Summary
Her presenterer vi våre protokollen for produsere indusert erythroid progenitors (iEPs) fra musen voksen fibroblaster med transkripsjon faktor-drevet direkte avstamning omprogrammering (DLR).
Abstract
Erythroid celle engasjement og differensiering fortsette gjennom aktivering av avstamning begrenset transcriptional nettverk orkestrert av en gruppe celle skjebnen bestemme og modning faktorer. Vi tidligere satt ut for å definere et minimumssett med faktorene på krevd for instruere røde blodlegemer utvikling med direkte avstamning omprogrammering av fibroblaster til indusert erythroid progenitors/prekursorer (iEPs). Vi viste at overuttrykte Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc (GTLM) kan raskt konvertere murine og menneskelig fibroblaster direkte til iEPs som ligner bona fide erythroid celler i morfologi, fenotype, og genuttrykk. Ønsker vi at iEPs vil gi et uvurderlig verktøy for å studere erythropoiesis og celle skjebne regulering. Her beskriver vi gradvis prosessen med å konvertere murine hale tips fibroblaster til iEPs via transkripsjon faktor-drevet direkte avstamning omprogrammering (DLR). I dette eksemplet utfører vi omprogrammere i fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus som uttrykker gule fluorescerende protein (YFP) under kontroll av erytropoietin reseptor genet (EpoR) selskapet, aktivere visualisering av erythroid celle skjebne induksjon på reprogramming. Etter denne protokollen, fibroblaster kan omprogrammeres til iEPs innen fem til åtte dager.
Mens forbedringer kan fortsatt gjøres til prosessen, viser vi at GTLM-mediert omprogrammering er en rask og direkte prosess, gir celler med egenskapene for bona fide erythroid stamfar og forløper celler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBCs) er viktig i Alle virveldyr og utgjør 84% av alle celler i menneskelige organer1. Fra embryonale til voksne liv er vår helse svært avhengig av nøyaktig regulering av RBC homeostase. Kontinuerlig produksjon av modne RBCs gjennom utvikling i voksen alder er kjent som erythropoiesis. En stor utfordring i erythropoiesis forskning er å definere master regulatorer som arrangerer RBC utvikling og Bytt mellom primitive og endelig erythropoiesis. Direkte avstamning omprogrammering av erythroid progenitors gir en mulighet til videre forstå erythroid utvikling i vivo.
Direkte avstamning omprogrammering (DLR), også kjent som transdifferentiation, er prosessen med reprogramming en celle type direkte til en annen, omgåelsen pluripotent og multipotent stamfar stadier. DLR har så langt blitt brukt til å produsere mange celletyper inkludert nevrale2, blodkreft3,4,5, hepatic6 og nephrotic7, stamfar celler. For utviklingsmessige biologer, har DLR blitt et viktig verktøy for avhør aspekter av slekten engasjement og terminal differensiering prosesser8,9. DLR kan utfylle og delvis erstatte i vivo studier for forståelse mekanismer for cellen skjebnen bestemme faktorer under utvikling. DLR protokollen omprogrammere til erythroid progenitors beskrevet i dette dokumentet inneholder feltet en gratis metode for utviklingsmessige studier av erythropoiesis.
Vi har tidligere vist at overuttrykte en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrekkelig til å omprogrammere både murine og menneskelig fibroblaster direkte til indusert erythroid progenitors (iEPs) 10. den GTLM-omprogrammeres erythroid celler ligner sterkt bona fide primitive erythroid progenitors i morfologi, fenotype og gene expression10. Dermed iEPs har begrenset spredning kapasitet og modne til kjerne erytrocytter lik de transiently produsert i tidlig embryo før utbruddet av endelig erythropoiesis. Ved å gjøre endringer i reprogramming forhold (f.eks punkt mutasjoner i omprogrammering faktorer eller tillegg av andre faktorer), kan man forstå hvordan dette fører til endringer i erythroid utvikling og differensiering. Vi har for eksempel vist at tillegg av Klf1 eller Myb til GTLM cocktail endres globin uttrykk mønsteret fra hovedsakelig embryonale (primitive) til hovedsakelig voksen (endelig). Dette funnet bekrefter gyldigheten av å bruke DLR som et verktøy for å definere utviklingsmessige faktorer i erythropoiesis.
