Summary
Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).
Abstract
Diferenciação e compromisso de célula eritroide proceder através da ativação de uma rede de linhagem restrita transcriptional orquestrada por um grupo de destino célula determinando e fatores de maturação. Estabelecemos anteriormente para definir um conjunto mínimo de factores necessários para instruir o desenvolvimento de células vermelhas do sangue, usando a linhagem direta reprogramação de fibroblastos em eritroide induzido progenitores/precursores (iEPs). Nós mostramos a superexpressão de Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) podem rapidamente converter murino e humano fibroblastos diretamente para iEPs que se assemelham a bona fide eritroide de células em termos de morfologia, fenótipo, e expressão gênica. Pretendemos que iEPs irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar o Regulamento de eritropoiese e célula de destino. Aqui descrevemos o processo gradual de conversão de fibroblastos de ponta de cauda murino em iEPs através da transcrição orientada por fator linhagem direta reprogramação (DLR). Neste exemplo, podemos realizar a reprogramação de fibroblastos de camundongos de linhagem traçagem eritroide que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) sob o controle do promotor eritropoietina receptor gene (EpoR), permitindo a visualização da célula eritroide indução de destino após reprogramação. Na sequência deste protocolo, os fibroblastos podem ser reprogramados em iEPs dentro de cinco a oito dias.
Enquanto melhorias ainda podem ser feitas para o processo, nós mostramos que mediada por GTLM reprogramação é um processo rápido e directo, produzindo células com propriedades de bona fide células progenitoras e precursor de eritroide.
Introduction
Glóbulos vermelhos (hemácias) são essenciais em todos os vertebrados e somam 84% de todas as células do corpo humano1. De embrionário para a vida adulta, nossa saúde é altamente dependente de regulação exata da homeostase de RBC. A produção contínua de hemácias maduras durante todo o desenvolvimento na idade adulta é conhecida como eritropoiese. Um grande desafio na pesquisa de eritropoiese é definir os mestre reguladores que coordene o desenvolvimento de RBC e o interruptor entre eritropoiese primitivo e definitivo. Reprogramação de linhagem direta dos progenitores eritroide apresenta uma oportunidade de entender melhor eritroide desenvolvimento em vivo.
Linhagem direta reprogramação (DLR), também conhecido como transdiferenciação celular, é o processo de reprogramação de um tipo de célula diretamente em outro, ignorando pluripotentes e multipotentes progenitoras estágios. DLR até agora tem sido usado para produzir vários tipos de células, incluindo neural2e nefrótica7, células progenitoras hematopoiéticas3,4,5, hepática6 . Para os biólogos do desenvolvimento, DLR tornou-se uma ferramenta importante para interrogar os aspectos de compromisso linhagem e processos de diferenciação terminal8,9. DLR pode complementar e substituir parcialmente na vivo estudos para mecanismos de compreensão do destino célula fatores determinantes durante o desenvolvimento. O protocolo DLR para reprogramação de progenitores eritroide descritos neste artigo fornece o campo um método complementar para estudos do desenvolvimento da eritropoiese.
Nós demonstramos anteriormente que a superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente de progenitores eritroide induzida (iEPs) 10. the GTLM-reprogramado eritroide células assemelham-se grandemente bona fide eritroide primitivo progenitores em termos de morfologia, fenótipo e gene expressão10. Assim iEPs tem limitada capacidade de proliferação e amadurecer-se hemácias nucleadas similares àqueles produzidos transitoriamente no embrião precoce antes do início da eritropoiese definitivo. Fazendo alterações nas condições de reprogramação (por exemplo, mutações pontuais em reprogramação fatores ou adição de outros factores), pode-se entender como isso leva a alterações no desenvolvimento eritroide e diferenciação. Por exemplo mostramos que a adição de Klf1 ou Myb ao coquetel GTLM altera o padrão de expressão de globina de predominantemente embrionário (primitivo) para principalmente adultos (definitivo). Esta constatação corrobora a validade do uso de DLR como uma ferramenta para a definição de fatores do desenvolvimento na eritropoiese.
