Summary
Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).
Abstract
Diferenciación y compromiso de la célula eritroide proceden a través de la activación de una red transcripcional restringida linaje orquestada por un grupo de destino de la célula determinar y factores de maduración. Nos propusimos previamente para definir el conjunto mínimo de factores necesarios para instruir el desarrollo de glóbulos rojos con linaje directo la reprogramación de fibroblastos en inducido progenitores/los precursores eritroides (iEPs). Hemos demostrado que la sobreexpresión de Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc (GTLM) pueden rápidamente convertir murinas y humanas fibroblastos directamente al iEPs que se asemejan a las células eritroides de bona fide en términos de morfología, fenotipo, y expresión génica. Pretendemos que el iEPs proporcionará una valiosa herramienta para estudiar la regulación sino la eritropoyesis y de la célula. Aquí describimos el proceso gradual de conversión de fibroblastos de ratón cola punta en iEPs mediante transcripción basada en el factor directo linaje reprogramación (DLR). En este ejemplo, realizamos la reprogramación de fibroblastos de ratones de seguimiento del linaje eritroide que expresan la proteína amarilla fluorescente (YFP) bajo el control del promotor del gene (EpoR) receptor eritropoyetina, lo que permite la visualización de células eritroides inducción de destino sobre la reprogramación. Siguiendo este protocolo, pueden ser reprogramados fibroblastos en iEPs dentro de cinco a ocho días.
Mientras que todavía pueden introducirse mejoras al proceso, mostramos que GTLM-mediada reprogramación es un proceso rápido y directo, produciendo células con propiedades de buena fe las células progenitoras y precursoras eritroides.
Introduction
Glóbulos rojos (gr) son esenciales en todos los vertebrados y conforman el 84% de todas las células del cuerpo humano1. De embrión a la vida adulta, nuestra salud es altamente dependiente de la exacta regulación de la homeostasis de la RBC. La continua producción de glóbulos rojos maduros en todo el desarrollo en la edad adulta se conoce como eritropoyesis. Un desafío importante en la investigación de la eritropoyesis es definir los principales reguladores que orquestan el desarrollo de la RBC y el interruptor entre eritropoyesis primitiva y definitiva. Reprogramación de linaje directo de progenitores eritroides presenta una oportunidad para entiendo eritroides desarrollo in vivo.
Linaje directo reprogramación (DLR), también conocido como transdiferenciación, es el proceso de reprogramación de un tipo de célula directamente a otro, evitando pluripotenciales y progenitoras multipotentes etapas. DLR hasta el momento se ha utilizado para producir numerosos tipos de células incluyendo nervios2, hematopoyética3,4,5, hepática6 y nefrótico7, las células progenitoras. Para los biólogos del desarrollo, DLR se ha convertido en una herramienta importante para interrogar aspectos de linaje compromiso y procesos de diferenciación terminal8,9. DLR puede complementar y reemplazar parcialmente en vivo estudios de mecanismos de comprensión del destino celular factores determinantes durante el desarrollo. El protocolo DLR para reprogramación de progenitores eritroides que se describe en este artículo proporciona el campo un método gratuito para estudios del desarrollo de la eritropoyesis.
Previamente hemos demostrado que la sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a progenitores eritroides inducida (iEPs) 10. las células eritroides GTLM el reprogramado mucho se asemejan a bona fide primitivo eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo y gene expresión10. Así iEPs tienen una capacidad de proliferación limitada y madurar a eritrocitos nucleados similares a los producidos transitoriamente en el embrión antes del inicio de la eritropoyesis definitiva. Al hacer cambios en las condiciones de reprogramación (p. ej., mutaciones de punto en reprogramación factores o la adición de otros factores), uno puede entender cómo esto conduce a cambios en la diferenciación y desarrollo eritroide. Por ejemplo demostramos que además de Klf1 o Myb al cóctel GTLM cambia el patrón de expresión de la globina de predominantemente embrionario (primitivos) para principalmente adultos (definitivo). Este hallazgo corrobora la validez de la utilización de DLR como una herramienta para la definición de factores de desarrollo en la eritropoyesis.
