/mL murine 줄기 세포 요소 (mSCF), 10 ng/mL murine 인터 루 킨-3 (IL3), 2 U/mL 인간 재조합 리스로 (hrEPO), 그리고 100 nM Dexamethasone).
  5. 8 daysat hypoxic 조건, 추가 신선한 재활 매체 2 일 마다에서 37 ° C에 품 어. 5 ~ 8 일 후 성공적인 프로그래밍 하는 것은 접시에서 분리 된 셀 클러스터 얻을 것입니다.
  6. 수집 분석에 대 한 재설정된 셀, 부드럽게 플라스틱 아래로 접시에서 직접 그들을 수확. 비교를 위해 untransduced fibroblasts 수확, 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 수집 합니다.

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Representative Results

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여기 성인 섬유 아 세포 전사 인자 기반 DLR을 사용 하 여에서 Iep의 생산을 위한 재현 가능한 프로토콜 선물이. 우리 셀 프로그래밍 cytometry, 식민지 형성 분석 실험, 및 유전자를 사용 하 여 평가 식 분석. Erythroid 셀 운명에 변환의 시각화에 지원 하기 위해 우리는 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 (Epor-Cre R26-eYFP)는 노란 형광 성 단백질 (eYFP) 표현 리스로 수용 체 (Epor, Cre 생 Epor 로커 스의 1 개의 대립 유전자에 기 절)를 표현 하는 모든 셀에 Rosa26 소재 시에서 그들의 개발12,13 ( 의 모든 단계에서 성적 그림 1A). 성공적인 프로그래밍 erythroid 창시자 유발, 후 YFP 긍정적인 (EpoR +) 셀 변환 후 5 일 관찰할 수 있습니다. 프로그래밍, 라운드, 될 셀의 하루 5 접시의 표면에서 들어올리고 클러스터 형성 시작 합니다. 하루 5-Iep 표시 후에 5 월-그 룬 발트-Giemsa 특성 중심 핵, 거친 chromatin 그리고 블루 세포질 기능 erythroid 전조 같은 형태 (그림 1C) 얼룩. 일부 셀의 hemoglobinization는 분명 긍정적인 benzidine 얼룩이 지 고 때 수송과 약간 빨간 외관에 의해 (그림 1D-E). 또한, (그림 1F) 하루 5-Iep 공동 익스프레스 YFP 및 erythroid 특정 표면 마커 Ter119의 작은 분수. 8 일에 의해 큰 YFP + 클러스터를 볼 수 있습니다. 하루 8iEPs 현재 하루 5 Iep; 보다 더 차별화 된 erythroid 형 그들은 훨씬 더 작은, 더 많은 헤모글로빈, 축적 그리고 또한 크게 upregulated 식 Ter119의 표시 (그림 1B-1 G). 거의 enucleated reticulocytes (그림 1H)를 관찰 하는 동안 하루 8-Iep의 Cyto-회전 급강하 erythroid 같은 형태학, 공개.

주 8에서 수집 된 대량 Iep의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 의해 유전자 표정 분석와을 보여줍니다 그들은 섬유 아 세포 유전자의 거의 종료 표현을 upregulated 주로 globin 유전자를 포함 하 여 많은 erythroid 유전자 (그림 1) 배아 형식 표현. 재설정된 셀 multipotent 창시자 통해 전환, 우리 시간 과정을 수행 하 고 프로그래밍을 통해 조 혈 마커의 식 분석. 우리는 이전 erythroid 전조 출력이 높은 날 6, 10.5% ± 4.6%와 6.6% ± 0.5% 라이브 YFP + 셀 공동 표현 CD71와 Ter119, 각각10의 8, 하루 뒤 보고. Ter119 긍정적인 셀의 모양 전에 CD41 긍정적인 세포의 인구가 있다. C-키트도는 일반적으로 조 혈 모 조상 및 적혈구에 downregulated 표현, CD45 마커는 (그림 1J) 프로그래밍에 어느 시점에서 표현 됩니다. 이러한 데이터 셀을 이동 하지 마십시오 것이 좋습니다 multipotent 조 혈 조상 또는 이전 단계를 통해 비록 아마도 megakaryocyte erythroid 조상 통해 전환 할.