Aqui, podemos descrever o processo de geração iEPs de fibroblastos de ponta de cauda de rato (TTF). Em nossos resultados representativos, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expressam a proteína fluorescente amarela (eYFP) do locus Rosa26 em todas as células que expressaram o receptor de eritropoetina, permitindo a fácil visualização do compromisso com a linhagem eritroide. Usando esse método, YFP positivo (EpoR +) células estão presentes logo em cinco dias depois de transdução. Este protocolo, portanto, oferece uma técnica rápida e robusta para a geração de eritroide progenitores em vitro.
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Protocol
1. estabelecimento e manutenção da cauda do rato principal dica culturas de fibroblastos
- Prepare pratos de gelatina-revestido (recomendo um prato de 10 cm para uma cauda), cobrindo a superfície com 0.1% de gelatina e incubando os pratos por aproximadamente 20 min a 37 ° C. Aspirar a solução de gelatina do prato e deixe-o secar pelo menos 2 h.
- Eutanásia em ratos por deslocamento cervical. Retire o rabo com uma tesoura, corte na base da cauda. Coloque o rabo no fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 2% de soro fetal bovino (FBS) até estar pronto para usar.
Nota: Para os melhores resultados, caudas devem ser tomadas de ratos em torno de 6 a 8 semanas de idade. Caudas podem ser tomadas de ratos mais de 8 semanas de idade, no entanto, como a idade de camundongos, a capacidade de proliferação dos fibroblastos e a eficiência de reprogramação diminuição11. - Execute todas as etapas subsequentes do presente protocolo em uma capa de tecido cultura sob condições estéreis. Preparar uma solução diluída de tripsina de 0,02% do trypsin-EDTA em DPBS e adicionar 5 mL em um prato sem revestimento 10 cm.
- Lave o rabo, primeiro em etanol a 70% e, em seguida, em DPBS. Em um prato, coloque a cauda plana e usar fórceps para prendê-lo no lugar. Fazer uma incisão na cauda ao longo do eixo longitudinal da base até a ponta.
- Segure a cauda com um par de pinças e segurá-lo na vertical. Usando um segundo par de pinças, agarre a pele ao lado da incisão na base da cauda e descascá-lo de volta. Fazer isso em ambos os lados da incisão até que a pele pode ser removida, puxando para baixo em direção a ponta da cauda.
- Segure o rabo pelado com pinça sobre o prato que contém a solução de tripsina e cortar a cauda pedaços aproximadamente 1 cm longo. Com as peças de cauda na solução de tripsina, use tesoura para fragmentar as peças em partes menores. Incube as peças de cauda na solução de tripsina a 37 ° C por 10 min.
Nota: As peças menores são preferidas por forma a fornecer a cada peça uma área de superfície elevada à relação do volume. - Saciar a tripsina usando 2 volumes de meio de expansão (FEX) de fibroblasto (alta-glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 15% FBS, 2 mM L-glutamina, aminoácidos não essenciais (timina) e 100 U/mL penicilina/estreptomicina).
- Coletar todo o conteúdo do prato em um tubo de 50 mL e centrifugar 350 × g por 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os fragmentos de cauda em 10 mL de meio fresco FEX.
- Transferência de fragmentos de cauda em meio a um prato de gelatina-revestido e incubar a 37 ° C em 5% de CO2 e 4% O2, acrescentando meio fresco FEX a cada 2 dias.
Nota: Depois de cinco a sete dias, fragmentos de cauda Anexei no fundo do prato e fibroblastos podem ser vistos afastando-os. - Uma vez que os clusters de fibroblastos são identificados, agite suavemente o prato para desalojar as peças de cauda e aspire o meio e todos os fragmentos de osso, deixando os fibroblastos anexados à placa. Adicionar novo meio FEX e cultura de fibroblastos até confluente.
- Para garantir a não contaminação dos fibroblastos pelos progenitores hematopoiéticos, dissociar as células da placa usando 1 x do trypsin-EDTA por 5 minutos e coletar as células. Empobrecem para células expressando marcadores hematopoiéticas (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 e Ter-119) usando um sistema de separação magnética10.