Aquí, describimos el proceso de generar iEPs de fibroblastos de punta de cola de ratón (TTF). En nuestros resultados representativos, se realizó la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expresan la proteína amarilla fluorescente (eYFP) desde el locus Rosa26 en todas las células que han expresado el receptor de eritropoyetina, lo que permite la fácil visualización del compromiso del linaje eritroide. Usando este método, YFP (EpoR +) las células positivas están presentes tan pronto como cinco días después de la transducción de señales. Este protocolo, por lo tanto, ofrece una técnica rápida y robusta para la generación de progenitores eritroides en vitro.
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Protocol
1. establecimiento y mantenimiento de cola de ratón primaria punta culturas del fibroblasto
- Preparar platos de cubierta de gelatina (se recomienda un plato de 10 cm para una cola) que cubre la superficie con 0.1% gelatina e incubando los platos para unos 20 min a 37 ° C. Aspire la solución de gelatina del plato y deje que se seque durante al menos 2 h.
- Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Quitar la cola con las tijeras, corte en la base de la cola. Poner la cola en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 2% de suero bovino fetal (FBS) hasta que esté listo para usar.
Nota: Para mejores resultados, colas deben ser tomadas de ratones alrededor de 6 a 8 semanas de edad. Pueden tomar colas de ratones mayores de 8 semanas de edad, sin embargo, como la edad de los ratones, la capacidad de proliferación de los fibroblastos y la eficiencia de reprogramación disminución de11. - Realizar todos los pasos posteriores de este protocolo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles. Preparar una solución de tripsina diluido de 0.02% tripsina-EDTA en DPBS y añadir 5 mL en un plato de 10 cm sin recubrimiento.
- Lavar la cola, primero en etanol al 70%, entonces en DPBS. En un plato, colocar la cola plana y usar pinzas para sujetar en su lugar. Hacer una incisión en la cola a lo largo de su eje longitudinal desde la base hasta la punta.
- Sujete la cola con un par de pinzas y manténgalo verticalmente. Utilizando un segundo par de pinzas, agarre la piel al lado de la incisión en la base de la cola y piel vuelta. Hacerlo en ambos lados de la incisión hasta que la piel se puede pelar apagado tirando hacia abajo hacia la punta de la cola.
- Sujete la cola pelada con pinzas sobre el plato que contiene la solución de tripsina y cortar la cola en trozos largos de aproximadamente 1 cm. Con las piezas de la cola en la solución de tripsina, use tijeras para fragmentar los pedazos en trozos más pequeños. Incubar las piezas de la cola en la solución de tripsina a 37 ° C durante 10 minutos.
Nota: Las piezas de los más pequeñas son preferidas para dar a cada pieza un elevada área superficial al cociente del volumen. - Saciar la tripsina con 2 volúmenes de medio de expansión (FEX) de fibroblastos (alta glucosa Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 15% SFB, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales (AANE) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina).
- Recoger todo el contenido del plato en un tubo de 50 mL y centrifugar a 350 × g por 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender los fragmentos de la cola en 10 mL de medio fresco de FEX.
- Fragmentos de la cola en medio de la transferencia a un plato cubierto de gelatina e incubar a 37 ° C en 5% CO2 y 4% O2, añadiendo medio fresco de FEX cada 2 días.
Nota: Después de cinco a siete días, fragmentos de la cola han unido en la parte inferior del plato y se observan fibroblastos alejándose de ellos. - Una vez que los racimos de los fibroblastos se han manchado, agite suavemente el plato para desplazar piezas de cola y aspire el medio y todos los fragmentos de hueso dejando los fibroblastos conectados a la placa. Agregar nuevo medio FEX y los fibroblastos de la cultura hasta el confluente.
- Para asegurar la no contaminación de los fibroblastos de progenitores hematopoyéticos, disociar las células de la placa con tripsina-EDTA de x 1 por 5 minutos y recoger las células. Agotan las células expresan marcadores hematopoyéticos (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 y Ter-119) utilizando un sistema de separación magnética10.
2. retrovirus producción
- Semilla células empaquetado retroviral en aproximadamente 2,5 × 104 células/cm2 (2,0 × 106 células por un plato de 10 cm) sobre un plato de cultivo de tejidos tratados (por vacío-gas plasma) y la cultura durante la noche en alta glucosa DMEM con 10% FBS, 10 mM sodio Piruvato y 100 U/mL penicilina/estreptomicina a 37 ° C y 5% CO2.