Her skissere vi prosessen med å generere iEPs fra musen halen tips fibroblaster (TTF). I vår representant resultater, vi utført omprogrammering på fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus (Epor- grobunn R26- eYFP) som express gule fluorescerende protein (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler som uttrykt erytropoietin reseptoren, tillater lett visualisering av forpliktelse til den erythroid avstamning. Bruker denne metoden, finnes YFP positive (EpoR +) celler allerede fem dager etter signaltransduksjon. Denne protokollen, derfor gir en rask og robust teknikk for generering av erythroid progenitors i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. etableringen og vedlikeholdet av hovedknappen på musen halen tips Fibroblast kulturer
- Forbered gelatin-belagt retter (anbefaler en 10 cm rett for en hale) ved dekker overflaten med 0,1% gelatin og rugende retter for ca 20 min på 37 ° C. Sug opp gelatin løsningen fra retten og la det tørke i minst 2 timer.
- Euthanize musene av cervical forvridning. Fjerne halen med saks, kutte ved foten av halen. Sett halen i Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) med 2% fosterets bovin serum (FBS) til klar til bruk.
Merk: For de beste resultatene haler bør tas fra mus rundt 6 til 8 ukens av alderen. Haler kan tas fra mus eldre enn 8 ukens av alderen, men som en mus alder, spredning evnen til fibroblaster og effektiviteten av omprogrammering nedgang11. - Utfør alle påfølgende trinnene i denne protokollen i vev kultur hette under sterile forhold. Forberede en utvannet trypsin løsning av 0.02% trypsin-EDTA i DPBS og Legg 5 mL i en ubestrøket 10 cm rett.
- Vask halen, først i 70% etanol, og deretter i DPBS. I en form, plasserer halen flat og bruk tang til å holde det på plass. Gjør en snitt på halen langs den langsgående aksen fra basen til spissen.
- Hold halen med ett par pinsett og holder den loddrett. Bruker et par pinsett, grip huden ved innsnitt ved foten av halen og skrelle den tilbake. Gjør dette på begge sider av snittet til huden kan bli skrellet av ved å trekke nedover mot spissen av halen.
- Hold skrelles halen med tang over parabolen som inneholder trypsin løsningen og klippe halen i ca 1 cm lange biter. Med halen stykker av trypsin løsningen, kan du bruke saks fragmentere bitene i mindre biter. Inkuber halen stykker i trypsin løsning på 37 ° C i 10 min.
Merk: Jo mindre bitene er foretrukket for å gi hver brikke et høyt område til volumkontrollen. - Slukke trypsin bruker 2 mengder fibroblast ekspansjon (ligger) medium (høy-glukose Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin).
- Samle hele innholdet av retten i en 50 mL rør og sentrifuge 350 × g for 5 min på 4 ° C. Sug opp nedbryting og resuspend halen fragmenter i 10 mL av fersk ligger medium.
- Overføre hale fragmenter i medium til en gelatin-belagt rett og ruge på 37 ° C i 5% CO2 og 4% O2, legger til frisk ligger medium hver 2 dager.
Merk: Etter fem til syv dager, hale fragmenter har festet i bunnen av fatet og fibroblaster kan sees flytter fra dem. - Når klynger av fibroblaster er oppdaget, forsiktig risting parabolen å dislodge halen stykker og Sug opp mediet og alle beinfragmenter forlate fibroblaster knyttet til plate. Legg til nytt ligger medium og kultur i fibroblaster til confluent.
- For å sikre at ingen forurensing av fibroblaster av blodkreft progenitors, distansere cellene fra platen med 1 x trypsin-EDTA i 5 minutter og samle celler. Tømmer for celler uttrykke blodkreft markører (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 og Ter-119) bruker en magnetisk separasjon system10.