재설정된 셀에 BFU E 식민지 형성 분석을 수행 하는 프로그래밍의 효율성을 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법이입니다. 하루 5-하루 8-Iep의 차별화 용량 생체 외에서 인간 erythropoietin murine 줄기 세포 비율과 dexamethasone 보충 스에서 분석 했다. 8 일 후, Iep 형성 식민지의 두 종류: 분명히 빨간색 (빨간색 iEP)와 안 가시 레드 (레드 비 iEP). 빨간 식민지에서 셀 표시 erythroblast 형태학, 비 레드 식민지에서 세포 erythroid 세포, 유사 하지 않은 일반 했다, 큰 깊은 블루 하 고 세분화 된 세포질 (그림 2A) 했다.

Iep-주 5의 약 1에서 1000만 약 1:10,000 하루 8-Iep 비 레드 식민지 형성 (그림 2B)의 훨씬 더 높은 비율로 빨간 식민지를 형성 하는 동안 빨간 식민지를 형성 했다. 식민지 형성이 감소 하루 5-하루 8-Iep 사이 능력 설명된 byiEPs 일 5-8 시간 동안 침묵 고통을 GTLM 식 벡터에서 차별화를 겪고 수 있습니다. 정량 분석 외 인 성적 표현의 일 5 ~ 8에서에서 크게 감소 확인. 그러나 성공적인 프로그래밍에서 예상 대로 생 Gata1, Tal1, Lmo2, 및 c-Myc 식 수준 유도,, 내 인 성 Lmo2 식만 매우 미 천 한 표현된 (그림 2C).

메모의 포인트와 분석 결과의 한계는 대 식 세포와 같은 세포를 포함 하는 레드 비 식민지 식민지 형성 재설정된 섬유 아 세포에 의해 형성 된 레드 hemoglobinized iEP 식민지 많습니다 분석 실험. 식민지를 형성 수 빨간 iEP 식민지를 만들 GTLM 요인의 화학 량 론 비율을 변경 하 여 개선할 수 있습니다. 여분의 Gata1 빨간 식민지의 형성에 상당한 증가를 주도 하는 동안 비 레드 식민지, 빨간 식민지의 약간의 증가를 주도 시험 Tal1 , Lmo2 식 벡터의 금액을 두 번 셀 그리고 거의 비 레드 식민지의 완전 한 제거 적혈구 (그림 2D)에 이러한 요소에 대 한 중요 한 역할을 지원. 흥미롭게도, c-Myc 의 표현을 대폭 증가 프로그래밍을 위한 불가결 임에도 불구 하 고 비 레드 식민지의 생산을 증가 시킵니다. 다운스트림 분석에 대 한 순수한 유도 erythroid 창시자를, 식민지는 식민지 형성 분석 실험에서 분리 수 있습니다. 우리 레드에 microarray의 형태로 유전자 표정 분석을 수행 하 고 하루 5-Iep에서 비 레드 식민지와 식민지 14.5 일에서 게시 성교 (dpc) 태아 간 (플로리다), 성인 골 수 (BM) 비교. Microarray 데이터 NCBI의 유전자 식 옴니 버스 (GEO)를 통해 액세스할 수 있습니다: GSE73344. 우리는 이전 레드-iEP 식민지 유전자 식10(플로리다와 BM) 진실 fide erythroid 식민지를 닮은 나타났습니다. 각 식민지에 있는 Gata1, Tal1, Lmo2,c-Myc 의 식의 시험이 보여줍니다 빨간 식민지 플로리다와 BM을 모든 4 개의 요인의 식의 표시, 비 레드 식민지의 낮은 식 모든 요인, 특히 Gata1 (그림 2E). 무엇을 이해 하 비 레드 식민지 대 식 세포와 같은 세포를 포함 하는, 우리가 조사 각 유형의 microarray 데이터에서 식민지에 셀 유형 특정 유전자의 표정. 이전 보고, 빨간 식민지 많은 erythroid 관련 유전자, 플로리다와 BM의 유사한 표현 한다. 후 데이터를 다시 방문, 그것은 분명 레드 비 식민지 대 식 세포 세포14 (그림 2F)의 높은 식 유전자의 수의 표시. 빨간색도 아닌 레드 식민지 크게 증가 표현의 전형적인 megakaryocyte 유전자15를 표시합니다. 함께, 이러한 데이터 비 레드 식민지 더 가깝게 적혈구 보다 세포를 닮는 것이 좋습니다. 이후 비 레드 식민지는 결코 GTLM 요인 중 하나가 제거 되 면 관찰이 대 식 세포와 같은 세포 하나 이상의 재활 요인 Gata1, Tal1, Lmo2 식 수준 보다 낮은 때 형성 될 것 Iep에 프로그래밍에 대 한 필요 합니다. 함께,이 모든 4 개의 GTLM 요소 식 수준의 중요 TTF에 iEP 프로그래밍 하 고이 잠재적으로 조정 하 여 수정 하실 수 있습니다 개별 셀의 불완전 한 재프로그래밍에 의해 설명 된다 제안 화학 량 론 비율입니다.