- A la mañana siguiente, tomar el medio DMEM sin aditivos con la mitad el volumen utilizado a la cultura durante la noche (5 mL para un plato de 10 cm). En la tarde, comprobar que las células son 70-80% confluente y comienzan la transfección.
- Para cada factor de reprogramación, Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc, preparar una mezcla 2:1 de la expresión vector (pMX) y ayudante (que contiene los genes gag y pol). Para un plato de 10 cm de los fibroblastos, use 6 μg de vector de la expresión y 3 μg de vector de ayudante en un volumen final de 100 μl de medio DMEM.
- Para cada factor de reprogramación, preparar 300 μL de temperatura (RT) DMEM en un tubo estéril de poliestireno y con cuidado añadir 27 μl de reactivo de transfección comercial.
Nota: El reactivo de transfección se debe traer a RT antes de su uso y debe agregarse directamente en el medio como las propiedades electrostáticas del compuesto pueden pegarse a la pared de plástico del tubo. - Añadir la mezcla de plásmido en el tubo que contiene el reactivo de transfección, vortex brevemente e incubar la mezcla de ADN de reactivo de transfección durante 15 min a TA. brevemente vórtice la mezcla y añadir gota a gota a las células de empaquetado retroviral que la transfección mezcla de reactivo-DNA se extiende uniformemente sobre la cultura e incubar a 37 ° C durante la noche.
- 24 h después de la transfección, tomar el medio DMEM con 20% FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. 48 h después de la transfección, recoger el sobrenadante y filtrar con un filtro de jeringa de tamaño de poro de 0,22 μm.
Nota: Sobrenadante Viral puede ser congelado a-80 ° C y mantenerse hasta que la necesite, aunque transducción es más eficiente si se utiliza fresco sobrenadante viral.
3. GTLM transducción y cosecha de la iEP
- Semilla de la cola punta de fibroblastos en el 1 × 104 células/cm2 en 0.1% gelatina cubierto primero platos en medio FEX e incubar a 37 ° C durante 24 h.
- Al día siguiente, prepare una mezcla de transducción como sigue.
- Agregar 1 volumen de sobrenadante viral para cada factor de reprogramación con 4 μg/mL de reactivo de infección retroviral (40%) a 6 volúmenes de medio FEX (60%).
- Para un plato de 10 cm de los fibroblastos, añadir 1 mL de cada sobrenadante viral (virus x 4 = 4 mL) suplementado con 4 μg/mL de reactivo de infección retroviral a 6 mL de medio FEX, dando un total de 10 mL de una mezcla de transducción.
- Aspire medio FEX de la cultura del fibroblasto y sustituirla por la mezcla de la transducción de señales. Incubar la transducción por 4 h a 37 ° C en condiciones hipóxicas (5% CO2 y de 4% O2).
- Aspirar la mezcla de transducción y reemplazarlo con medio fresco de reprogramación (medio libre de suero expansión (SFEM), 100 U/mLPenicillin/estreptomicina, 100 ng/mL Factor murino de células madre (mSCF), 10 ng/mL murino interleucina-3 (IL3), 2 recombinante humano U/mL Eritropoyetina (hrEPO) y 100 nM dexametasona).
- Incubar durante estancias 8 37 ° C en condiciones hipóxicas, añadiendo medio fresco reprogramación cada 2 días. Después de cinco a ocho días, reprogramación exitosa dará racimos de células que se han separado de la placa.
- Para recoger células reprogramadas para el análisis, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo para recoger directamente en el plato. Para cosechar untransduced fibroblastos para la comparación, disociar las células de la placa utilizando 1 x tripsina-EDTA y recoger.