2. retrovirus produksjon
- Frø retroviral emballasje celler på ca 2,5 × 104 celler/cm2 (2.0 × 106 celler for en 10 cm rett) på en vev kultur-behandlet (av vakuum-gass plasma) form og kultur over natten i høy-glukose DMEM med 10% FBS, 10 mM natrium Pyruvate og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin på 37 ° C og 5% CO2.
- På morgenen kan du endre mediet til DMEM uten tilsetningsstoffer med halve volumet til kultur over natten (5 mL for en 10 cm rett). På ettermiddagen, kontroller at cellene er 70-80% confluent og starte transfection.
- For hver reprogramming faktor forberede Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc, en 2:1 blanding av uttrykket vektor (pMX) og hjelper vektor (inneholder gag og pol gener). For en 10 cm rett av fibroblaster, bruker du 6 µg av uttrykket vektor og 3 µg av hjelper vektor i et siste volum på 100 µL DMEM medium.
- For hver reprogramming faktor, forberede 300 µL av romtemperatur (RT) DMEM i et sterilt polystyren rør og nøye legge til 27 µL av kommersielle transfection reagensen.
Merk: Hva reagensen skal bringes til RT før bruk og legges direkte til medium som de elektrostatiske egenskapene til sammensatt kan gjøre det holde seg til plast veggen av røret. - Legg plasmider blandingen inn i hva reagens inneholder røret, vortex kort og ruge transfection reagens-DNA blandingen i 15 min på RT. kort virvle blandingen og legge den dropwise til retroviral emballasje cellene slik at transfection reagens-DNA blandingen er jevnt spredt over kultur og ruge på 37 ° C over natten.
- 24 timer etter transfection, endre mediet til DMEM med 20% FBS og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. 48 timer etter transfection, samle nedbryting og filtrere det gjennom filtere 0.22 µm pore-størrelse sprøyten.
Merk: Viral supernatants kan være frosset-80 ° c og holdt til nødvendig, selv om signaltransduksjon er mer effektivt hvis frisk viral nedbryting brukes.
3. GTLM signaltransduksjon og IOP harvest
- Frø halen tips fibroblaster 1 × 104 celler/cm2 på 0,1% gelatin pre-belagt retter i ligger medium og ruge ved 37 ° C i 24 timer.
- Dagen forberede en signaltransduksjon blanding som følger.
- Legge til 1 volumet av viral nedbryting for hver reprogramming faktor med 4 µg/mL retroviral infeksjon reagens (40%) 6 mengder ligger medium (60%).
- For en 10 cm rett av fibroblaster, legge 1 mL av hver viral nedbryting (4 × virus = 4 mL) supplert med 4 µg/mL retroviral infeksjon reagens til 6 mL av ligger medium, gir totalt 10 mL signaltransduksjon blanding.
- Sug opp ligger mediet fibroblast kultur og erstatte den med signaltransduksjon blanding. Inkuber signaltransduksjon 4 h på 37 ° C i hypoxic forhold (5% CO2 og 4% O2).
- Sug opp signaltransduksjon blandingen og erstatte den med ferske omprogrammering medium (Serum-free ekspansjon medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/Streptomycin, 100 ng/mL murine stamcelleforskningen faktor (mSCF), 10 ng/mL murine interleukin-3 (IL3), 2 U/mL menneskelige rekombinant Erytropoietin (hrEPO) og 100 nM Dexamethasone).
- Inkuber for 8 daysat 37 ° C i hypoxic forhold, legge frisk omprogrammering medium hver 2 dager. Etter fem til åtte dager, vil vellykket omprogrammering gi klynger av celler som har løsrevet fra platen.