효율성과 우리의 프로토콜의 안정성을 평가 하기 위해 우리는 5 일 후 iEP 셀의 보이는 클러스터를 생산 하는 섬유 아 세포의 세트 숫자의 능력 테스트 384-잘 접시에 배양 할 때. 우리는 20, 30, 40, 그리고 50 TTFs의 24 transductions에서 iEP는 적어도 하나의 클러스터와 우물의 수 했다 결정 3 (접시 섬유 아 세포의 0.6%), 15 (접시 섬유 아 세포의 2.0%), 15 (접시 섬유 아 세포의 1.6%), 그리고 13 (접시 섬유 아 세포의 1.1%) 각각. 이 GLTM iEP 프로그래밍 하는 것이 1%의 효율성을 도달할 수 있는 강력 하 고 신뢰할 수 있는 프로세스는 나왔다.

프로그래밍의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인 포함 문화 조건과 섬유 아 세포의 통과 번호. 우리는 세 번을 passaged 했다 TTFs의 또는 9 번 변환 전에 재활 효율성 비교. 9 번을 passaged 했다 TTFs (P9) Iep (그림 3A)의 클러스터를 생성 하는 기능에 있는 극적인 감소를 보여주었다. 흥미롭게도, 재활 미디어에서 혈 청의 포함 완전히 블록 프로그래밍, erythroid cytokines와 교체 혈 청은 혈 청에서 합성 신호 없이 새로운 세포 운명을 transduced 요소를 허용 하는 데 필요한. 혈 청의 제거와 셀 내에 새로운 요인의 식 세포에 스트레스가 될 것입니다. 실제로, Iep 생성의 수를 증가 하는 p53 활성화를 크게 차단. 이 효과 또한 p53 녹아웃 섬유 아 세포 (그림 3B-D)의 프로그래밍에서 볼 수 있습니다. 억제 p53 신호 더 리드 세포 생존 및 더 나은 프로그래밍 및 수율 향상을 위한 하나의 유효한 방법입니다. 마지막으로, hypoxic 조건에서 프로그래밍 이지만 유리한 iEP 생산을 위한 중요 하지. 그러나, 불리고 TTFs normoxia에 교양된 프로그램을 훨씬 더 느리게 되며 iEP 클러스터 5 ~ 8 일 (그림 3E) 대신 10 일 후에 관찰 된다.