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Representative Results
Aquí presentamos un protocolo reproducible para la producción de iEPs de fibroblastos adultos usando transcripción factor-driven DLR. Evaluamos la reprogramación celular mediante citometría de flujo, formando Colonia ensayos y gen análisis de expresión. Para ayudar en la visualización de la conversión a destino de la célula eritroide, realizamos la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expresan la proteína amarilla fluorescente (eYFP) desde el locus Rosa26 en todas las células que expresan el receptor de la eritropoyetina (Epor, Cre en un alelo del locus endógeno Epor ) transcripción en cualquier etapa de su desarrollo12,13 ( Figura 1A). Después de la reprogramación exitosa de inducida por progenitores eritroides, YFP (EpoR +) las células positivas son observables tan pronto como cinco días después de la transducción de señales. Día 5 de reprogramación, las células se convierten en la redondeos, elevación de la superficie de la placa y comienzan formando racimos. Día 5-iEPs mostrar una morfología de como precursor eritroide, que presentan un característico núcleo, cromatina gruesa y citoplasma azul después de May-Grünwald-Giemsa tinción (figura 1C). Hemoglobinization de algunas células es evidente por la coloración positiva bencidina y ligeramente rojiza cuando peleteado (Figura 1-E). Además, una pequeña fracción del día 5-iEPs express Co YFP y la eritroide-específica superficial del marcador Ter119 (figura 1F). Día 8, se observan racimos YFP + grandes. Día 8iEPs presentan un fenotipo distinguido de eritroides que día 5 iEPs; son significativamente más pequeños, han acumulado más de hemoglobina y también muestran significativamente upregulated expresión de Ter119 (figura 1B–1 G). Cyto-vueltas del día 8-iEPs revelan la morfología eritroide-como, mientras que muy pocos reticulocitos enucleated se observaron (figura 1H).
Análisis de la expresión del gen por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) de iEPs a granel en día 8 muestran que tienen casi apagado expresión de genes de fibroblastos y tienen alza muchos de eritroides de genes, incluyendo genes de globina, predominante expresión de tipo embrionario (figura 1). Para determinar si las células reprogramadas de la transición a través de progenitores multipotentes, realizamos un curso de tiempo y analizaron la expresión de marcadores hematopoyéticos a través de la reprogramación. Hemos divulgado previamente que salida de precursores eritroides fue mayor el día 6, seguido del día 8, con 10,5% ± 4,6% y 6.6% ± 0,5% de células YFP + vivo Co expresión de CD71 y Ter119, respectivamente10. También hay una población de células positivas CD41 antes de la aparición de las células positivas Ter119. C-kit ni marcadores de CD45, que generalmente se expresan en progenitoras hematopoyéticas y regulada en la eritropoyesis, se expresan en cualquier punto de la reprogramación (figura 1J). Estos datos sugieren que las células no pasan a través de una etapa anterior o progenitoras hematopoyéticas pluripotentes, aunque hacer tal vez la transición a través de un progenitor eritroide de megacariocitos.
Una manera confiable de evaluar la eficiencia de la reprogramación es realizar ensayos de formación de colonias BFU-E en las células reprogramadas. In vitro la capacidad de diferenciación del día 5 - día 8-iEPs fue probada en metilcelulosa suplementado con eritropoyetina humana, factor de células murinas y dexametasona. Después de 8 días, IEP formaron dos tipos de colonias: claramente rojo (iEP rojo) y no-visible rojo (iEP no rojo). Mientras que las células de las colonias rojo muestran morfología erythroblast, células de colonias no rojo no se parecen a las células eritroides y eran irregulares, tenían gran citoplasma profundo azul y granular (figura 2A).
Del día 5-iEPs, aproximadamente 1 en 1.000 forman colonias rojas, mientras que sólo aproximadamente 1: 10,000 día 8-iEPs formaron colonias rojo, con una proporción mucho mayor de colonias no rojo formado (figura 2B). Esta reducción en la formación de Colonia de capacidad entre 5 - y el día 8-iEPs podría ser explicado byiEPs que experimentan diferenciación de días 5-8 y los vectores de expresión GTLM sufrimiento silenciamiento con el tiempo. Análisis de qPCR confirmó que expresión de la transcripción exógena disminuye significativamente de días 5 a 8. Como se esperaba en reprogramación exitosa, niveles de expresión de endógeno Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc induce, sin embargo, endógeno Lmo2 expresión sólo muy humilde expresado (figura 2C).