- For å samle omprogrammeres celler for analyse, Pipetter forsiktig opp og ned for å høste dem direkte fra parabolen. For å høste untransduced fibroblaster for sammenligning, distansere cellene fra platen med 1 x trypsin-EDTA og samle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi en reproduserbar protokoll for produksjon av iEPs fra voksen fibroblaster med transkripsjon faktor-drevet DLR. Vi evaluerer celle omprogrammering med flowcytometri colony-forming analyser og gene expression analyse. For å bistå i visualisering av konverteringen til erythroid celle skjebne, vi utført omprogrammering på fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus (Epor- grobunn R26- eYFP) som express gule fluorescerende protein (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler som uttrykker erytropoietin reseptoren (Epor, grobunn banket inn en allelet av endogene Epor locus) transkripsjon av deres utvikling12,13 ( Figur 1A). Etter vellykket omprogrammering av indusert erythroid progenitors, er YFP positive (EpoR +) celler observerbare så tidlig som fem dager etter signaltransduksjon. Dag 5 med reprogramming, celler bli runde, løft fra overflaten av platen og begynn å forme klynger. Dag 5-iEPs viser en erythroid forløper-lignende morfologi, som har en karakteristisk sentrale kjernen, grov chromatin og blå cytoplasma etter mai-Grünwald-Giemsa flekker (figur 1C). Hemoglobinization av noen celler er tydelig ved positive benzidine flekker og et mildt røde utseende når pelleted (Figur 1 d-E). I tillegg en liten brøkdel av dag 5-iEPs co express YFP og erythroid-spesifikke overflaten markøren Ter119 (figur 1F). Dag 8, kan store YFP + klynger sees. Dag 8iEPs presentere en mer differensiert erythroid fenotypen enn dag 5 iEPs; de er betydelig mindre, har samlet mer hemoglobin, og viser også betydelig upregulated uttrykk for Ter119 (figur 1B-1 G). Cyto-spinn på dag 8-iEPs avsløre erythroid-lignende morfologi, mens svært få enucleated reticulocytes er observert (figur 1H).
Gene expression analyse av kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) i bulk iEPs samlet på dag 8 viser at de har nesten nedleggelse uttrykk for fibroblast gener og har upregulated mange erythroid gener inkludert globin gener, hovedsakelig uttrykke embryonale typer (figur 1jeg). For å vurdere om omprogrammeres cellene overgang gjennom multipotent progenitors, vi utført en gang kurs og analysert uttrykk for blodkreft markører gjennom omprogrammering. Vi har tidligere rapportert at erythroid forløper utgang var høyest på dag 6, etterfulgt av dag 8 med 10,5% ± 4,6% og 6,6% ± 0,5% av lever YFP + celler uttrykke co CD71 og Ter119, henholdsvis10. Det er også en befolkning på CD41 positive celler før utseendet av Ter119 positive celler. C-kit verken CD45 markører, som uttrykkes vanligvis i blodkreft stamfar og downregulated i erythropoiesis, uttrykkes på noe punkt i den omprogrammering (figur 1J). Disse data tyder på at cellene ikke går gjennom en multipotent blodkreft stamfar eller tidligere stadium, men gjøre kanskje overgang gjennom en megakaryocyte-erythroid stamfar.
En pålitelig måte å vurdere effektiviteten av den omprogrammering er å utføre BFU-E colony-forming analyser på omprogrammeres cellene. In vitro differensiering kapasitet på dag 5- og dag 8-iEPs ble assayed i methylcellulose med menneskelige erytropoietin murine stamcelleforskningen faktor og deksametason. Etter 8 dager, iEPs dannet to typer kolonier: tydelig rød (rød IOP) og ikke synlig rød (ikke-rød IOP). Når celler fra røde koloniene vises erythroblast morfologi, ligner ikke erythroid celler, celler fra ikke-rød kolonier og var uregelmessig, hadde store dyp blå og detaljert cytoplasma (figur 2A).