2. retrovírus produção
- Células de empacotamento retroviral em aproximadamente 2,5 × 104 células/cm2 (2,0 × 106 células para um prato de 10 cm) em um prato de cultura de tecido-tratada (por vácuo-gás plasma) e a cultura durante a noite em alta-glicose DMEM com 10% de sementes FBS, 10mm de sódio Piruvato e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em 37 ° C e 5% de CO2.
- Na manhã seguinte, altere o meio para DMEM sem aditivos usando metade do volume utilizado para a cultura durante a noite (5 mL para um prato de 10 cm). À tarde, verifique se as células são 70-80% de confluencia e começam o transfeccao.
- Para cada fator de reprogramação, Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc, prepare uma mistura de 2:1 do vetor de expressão (pMX) e vetor auxiliar (contendo genes gag e pol). Por um prato de 10cm de fibroblastos, use 6 µ g de vetor de expressão e de 3 µ g do vetor auxiliar em um volume final de 100 µ l em meio DMEM.
- Para cada fator de reprogramação, preparar 300 µ l de temperatura (RT) DMEM em um tubo estéril de poliestireno e cuidadosamente adicionar 27 µ l de reagente de transfeccao comercial.
Nota: O reagente de transfeccao deveria ser trazido para RT antes do uso e deve ser adicionado diretamente no meio de como as propriedades eletrostáticas do composto podem torná-lo a furar a parede do tubo plástica. - Adicione a mistura do plasmídeo no tubo de contendo reagente de transfeccao, vórtice brevemente e incubar a mistura de reagente-DNA de Transfeccao para 15 min no RT. brevemente vórtice a mistura e adicioná-lo para as células de empacotamento retroviral gota a gota para que o transfection mistura de reagente-DNA é espalhada uniformemente sobre a cultura e incubar a 37 ° C durante a noite.
- 24 h após a transfeccao, mudar o meio de DMEM com 20% FBS e 100 U/mL penicilina/estreptomicina. 48 h após a transfeccao, recolher o sobrenadante e filtrar através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,22 µm.
Nota: Sobrenadantes Viral podem ser congelados a-80 ° C e mantidos até necessária, embora transdução é mais eficiente se o sobrenadante viral fresco é usado.
3. transdução GTLM e colheita do iEP
- Semente a cauda dica fibroblastos de 1 × 104 células/cm2 em 0,1% gelatina pré-revestido pratos no meio de FEX e incuba a 37 ° C por 24 h.
- No dia seguinte, prepare uma mistura de transdução como segue.
- Adicione 1 volume de sobrenadante viral para cada fator reprogramação suplementado com 4 µ g/mL de reagente de infecção retroviral (40%) para 6 volumes de meio FEX (60%).
- Por um prato de 10cm de fibroblastos, adicionar 1 mL de cada sobrenadante viral (4 × vírus = 4 mL) suplementado com 4 µ g/mL de reagente de infecção retroviral para 6 mL de meio FEX, dando um total de 10 mL de mistura de transdução.
- Aspire médio FEX de cultura de fibroblasto e substituí-lo com a mistura de transdução. Incube a transdução por 4 h a 37 ° C em condições de hipóxicos (5% de CO2 e 4% O2).
- Aspirar a mistura de transdução e substituí-lo por meio de reprogramação fresco (média de expansão livre de soro (SFEM), 100 U/mLPenicillin/estreptomicina, 100 ng/mL murino Stem Cell Factor (mSCF), interleucina-3 de 10 ng/mL murino (IL3), 2 recombinante humana de U/mL Eritropoietina (hrEPO) e 100 nM dexametasona).
- Incube durante 8 dias 37 ° C em condições de hipóxicos, adicionando meio reprogramação fresco a cada 2 dias. Depois de cinco a oito dias, reprogramação bem sucedida irá produzir aglomerados de células que têm destacado da placa.
- Para coletar as células reprogramadas para análise, delicadamente Pipete acima e para baixo para colhê-las diretamente do prato. Colher os fibroblastos untransduced para comparação, dissociar as células da placa usando 1 x do trypsin-EDTA e recolher.