Figure 1
그림 1 : Gata1, Tal1, Lmo2, 및 c-Myc 의 강제 식으로 murine 성인 섬유 아 세포 나 fide erythroid 셀의 속성을 전시 하는 erythroid 창시자로. (A) 녹음 방송 요인 중재 erythroid 기자의 프로그래밍에 대 한 실험 설계 (Epor Cre R26-eYFP) EpoR + 재설정 셀 팁 섬유 아 세포 (TTF) 꼬리. (B-F) Untransduced TTFs (0 일)의 iEP 생성의 과정을 시간 및 5-8 일에 GTLM 불리고 TTFs 대량 (n의 대표 = 2-3). Transdifferentiation 단일 우물 (눈금 막대, 50 µ m);의 (B) 라이브 셀, 밝은 필드 이미지에 의해 평가 되었다 (C) 5 월-그 룬 발트의 Giemsa 얼룩 cyto-스핀 (눈금 막대, 20 µ m); (D) Benzidine/Giemsa 얼룩 cyto-스핀 (눈금 막대, 20 µ m); (E) 거시적인 검사 셀 펠 릿; (F) 대표 cytometry YFP 보여주는 플롯 / Ter119 식. (G) 셀 직경 5-8 일에 수확 하는 Iep의 날 8 셀 크기의 감소를 보여주는 여러 cyto-스핀 슬라이드에서 측정. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 21-25); 짝이 없는 tp ≤ 0.0001-테스트. 8 일에 GTLM 불리고 TTFs의 (H) 대표 고해상도 benzidine/Giemsa 이미지. 스케일 바, 5 µ m. (I) 관련 섬유 및 erythroid 관련 유전자 정량에 의해 결정 untransduced TTFs (회색 열) 대량 GTLM 불리고 TTFs (빨간 열) 8, 당일 globin 유전자를 포함 하 여의 상대 mRNA 표현. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 4-6 Iep, n = 2 untransduced TTFs에 대 한). (J) 그래프 untransduced TTF (0 일) 및 대량 GTLM 불리고 TTF 하루 2, 4, 6 및 8 보여주는 YFP, CD45, CD71 및 Ter119 식에서 수확의 시간 과정 흐름 cytometry 분석의 요약 표시 (n = 3). 평균 ± sd. 그림은 Capellera-가르시아 S에서 적응 하는 대로 데이터 표시 됩니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : GTLM Iep 생산 BFU E 식민지 분석 실험에 빨간색과 비 레드 식민지. (A) 대표 밝은 필드와 5 월-그 룬 발트-Giemsa cytospin 이미지 iEP 파생 된 빨강 및 비-레드의 식민지. 스케일 바, 50 µ m (식민지 이미지) 및 10 µ m (cyto-스핀 이미지). (B) 식민지 카운트 도금된 untransduced TTFs에서 생성 된 하루 5 iEPs를 대량 고 대량 주 8. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 (C) Gata1, Tal1, Lmo2, 및 untransduced TTF 및 대량에서 c-Myc 의 상대 mRNA 표정 GTLM 불리고 TTF 수확 5 일과 8, 하루에 정량에 의해 결정 됩니다. 프라이 머는 내 생 식 총 식에서 구별 될 수 있도록 설계 되었습니다. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 4-6 Iep, n = 2 untransduced TTF에 대 한). (D) 에서 생성 된 식민지 수 도금 untransduced TTFs, 및 대량 하루 5 Iep GTLM 요인의 각각의 비율을 두 배로 의해 생성 된. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 3); * * p ≤ 0.001; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 (E) 상대 표현의 Gata1, Tal1, Lmo2, 및 untransduced fibroblasts에 고른된 식민지 c-Myc 에서 생성 된 GTLM 불리고 Iep (빨간색과 비-레드), 14.5 dpc 태아 간, 성인 골 수, microarray에 의해 결정 됩니다. 데이터는 ± SD; 의미 하는 대로 표시 됩니다. * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0.005 p ≤ 0.0005; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 (F) erythroid (맨 위), megakaryocyte (중간), 그리고 대 식 세포에 그들의 표현에 대 한 선택 된 유전자의 상대적 표현을 알려진 untransduced fibroblasts에 고른된 식민지 GTLM 불리고 Iep (빨간색과 비-레드)에서 생성 (아래) 셀 14.5dpc 태아 간, 성인 골 수, microarray에 의해 결정 됩니다. 데이터는 ± SD; 의미 하는 대로 표시 됩니다. * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0.005 p ≤ 0.0005; p ≤ 양방향 ANOVA에 의해 0.0001 그림은 Capellera-가르시아 S, 그 외 여러분 에서 적응 됩니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : GTLM 프로그래밍 하는 것은 강력 하 고 신뢰할 수 있는 과정 이다. (A) GTLM 3 구절 (P3) 또는 9 구절 (P9) 프로그래밍을 이전 받은 꼬리 팁 fibroblasts (TTF)의 프로그래밍의 5 일에 10000 TTFs, 대표 사진에서 관찰 하는 클러스터 수의 그래프. ± SD를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (n = 6); 스케일 바는 50 µ m. (B-D) iEP의 대표 사진을 클러스터 (B) GTLM 꼬리 팁 fibroblasts;의 프로그래밍 후 6 일 (C) GTLM 프로그래밍 TTFs의 p53DN 표정 벡터;의 추가 (D) GTLM는 p53 녹아웃 TTFs의 프로그래밍 (바 규모 = 50 µ m). IEP 클러스터 GTLM 프로그래밍의 10 일 normoxic 조건에서 수행 된 후의 (E) 대표 사진 (눈금 막대 = 50 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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4 단계 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 c-MYC (GTLM), Iep10에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 하다. 재설정된 erythroid 세포는 크게 진실 fide erythroid 창시자를 형태, 표현 형, 유전자 발현, 그리고 식민지를 형성 하는 능력을 닮았다. 이 조에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 서 직접 프로그래밍을 사용 하 여 근거를 뒷받침. 이 방법의 유효성을 지원 하기 위해 Iep 또한 생성할 수 있습니다 마우스 미 발달 섬유 아 세포 및 다른 근원의 및 종10에서 fibroblasts에 대 한 작품을 보여주는 인간 포 피 섬유 아 세포의 GTLM 유도 사용 하 여. 이 보고서에서 우리는 시각화 erythroid 셀으로 변환 하는 도구로 서 프로그래밍 erythroid 리니지 추적 마우스에서 섬유 아 세포의 유도. 이 마우스의 사용은 유용 하지만 프로토콜에 중요 하지. 우리는 정기적으로 여러 종류의 다양 한 마우스 긴장에서 섬유를 사용 하 여 프로그래밍을 수행 하 고 Ter119와 CD71의 세포 표면 마커 식으로 Iep를 식별 합니다.