Dag 5-iEPs dannet ca 1 i 1000 røde kolonier, mens bare ca 1:10,000 dag 8-iEPs dannet røde koloniene, med en mye høyere andel av ikke-rød kolonier dannet (figur 2B). Denne reduksjonen i colony-forming evne mellom dag 5- og dag 8-iEPs kunne forklart byiEPs gjennomgår differensiering fra dager 5-8 og GTLM uttrykk vektorer lider stanse over tid. qPCR analyse bekreftet at uttrykk for eksogene transkripsjon reduserer betydelig fra dager 5 til 8. Som forventet i vellykket omprogrammering, uttrykk nivåer av endogen Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc hjulpet, men endogene Lmo2 uttrykk er bare veldig ydmyk uttrykt (figur 2C).
Et punkt av notatet, og en begrensning av analysen, er at ikke-rød kolonier som inneholder macrophage som cellene tallmessig røde hemoglobinized IOP koloniene dannet av omprogrammeres fibroblaster i colony-forming analyser. Colony-forming muligheten til å lage røde IOP kolonier kan forbedres ved å endre stoichiometric prosenter av GTLM faktorer. Transducing cellene med doble av Tal1 og Lmo2 uttrykk vektorer førte til en svak økning i andelen røde kolonier over ikke-rød kolonier, mens ekstra Gata1 førte til en betydelig økning i dannelsen av røde kolonier og nesten en fullstendig eliminering av ikke-rød kolonier støtter den viktige rollen for disse faktorene i erythropoiesis (figur 2D). Interessant, øker øker uttrykk for c-Myc drastisk produksjonen av ikke-rød kolonier tross uunnværlig omprogrammere. For å få ren indusert erythroid progenitors for nedstrøms, kan kolonier isoleres fra colony-forming analyser. Vi utførte gene expression analyse i form av microarray røde og ikke-rød kolonier fra dag 5-iEPs og koloniene 14,5 dager legge samleie (PPC) fetal leveren (FL) og voksne benmargen (BM) for sammenligning. Microarray data er tilgjengelig gjennom NCBI'S Gene Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Vi har tidligere vist at red-IOP kolonier ligner bona fide erythroid koloniene (FL og BM) med gene expression10. Undersøkelse av uttrykk for Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc i hver kolonien viser at mens de røde koloniene viser samme nivå uttrykk for alle fire faktorer FL og BM, ikke-rød kolonier har lavere uttrykk for alle faktorer, spesielt Gata1 (figur 2E). For å forstå hva er de ikke-rød koloniene som inneholder macrophage som cellene, vi kartlagt uttrykk for celle type-spesifikk gener i hver koloni fra microarray data. Som tidligere rapportert uttrykke røde koloniene mange erythroid-spesifikke gener, ligner på FL og BM. Etter revisiting dataene, er det klart at de ikke-rød koloniene viser høy uttrykk for en rekke gener karakteristiske macrophage celler14 (figur 2F). Verken rød eller ikke-rød kolonier viser betydelig økt uttrykk for typiske megakaryocyte gener15. Sammen tyder disse data på at de ikke-rød koloniene nærmere ligner makrofager enn erytrocytter. Siden ikke-rød koloniene er aldri observert når en av faktorene GTLM fjernes synes disse macrophage som cellene å dannes når uttrykket nivåer av ett eller flere av reprogramming faktorene Gata1, Tal1, Lmo2 er lavere enn nødvendig omprogrammere til iEPs. Sammen tyder dette på at uttrykket nivåene av alle fire GTLM faktorer er viktige i TTF til IOP omprogrammering og at heterogenitet er forklart av ufullstendig omprogrammering individuelle celler, som potensielt kan korrigeres ved å justere stoichiometric forhold.
For å vurdere effektivitet og robusthet av våre protokollen, vi testet evne til angitt antall fibroblaster å produsere synlig klynger av IOP celler etter 5 dager når kultivert i 384-og plater. Vi fastslått at ut av 24 transductions 20, 30, 40 og 50 TTFs, antall brønner med minst én IOP klynge var 3 (0,6% av plater fibroblaster), 15 (2.0% av plater fibroblaster), 15 (1,6% av plater fibroblaster) og 13 (1,1% av plater fibroblaster) , henholdsvis. Dette tyder på at GLTM IOP omprogrammering er en robust og pålitelig prosess som kan nå en effektivitet på 1%.