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Representative Results
Aqui nós apresentamos um protocolo pode ser reproduzido para a produção de iEPs de fibroblastos adultos usando DLR orientado para a fator de transcrição. Avaliamos que a reprogramação de células usando citometria de fluxo, formadoras ensaios e gene análise da expressão. Para auxiliar a visualização da conversão ao destino de célula eritroide, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expressam a proteína fluorescente amarela (eYFP) do locus Rosa26 em todas as células que expressam o receptor de eritropoetina (Epor, Cre que bateu em um alelo do locus Epor endógeno) transcrição em qualquer fase do seu desenvolvimento12,13 ( Figura 1A). Após reprogramação bem sucedida de induzida eritroide progenitores, YFP positivo (EpoR +) células são observáveis logo em cinco dias depois de transdução. No dia 5 de reprogramação, células tornam-se redondo, levantem-se da superfície da placa e começam a formar aglomerados. Dia 5-iEPs exibir uma morfologia de como precursor eritroide, que apresentam um característico núcleo central, cromatina grosseira e citoplasma azul após maio-Grünwald-Giemsa coloração (Figura 1C). Hemoglobinization de algumas células é evidente pela coloração positiva benzidina e uma aparência levemente vermelha quando peletizado (Figura 1-E). Além disso, uma pequena fração do dia 5-iEPs YFP express co e o marcador de superfície específicos eritroide Ter119 (Figura 1-F). No dia 8, grandes aglomerados YFP + podem ser vistos. Dia 8iEPs apresentam um fenótipo eritroide mais diferenciado do que dia 5 iEPs; Eles são significativamente menores, acumularam mais hemoglobina e também mostrar significativamente a expressão upregulated de Ter119 (figura 1B–1 G). Cito-rodadas do dia 8-iEPs revelaram eritroide, como morfologia, enquanto muito poucas reticulocytes sem núcleo são observados (Figura 1-H).
Análise da expressão de gene pela reacção em cadeia do polymerase quantitativa (qPCR) de granel iEPs recolhidos no dia 8 mostra que eles têm quase desligamento expressão de genes de fibroblasto e têm upregulated muitos genes eritroide, incluindo genes de globina, predominantemente expressando tipos embrionários (Figura 1eu). Para avaliar se as células reprogramadas transição através de progenitoras multipotentes, realizamos um curso de tempo e analisou a expressão dos marcadores hematopoiéticas em toda a reprogramação. Informamos anteriormente que saída de precursor eritroide foi mais alta no dia 6, seguido por dia 8, com 10,5% ± 4,6% e 6,6% ± 0,5% de células vivas YFP + co expressando CD71 e Ter119, respectivamente,10. Há também uma população de células positivas CD41 antes do aparecimento de células positivas Ter119. C-kit nem CD45 marcadores, que são normalmente expressos em progenitoras hematopoiéticas e ativador na eritropoiese, exprimem-se em qualquer ponto da reprogramação (Figura 1-J). Estes dados sugerem que as células não vão através de um progenitor hematopoiético multipotent ou fase anterior, porém fazer transição talvez através de um progenitor eritroide-megacariócito.
Uma maneira confiável para avaliar a eficiência da reprogramação é para realizar ensaios de formadoras de BFU-E sobre as células reprogramadas. Em vitro capacidade de diferenciação do dia 5 - e dia 8-iEPs foi analisada em metilcelulose suplementado com eritropoietina humana, fator de células-tronco murino e dexametasona. Após 8 dias, iEPs formado de dois tipos de colônias: distintamente vermelho (vermelho iEP) e não-visível vermelho (iEP não-vermelha). Enquanto as células das colônias vermelhas exibido morfologia eritroblasto, células de colônias não-vermelha não se assemelham a células eritroide e eram irregulares, tinham grande azul profundo e granular citoplasma(Figura 2).