우리의 현재 메서드는 기본 erythroid 형 확실 한 성인 형에 반대 하는 Iep를 생성 합니다. 이 단계 개발의 큰 차이점 중 하나는 다른 globin 유전자의 표현 이다. 그러나, 우리가 나타났습니다 Klf1 그리고 Myb 의 그 추가 GTLM 칵테일 변경 Iep의 globin 식 패턴을 주로 성인을 주로 배아10,14에서. 흥미롭게도, 추가 Gata2 Runx1 4 요소 칵테일을 매체에서 thrombopoietin megakaryocytic 계보16으로 재활 과정 편견.

GTLM 유도 Iep 원시 유전자 표현 및 제한 된 증식 용량 erythroid 창시자 생산. 또한,는 Iep 거의 enucleated 적혈구 생성. 불 쌍 한 erythroid 조상 확장 키트 + 확실 한 erythroid 셀, 잠재적으로 유도 하는 결정적인 유전자 발현으로 Iep를 직접 프로그래밍 하는 다른 요소의 추가 함께 얻을 수 있는 프로그램을 실패에 의해 설명 된다 프로그램입니다.

우리의 데이터는 또한 가난한 enucleation 효율은 GTLM 유도 Iep 생성 확실 한 진 식 프로그램 보다는 기본으로 일어나는 사실에 의해 설명 제안. 문화 조건 최적화에 몇몇 시도 향상 된 enucleation 없이 시도 했다. 모두 조상 확산 및 enucleation 효율성을 증가 하는 지속적인 시도 따라서 유도 하는 확실 한 iEPs를 프로그래밍에 대 한 누락 된 요소를 식별 하는에서 집중 된다.