Andre faktorer som kan påvirke effektiviteten av omprogrammering inkluderer du passering av fibroblaster og kultur forhold. Vi sammenlignet reprogramming effektiviteten av TTFs som hadde vært passaged tre ganger eller ni ganger før signaltransduksjon. TTFs som hadde vært passaged ni ganger (P9) viste en dramatisk reduksjon i evnen til å produsere klynger av iEPs (Figur 3A). Interessant, inkludering av serum i reprogramming media helt blokker reprogramming, erstatte serum med erythroid cytokiner er nødvendig for å tillate transduced faktorer å kjøre nye cellen skjebnen uten compounding signaler fra serum. Fjerning av serum og uttrykk for nye faktorer i cellen er sannsynlig å være stressende på cellene. Faktisk økte blokkerer p53 aktivisering sterkt antallet iEPs generert. Denne effekten kan også sees i omprogrammering av p53 knockout fibroblaster (Figur 3B-D). Hemming av p53 signalering fører til mer overlevelse og bedre omprogrammering og er en godkjent metode for å forbedre avkastningen. Endelig er omprogrammering hypoxic forhold gunstig, men ikke avgjørende for IOP produksjon. Men transduced TTFs dyrket i normoxia er mye tregere til å omprogrammere og IOP klynger er observert etter 10 dager i stedet for fem til åtte dager (Figur 3E).
Figur 1 : Tvunget uttrykk for Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc omprogrammerer murine voksen fibroblaster til erythroid progenitors som viser egenskapene bona fide erythroid celler. (A) eksperimentell design transkripsjon faktor-mediert omprogrammere av erythroid reporter (Epor-grobunn R26-eYFP) hale tips fibroblaster (TTF) EpoR + omprogrammeres celler. (B-F) Gang løpet av IOP generasjon av untransduced TTFs (dag 0) og bulk GTLM-transduced TTFs på dager 5 og 8 (representant n = 2-3). Transdifferentiation ble evaluert av (B) live-celle, lyse-feltet bilder enkelt brønner (skala bar, 50 µm); (C) mai-Grünwald - Giemsa flekker cyto-spinn (skala bar, 20 µm); (D) Benzidine/Giemsa flekker cyto-spinn (skala bar, 20 µm); (E) makroskopisk inspeksjon av cellen pellets; og (F) representant flowcytometri plotter viser YFP / Ter119 uttrykk. (G) Cell diameter på iEPs høstes på dager 5 og 8 målt fra flere cyto-spinn lysbilder, viser en nedgang i cellestørrelsen på dag 8. Dataene presenteres som betyr ± SD (n = 21-25); p ≤ 0,0001 av kortet t-test. (H) representant høyoppløselig benzidine/Giemsa bilder av GTLM-transduced TTFs på dag 8. Skala bar, 5 µm. (I) Relative mRNA uttrykket av relevante fibroblast - og erythroid-spesifikk gener inkludert globin gener untransduced TTFs (grå kolonner) versus samtidig GTLM-transduced TTFs (røde kolonner) på dag 8, bestemmes av qPCR. Dataene presenteres som betyr ± SD (n = 4-6 for iEPs, n = 2 for untransduced TTFs). (J) graf som viser Sammendrag av tid-retters flyt cytometri analyse av untransduced TTF (dag 0) og bulk GTLM-transduced TTF høstet på dag 2, 4, 6 og 8 viser YFP, CD45, CD71 og Ter119 (n = 3). Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SD. figur er tilpasset fra Capellera-Garcia S, et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : GTLM iEPs produsere røde og ikke-rød koloniene i BFU-E kolonien analyser. (A) representant lyse-feltet og mai-Grünwald-Giemsa cytospin bilder av IOP-avledet rødt og ikke-rød kolonier. Skalere barer, 50 µm (kolonien bilder) og 10 µm (cyto-rotere bilder). (B) kolonien teller generert fra belagt untransduced TTFs, bulk dag 5 iEPs og bulk dag 8. Dataene presenteres som betyr ± SD (n = 3); p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 av toveis VARIANSANALYSE. (C) Relative mRNA uttrykk for Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc i untransduced TTF og bulk GTLM-transduced TTF høstes ved 5 og dagen 8, bestemmes