Do dia 5-iEPs, aproximadamente 1 em cada 1.000 formaram colônias vermelhas, enquanto somente aproximadamente 1:10,000 dia 8-iEPs formaram colônias vermelhas, com uma proporção muito maior de colônias não-vermelha formada (Figura 2B). Esta redução em formadoras capacidade entre dia 5 - e dia 8-iEPs poderia ser explicado byiEPs passando por diferenciação de dias 5-8 e os vetores de expressão GTLM sofrimento silencioso ao longo do tempo. análise de qPCR confirmou que a expressão da transcrição exógena diminui significativamente de dias 5 a 8. Como esperado em reprogramação bem sucedida, os níveis de expressão de endógena Gata1 Tal1, Lmo2e c-Myc são induzidos, no entanto, endógena Lmo2 expressão apenas muito humilde expressa (Figura 2C).
Um ponto de observação e uma limitação do ensaio, são que não-vermelha colônias contendo macrófagos células superam as colônias vermelhas hemoglobinized iEP formadas por fibroblastos reprogramados em formadoras ensaios. Formadoras de capacidade de criar colônias iEP vermelho pode ser melhorada, alterando as proporções estequiométricas de fatores GTLM. Transducing as células com o dobro da quantidade de vetores de expressão Tal1 e Lmo2 levou a um ligeiro aumento na proporção de colônias vermelhas sobre colônias não-vermelha, enquanto extra Gata1 levou a um aumento significativo na formação de colônias vermelhas e quase uma eliminação completa de colônias não-vermelha apoiar o papel importante para estes fatores na eritropoiese (Figura 2D). Curiosamente, aumentando a expressão de c-Myc drasticamente aumenta a produção de colônias não-vermelha, apesar de ser indispensável para reprogramação. Para obter progenitores puro eritroide induzido para análise a jusante, colônias podem ser isoladas de ensaios os formadoras. Análise da expressão de genes foram realizadas sob a forma de microarray no vermelho e não-vermelha colônias de dia 5-iEPs e colônias de 14,5 dias pós coito (dpc) fígado fetal (FL) e da medula óssea adulta (BM) para comparação. Os dados de microarray são acessíveis através do NCBI Gene Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Anteriormente mostramos que vermelho-iEP colônias se assemelham a bona fide eritroide colônias (FL e BM) pela expressão de gene10. Análise da expressão de Gata1, Tal1, Lmo2 e c-Myc em cada colônia mostra que, enquanto as colônias vermelhas mostram níveis semelhantes de expressão de todos os quatro factores de FL e BM, colônias não-vermelha tem menor expressão de todos os fatores, especialmente Gata1 (Figura 2). Para entender o que são as colônias não-vermelha contendo células macrófagos, retomado a expressão de genes específicos do tipo de célula em cada tipo de colônia a partir dos dados de microarray. Como relatado anteriormente, as colônias vermelhas expressam muitos genes específicos eritroide, semelhantes de FL e BM. Depois de revisitar os dados, é evidente que as colônias não-vermelha mostram alta expressão de vários genes característicos de macrófagos células14 (Figura 2-F). Nem vermelhas, nem não-vermelha colônias mostram significativamente aumento da expressão do megacariócito típico genes15. Juntos, esses dados sugerem que as colônias não-vermelha mais se assemelham macrófagos de eritrócitos. Desde que não-vermelha colônias nunca são observadas quando um dos fatores GTLM são removidos destas células, como macrófagos parecem ser formada quando os níveis de expressão de um ou mais dos fatores reprogramação Gata1, Tal1, Lmo2 são inferiores necessário para reprogramação para iEPs. Juntos, isto sugere que os níveis de expressão de todos os quatro fatores GTLM são importantes em TTF para reprogramação do iEP e que a heterogeneidade é explicada pelo incompleto reprogramação de células individuais, que potencialmente podem ser corrigidas ajustando rácios estequiométricos.
Para avaliar a eficiência e robustez do nosso protocolo, testamos a capacidade de definidos números de fibroblastos para produzir visíveis aglomerados de células iEP após 5 dias quando cultivadas em placas de 384 poços. Determinamos que fora 24 transductions de 20, 30, 40 e 50 TTFs, o número de poços com pelo menos um iEP cluster foi 3 (0,6% de fibroblastos de placas), 15 (2,0% de fibroblastos de placas), 15 (1,6% de fibroblastos de placas) e 13 (1,1% de fibroblastos de placas) , respectivamente. Isso sugere que GLTM iEP reprogramação é um processo robusto e confiável que pode atingir uma eficiência de 1%.