빨간 iEP 식민지의 최적 생산을 위한 세포는 모든 4 개의 벡터와 불리고 및 GTL 유전자가 높은 수준에서 표현 생명 이다. 불행 하 게도 현재 가장 효율적인 방법은 벡터 titers의 사전 제어를 허용 하지 않습니다. Bicistronic lentiviral 벡터를 사용 하 여 효율성을 개선 하기 위해 열 등 산출할 또는 부족 식 수준 문제 때문에 가능 하 게 실패 했다. 작업 재활 벡터를 개선 하기 위해 진행 하는 동안 갓의 조합을 사용 하 여 가장 효율적인 방법 남아 하나의 요소와 아무 선택 마커 유전자 표현 앞에서 설명한 retroviral 벡터 벡터 상쾌한 생산.

GTLM 프로그래밍 Iep에 최선을 다하고 체세포에서 erythroid 조상 같은 셀을 생산할 수 있게 유일한 보고 프로토콜입니다. Erythroid 셀 라인 HiDEPs/HuDEP 세포와 같은 erythroid 모델 시스템으로 연구 도구는 DLR iEP 방법 따라서 몇 가지 장점이 다른 셀 (PMID: 23533656)17. HiDEPs/HuDEP 셀은 대규모 적혈구 생산 고 터미널 적혈구 중 유전자 기능을 평가 하기 위한 더 편리한 도구, 독특한 GTLM Iep에 프로그래밍의 장점은 직접 코어의 연구 능력 erythroid 세포 운명 결정 하는 transcriptional 프로그램. GTLM 프로그래밍 인간 및 마우스, 예를 들어 두 적혈구를 공부 하 고 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치를 공부 하는 귀중 한 플랫폼을 제공 합니다. 이 스위치를 이해 hemoglobinopathies 연구 노력 질병을 완화 시키기 위해 태아 헤모글로빈에 성인에 있는 스위치를 반대로 낫 세포 빈 혈 등의 잠재적인 치료에 거 대 한 관심의 이다.

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Disclosures

저자 보고 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

우리 감사에 블 린 왕와 그레고리 하이드 (화이트 헤드 연구소, 케임브리지, MA) 복제와 하 비 Lodish (화이트 헤드 연구소)에 대 한 많은 retroviral 라이브러리를 생성 하는 데 사용 하는 플라스 미드의 제공. 우리 iEP 생산의 설명에서 그들의 역할에 대 한 더 Siva와 소피 Singbrant (학과 분자 의학 및 유전자 치료, 룬 드 대학), 예란 Karlsson Shamit Soneji (학과 분자 혈액학, 룬 드 대학) 감사합니다. 우리 또한 인정 하 고 율리우스 Pulecio (재생 의학 센터, 바르셀로나 메디컬 리서치 파크), 비 올레 타 레이 온 스 트 라 다 (록펠러 대학교, 뉴욕), 칼 Walkley 감사 하 고 싶습니다 (세인트 빈센트의 연구소의 의학 연구와 학과 의학, 세인트 빈센트 병원, 멜버른 대학), 앙 헬 라 야 (연구 및 첨단된 연구, 바르셀로나에 대 한 카탈로니아어 기관), 그리고 비제이 G. Sankaran (광범위 한 기술 및 하버드, 캠브리지, 매사 추세 츠 연구소의 연구원 )이이 작품에 그들의 이전 기여 금을 위해. 이 작품 (J.F.);에 라 그 나 Söderberg 재단에 의해 지원 되었다 스웨덴 연구 위원회 (J.F.);에 Stiftelsen 올레 Engkvist Byggmästare (J.F.);에 전략적 연구 (J.F.);에 대 한 스웨덴 재단 (J.F.);를 아 Wiberg의 기초 (J.F.)에 마리 퀴리 통합 그랜트.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

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References

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리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접
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Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).More

Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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