av qPCR. Primere ble utformet slik at endogene uttrykk kan skilles fra totale uttrykket. Dataene presenteres som betyr ± SD (n = 4-6 for iEPs, n = 2 for untransduced TTF). (D) kolonien teller generert fra belagt untransduced TTFs og bulk dag 5 iEPs generert ved å doble forholdet mellom hver av de GTLM faktorene. Dataene presenteres som betyr ± SD (n = 3); ** p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 av toveis VARIANSANALYSE. (E) Relative uttrykk for Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc untransduced fibroblaster og plukket kolonier generert fra GTLM-transduced iEPs (røde og ikke-rød), 14,5 dpc fosterets leveren og voksen bein marg, bestemmes av microarray. Dataene presenteres som betyr ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 av toveis VARIANSANALYSE. (F) Relative uttrykk for valgte gener kjent for sine uttrykk i erythroid (øverst), megakaryocyte (midten) og macrophage (nederst) celler i untransduced fibroblaster og plukket kolonier generert fra GTLM-transduced iEPs (røde og ikke-rød), 14.5dpc fosterets leveren og voksen benmargen, bestemmes av microarray. Dataene presenteres som betyr ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 av toveis VARIANSANALYSE. Figur er tilpasset fra Capellera-Garcia S, et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : GTLM omprogrammering er en robust og pålitelig prosess. (A) fremstilling av antallet klynger observert fra 10.000 TTFs og representant bilder på dag 5 av GTLM omprogrammering av hale tips fibroblaster (TTF) som har gjennomgått tre passasjer (P3) eller ni passasjer (P9) før omprogrammering. Dataene presenteres som betyr ± SD (n = 6); skala barer er 50 µm. (B-D) representant bilder av IOP klynger 6 dager etter (B) GTLM omprogrammering av hale tips fibroblaster; (C) GTLM omprogrammering av TTFs med tillegg av p53DN uttrykk vektor; (D) GTLM omprogrammering av p53 knockout TTFs (skala barer = 50 µm). (E) representant bilder av IOP klynger etter 10 dager med GTLM reprogramming utført på normoxic forhold (skala bar = 50 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overuttrykte en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er nok å omprogrammere murine og menneskelig fibroblaster direkte til iEPs10. Omprogrammeres erythroid cellene sterkt lignet bona fide erythroid progenitors morfologi, fenotype, genuttrykk og colony-forming evne. Dette funnet bekrefter begrunnelsen av benytter direkte omprogrammering som et verktøy for å definere utviklingsmessige faktorer i hematopoiesis. For å støtte gyldigheten av denne metoden, kan iEPs også genereres gjennom GTLM induksjon av mus embryonale fibroblaster og menneskelige foreskin fibroblaster, viser at det fungerer for fibroblaster av ulike opphav og arter10. I denne rapporten induserer vi omprogrammering av fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing musen som et verktøy for å visualisere konvertering til en erythroid celle. Bruk av denne musen er nyttig, men ikke avgjørende for protokollen. Vi rutinemessig utføre omprogrammering bruker flere typer fibroblast fra ulike musen stammer og identifisere iEPs av cellen overflaten markør uttrykk for Ter119 og CD71.
Vår nåværende metoden genererer iEPs som viser en primitiv erythroid fenotypen i motsetning til en definitiv voksen fenotypen. En stor forskjell mellom disse faser av utviklingen er uttrykk for forskjellige globin gener. Vi har imidlertid vist at tillegg av Klf1 og Myb å GTLM cocktail endringer iEPs' globin uttrykksmønster hovedsakelig embryonale til hovedsakelig voksen10,14. Interessant, skjevheter tillegg av Gata2 og Runx1 til fire-faktor cocktail og thrombopoietin i medium reprogramming prosessen mot megakaryocytic avstamning16.