Outros fatores que podem afetar a eficiência de reprogramação incluem o número de passagem de fibroblastos e as condições de cultura. Comparamos a eficiência de reprogramação do TTFs que tinham sido passadas três vezes ou nove vezes antes da transdução. O TTFs que tinha sido passado nove vezes (P9) mostrou uma drástica redução na capacidade de produzir aglomerados de iEPs(Figura 3). Curiosamente, inclusão de soro na mídia reprogramação completamente blocos reprogramação, substituindo o soro com citocinas eritroide é necessários para permitir que os fatores transduzidos dirigir o destino de celular novo sem sinais de composição do soro. Remoção do soro e a expressão de novos fatores dentro da célula é susceptível de ser estressante nas células. Com efeito, bloqueando a ativação de p53 grandemente aumentou o número de iEPs gerado. Este efeito também pode ser visto na reprogramação de fibroblastos de nocaute de p53 (Figura 3B-D). Inibição de p53 sinalização leva a mais sobrevivência e melhor reprogramação celular e é um método validado para melhorar o rendimento. Finalmente, reprogramação em condições de hipóxicos é favorável, mas não é vital para a produção do iEP. No entanto, cultivadas em normoxia transduzidas TTFs são muito mais lentos reprogramar e clusters de iEP são observados após 10 dias em vez de cinco a oito dias (Figura 3E).
Figura 1 : Expressão forçada de Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc reprograma murino fibroblastos adultos em progenitores eritroide que exibem propriedades de bona fide eritroide de células. (A) desenho Experimental para transcrição mediada por fator reprogramação do repórter eritroide (R26 Epor-Cre-eYFP) cauda ponta fibroblastos (TTF) para células EpoR + reprogramado. (B–F) Tempo de curso de geração de iEP do TTFs untransduced (dia 0) e a maioria GTLM-transfectadas o TTFs nos dias 5 e 8 (representante de n = 2-3). Transdiferenciação celular foi avaliada por (B) imagens de viver-pilha, brilhante-campo de poços único (escala bar, 50 µm); (C) - Giemsa do maio-Grünwald coloração cyto-rotação (barra de escala, 20 µm); (D) benzidina/Giemsa coloração cyto-rotação (barra de escala, 20 µm); (E) inspeção macroscópica de pelotas da célula; e citometria de fluxo representativo (F) parcelas mostrando YFP / Ter119 expressão. (G) diâmetro de célula do iEPs colhidas nos dias 5 e 8 medido de vários slides cyto-rotação, mostrando uma diminuição no tamanho da célula no dia 8. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 21-25); p ≤ 0,0001 por unpaired t-teste. (H) representativa de alta resolução benzidina/Giemsa imagens de GTLM-transfectadas o TTFs no dia 8. Barra de escala, 5 µm. (I) a expressão de RNAm relativa dos genes relevantes do fibroblasto e eritroide específicos - incluindo genes da globina granel untransduced TTFs (colunas cinza) contra o TTFs GTLM-transfectadas (colunas vermelhas) no dia 8, determinados pelo qPCR. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 4-6 para iEPs, n = 2 para o TTFs untransduced). (J) gráfico mostrando Resumo da análise de citometria de fluxo de tempo-curso de untransduced TTF (dia 0) e o volume GTLM-transfectadas TTF colhida no dia 2, 4, 6 e 8, mostrando a expressão YFP, CD45, CD71 e Ter119 (n = 3). Os dados são apresentados como média ± SD. figura é uma adaptação de S de Capellera-Garcia, et al. 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : IEPs GTLM produzir colônias vermelhas e não-vermelha em ensaios de colônia BFU-E. (A) representante cytospin brilhante-campo e maio-Grünwald-Giemsa imagens do iEP-derivado vermelho e vermelho-não colónias. Escala de barras, 50 µm (imagens de Colônia) e 10 µm (imagens cyto-rotação). (B) contagens de colônia geradas a partir de TTFs untransduced chapeados, granel iEPs dia 5 e dia 8 a granel. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3); p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 por ANOVA de duas vias. (C) a expressão de RNAm relativo de Gata1, Tal1, Lmo2 e c-Myc no untransduced TTF e granel GTLM-transfectadas TTF colhidas no dia 5 e dia 8, determinado pelo qPCR. Primers foram desenhados para que a expressão endógena pode ser distinguida de expressão total. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 4-6 para iEPs, n = 2 para untransduced TTF). (D) geradas a partir de contagens de colônia chapeado untransduced TTFs e granel dia 5 iEPs geradas por duplicar a proporção de cada um dos fatores GTLM. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3); * * p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 por ANOVA de duas vias. (E) expressão relativa de Gata1, Tal1, Lmo2 e c-Myc em fibroblastos untransduced e colônias escolheu gerado a partir GTLM-transfectadas iEPs (vermelho e não-vermelha), 14,5 dpc fígado fetal e osso adulto medula, determinada por microarray. Os dados são apresentados como média ± DP; * p ≤ 0,05; * * p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 por ANOVA de duas vias. (F) expressão relativa dos genes selecionados conhecido por sua expressão em eritroide (topo), megacariócito (médio) e macrófagos células (inferior) em fibroblastos untransduced e escolheu colônias geradas a partir de GTLM-transfectadas iEPs (vermelho e não-vermelha), 14.5dpc fígado fetal e adulto da medula óssea, determinado por microarray. Os dados são apresentados como média ± DP; * p ≤ 0,05; * * p ≤ 0,005. p ≤ 0,0005; p ≤ 0,0001 por ANOVA de duas vias. A figura é uma adaptação de S de Capellera-Garcia, et al 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : GTLM reprogramação é um processo robusto e confiável. (A) gráfico do número de clusters observado de imagens representativas e 10.000 TTFs no dia 5 de GTLM reprogramação de fibroblastos de ponta de cauda (TTF) que foram submetidos a três passagens (P3) ou nove passagens (P9) antes da reprogramação. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 6); barras de escala são 50 µm. (B–D) fotos representativas do iEP clusters 6 dias após (B) GTLM reprogramação de fibroblastos de ponta de cauda; (C) GTLM reprogramação do TTFs com adição de vetor de expressão p53DN; (D) GTLM reprogramação de p53 nocaute TTFs (barras de escala = 50 µm). (E) fotos representativas dos clusters iEP após 10 dias de reprogramação GTLM realizado em condições normoxic (barra de escala = 50 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente ao iEPs10. As células reprogramadas eritroide assemelhava-se muito bona fide eritroide progenitores em termos de morfologia, fenótipo, expressão gênica e formadoras de capacidade. Esta constatação corrobora o raciocínio de usando a reprogramação direta como uma ferramenta para definir fatores do desenvolvimento na hematopoiese. Para oferecer suporte a validade deste método, iEPs também podem ser gerados usando indução GTLM de fibroblastos embrionários de rato e fibroblastos humanos prepúcio, mostrando que ele funciona para fibroblastos de diferentes origens e em toda espécie de10. Neste relatório, podemos induzir a reprogramação de fibroblastos do mouse eritroide linhagem de rastreamento como uma ferramenta para visualizar a conversão para uma célula eritroide. Uso deste rato é útil, mas não crítico para o protocolo. Nós rotineiramente realizar reprogramação usando vários tipos de fibroblasto de diversas variedades de rato e identificar iEPs pela expressão de marcador de superfície celular de Ter119 e CD71.
Nosso método atual gera iEPs que exibem um fenótipo eritroide primitivo em oposição a um fenótipo adulto definitivo. Uma diferença importante entre estas fases de desenvolvimento é a expressão de genes de globina diferentes. No entanto, mostramos que além de Klf1 e Myb a padrão de expressão dos iEPs cocktail alterações o GTLM globina de predominantemente embrionárias para principalmente adultos10,14. Curiosamente, a adição de Gata2 e Runx1 para o coquetel de quatro fatores e Trombopoietina no meio de preconceitos o processo de reprogramação para a linhagem megakaryocytic16.