GTLM-indusert iEPs produserer erythroid progenitors med en primitiv gene expression signatur og begrenset proliferativ kapasitet. Videre, iEPs produserer svært få enucleated erytrocytter. Dårlig erythroid stamfar utvidelsen er forklart av å omprogrammere kit + definitive erythroid celler, som potensielt kan oppnås med tillegg av andre faktorer inducing direkte reprogrammering å iEPs med en definitiv genuttrykk programmet.
Våre data tyder også dårlig enucleation effektivitet er forklart av det faktum GTLM-indusert iEPs generere forløpere med en enkel, i stedet for en definitiv gene expression program. Flere forsøk på å optimere oppdrettsforholdene ble forsøkt uten forbedret enucleation. Pågående forsøk på å øke både stamfar spredning og enucleation effektivitet er derfor fokusert på å identifisere mangler faktorer for inducing reprogrammering å endelig iEPs.
For optimal produksjon av røde IOP kolonier er det viktig at cellene er transduced med alle fire vektorer og GTL gener som er uttrykt på høye nivåer. Dessverre tillater for øyeblikket mest effektive metoden ikke tidligere kontroll over vektor titers. Et forsøk på å forbedre effektiviteten ved hjelp av bicistronic lentiviral vektorer var ikke vellykket, muligens på grunn av problemer med dårlig støkiometri eller utilstrekkelig uttrykk nivåer. Mens arbeides å forbedre omprogrammering vektorer, produsert mest effektive metoden restene nymalt kombinasjoner av vektor nedbryting med tidligere beskrevet retroviral vektorer uttrykke bare én faktor og ingen utvalg markør genet.
GTLM reprogrammering å iEPs er bare rapportert protokollen kunne produsere erythroid stamfar-lignende celler fra en forpliktet somatisk cell. Som en forskning verktøyet DLR IOP metoden derfor har flere fordeler sammenlignet med andre erythroid celle modellsystemer som erythroid cellen linjer HiDEPs/HuDEP celler (PMID: 23533656)17. Mens HiDEPs/HuDEP celler er mer praktisk verktøy for storskala røde blodlegemer produksjon og evaluere gen funksjon under terminal erythropoiesis, er den unike fordelen av GTLM reprogrammering å iEPs muligheten til direkte studie av kjernen transcriptional programmer bestemme erythroid celle skjebne. GTLM omprogrammering gir en uvurderlig plattform for å studere begge erythropoiesis hos mennesker og mus, for eksempel for å studere skifte mellom primitive og endelig erythropoiesis. Forstå denne bryteren er av stor interesse for potensielle behandling av hemoglobinopathies, som sigdcelleanemi, der forskere som strever for å reversere bytte hos voksne fetal hemoglobin å dempe sykdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse til rapporten.
Acknowledgments
Vi takker Evelyn Wang og Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) for kloning og Harvey Lodish (Whitehead Institute) for å gi mange av plasmider brukes til å generere retroviral biblioteket. Vi takker Kavitha Siva og Sofie Singbrant (Institutt for molekylær medisin og Gene Therapy, Lund universitet), Göran Karlsson og Shamit Soneji (Institutt for molekylær hematologi, Lund universitet) for sine roller i Beskrivelse av IOP produksjon. Vi ønsker også å erkjenne og takke Julian Pulecio (sentrum av regenerativ medisin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Institute for Medical Research og Institutt for medisin, St. Vincent sykehuset, University of Melbourne), Ángel Raya (katalansk institusjon for forskning og studier, Barcelona) og Vijay G. Sankaran (bred Institute av Massachusetts Institute of Technology og Harvard, Cambridge ) for sine tidligere bidrag til dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av Ragnar Söderberg Foundation (til J.F.); Svenske Forskningsrådet (til J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (å J.F.); Svenske stiftelsen til strategisk forskning (til J.F.); Åke Wiberg Foundation (til J.F.); Marie Curie integrering stipend (til J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