Os iEPs induzida por GTLM produzir progenitores eritroide com uma assinatura de expressão do gene primitivo e uma limitada capacidade proliferativa. Além disso, os iEPs produzir poucas hemácias sem núcleo. A expansão do progenitor eritroide pobre é explicada pela incapacidade de reprogramar para células kit + eritroide definitivo, que potencialmente poderiam ser conseguidas com a adição de outros fatores, induzindo a reprogramação direta para iEPs com uma expressão de gene definitivo programa.
Nossos dados sugerem também eficiência pobre Enucleação é explicada pelo fato de iEPs induzida por GTLM gerar precursores com um primitivo, ao invés de um programa de expressão de gene definitivo. Várias tentativas de otimizar as condições de cultura foram tentadas sem Enucleação melhorada. Tentativas em curso para aumentar a eficiência de proliferação e Enucleação ambos os progenitor concentram-se, portanto, na identificação de fatores ausentes para induzir a reprogramação para iEPs definitivo.
Para a produção ideal de colônias iEP vermelho, é vital que as células são transfectadas com todos os quatro vetores e genes GTL são expressos em níveis elevados. Infelizmente o método atualmente mais eficiente não permite controle prévio de títulos de vetor. Uma tentativa de melhorar a eficiência usando vetores Lentivirus bicistronic não foi bem sucedida, possivelmente devido a problemas com níveis de expressão insuficiente ou inferior estequiometria. Enquanto o trabalho está em curso para melhorar a reprogramação de vetores, os restos de método mais eficientes usando combinações de recém produziram vector sobrenadante com os vetores retrovirais descritos anteriormente, expressando apenas um fator e nenhum gene marcador de seleção.
GTLM reprogramação para iEPs é o único protocolo de relatado capaz de produzir eritroide células progenitoras de uma célula somática comprometida. Como um método de iEP pesquisa ferramenta DLR, portanto, tem várias vantagens sobre outros eritroide celular sistemas modelo, tais como a célula eritroide linhas de células de HiDEPs/HuDEP (PMID: 23533656)17. Enquanto as células HiDEPs/HuDEP são ferramentas mais convenientes para a produção de eritrócitos em larga escala e avaliar a função dos genes durante a eritropoiese terminal, a única vantagem de GTLM reprogramação para iEPs é a capacidade de estudar diretamente do núcleo transcriptional programas determinar o destino de célula eritroide. GTLM reprogramação fornece uma plataforma inestimável para estudar ambos eritropoiese em seres humanos e mouse, por exemplo, para estudar o interruptor entre eritropoiese primitivo e definitivo. Compreender este interruptor é de enorme interesse no potencial tratamento de hemoglobinopatias, como Anemia falciforme, em que pesquisadores se esforçam reverter o interruptor no adultos a hemoglobina fetal para aliviar a doença.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse para o relatório.
Acknowledgments
Agradecemos Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonagem e Harvey Lodish (Instituto Whitehead) fornecendo muitos o plasmídeo utilizado para gerar a biblioteca retroviral. Agradecemos leiliane Siva e Sofie Singbrant (departamento de Medicina Molecular e Gene Therapy, Universidade de Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (departamento de Hematologia Molecular, Universidade de Lund) para os seus papéis na descrição da produção do iEP. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, parque de pesquisa biomédica de Barcelona), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, Nova Iorque), Carl Walkley (Instituto de pesquisa médica de St. Vincent e Departamento de medicina, Hospital de St. Vincent, Universidade de Melbourne), Ángel Raya (instituição catalã de investigação e estudos avançados, Barcelona) e G. de Vijay Sankaran (Broad Institute do Instituto de Massachusetts de tecnologia e Harvard, Cambridge ) por suas contribuições anteriores a este trabalho. Este trabalho foi financiado pela Fundação Ragnar Söderberg (a J.F.); o sueco de pesquisa Conselho (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (para J.F.); a Fundação sueca para a investigação estratégica (para J.F.); Fundação de Åke Wiberg (para J.F.); um subsídio de integração de Marie Curie (para J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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