Un punto de la nota y una limitación del análisis, es que no rojo colonias macrófago-como células exceden en número las colonias iEP hemoglobinized rojo formadas por reprogramado fibroblastos en la formación de Colonia ensayos. Capacidad formadora de colonias para crear colonias rojo iEP puede mejorarse cambiando las relaciones estequiométricas de factores GTLM. Transducción de las células con el doble de la cantidad de vectores de expresión Tal1 y Lmo2 condujo a un ligero aumento en la proporción de colonias rojo sobre rojo no colonias, mientras que extra Gata1 condujo a un aumento significativo en la formación de colonias rojas y casi una eliminación total de colonias rojo no apoyar el importante papel de estos factores en la eritropoyesis (figura 2D). Curiosamente, aumentando drásticamente la expresión de c-Myc aumenta la producción de colonias no rojo a pesar de ser indispensables para la reprogramación. Para obtener progenitores eritroides inducido puro para análisis de aguas abajo, las colonias pueden ser aisladas de los ensayos de formación de colonias. Realizamos análisis de expresión génica en forma de microarrays en rojo y no rojo colonias de día 5-iEPs y las colonias de 14,5 días post coito (dpc) hígado fetal (FL) y adultas de la médula (BM) para la comparación. Los datos de microarray son accesibles a través de NCBI Gene expresión Omnibus (GEO): GSE73344. Previamente hemos demostrado que las colonias rojo-iEP se asemejan a las colonias eritroides de bona fide (FL y BM) por gene expresión10. Examen de la expresión de Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc en cada colonia muestra que aunque las colonias rojo muestran niveles similares de expresión de todos los cuatro factores a FL y BM, no rojo colonias tienen menor expresión de todos los factores, especialmente Gata1 (figura 2E). Para entender lo que las colonias no rojo que contiene macrófagos como las células son, examinamos la expresión de genes específicos del tipo de la célula en cada tipo de Colonia de los datos de microarray. Como se informó anteriormente, las colonias rojo expresan muchos genes eritroide-específica, similares a la de FL y BM. Después de revisar los datos, está claro que las colonias no rojo muestran alta expresión de un número de genes característicos de macrófago células14 (figura 2F). Colonias rojo ni rojo no muestran significativamente aumento de expresión de genes de megacariocitos típico15. Juntos, estos datos sugieren que las colonias no rojo asemejan más a los macrófagos que los eritrocitos. Puesto que las colonias rojo no se observan nunca cuando uno de los factores GTLM se quitan estas células similares a macrófagos parecen formarse cuando los niveles de expresión de uno o más de los factores de reprogramación Gata1, Tal1, Lmo2 son inferiores a necesaria para reprogramar al iEPs. En conjunto, esto sugiere que los niveles de expresión de todos los factores GTLM cuatro son importantes en TTF para reprogramación de iEP y que la heterogeneidad es explicada por reprogramación incompleta de células individuales, que potencialmente se pueden corregir mediante el ajuste de Relaciones estequiométricas.
Evaluar la eficacia y la robustez de nuestro protocolo, probamos la capacidad de determinado número de fibroblastos para producir racimos visibles de iEP células después de 5 días cuando se cultivan en placas de 384 pocillos. Se determinó que fuera 24 transducciones de 20, 30, 40 y 50 fondos fiduciarios temáticos, el número de pozos con racimo de iEP al menos una fue 3 (0.6% de los fibroblastos de las placas), 15 (2.0% de los fibroblastos de las placas), 15 (1.6% de los fibroblastos de las placas) y 13 (1,1% de los fibroblastos de las placas) , respectivamente. Esto sugiere que GLTM iEP reprogramación es un proceso robusto y fiable que puede alcanzar una eficiencia de 1%.
Otros factores que pueden afectar la eficiencia de la reprogramación incluyen el número de paso de los fibroblastos y las condiciones de cultivo. Se comparó la eficacia de la reprogramación de fondos fiduciarios temáticos que habían sido pasados tres veces o nueve veces antes de transducción de señales. Fondos fiduciarios temáticos que habían sido pasados nueve veces (P9) mostró una reducción dramática de la capacidad de producir racimos de iEPs (figura 3A). Curiosamente, inclusión de suero en los medios de comunicación reprogramación totalmente bloques reprogramar, cambiar suero con citoquinas eritroide es necesarios permitir los factores transduced conducir el destino celular nuevo sin señales de compuestos del suero. Eliminación del suero y la expresión de nuevos factores dentro de la célula es probables ser estresantes en las células. De hecho, bloqueando la activación de p53 mucho aumentó el número de iEPs generados. Este efecto puede verse también en la reprogramación de fibroblastos de knockout p53 (figura 3B-D). Inhibición de p53 conduce a más supervivencia y mejor reprogramación de la célula y es un método validado para mejorar el rendimiento de señalización. Finalmente, reprogramación en condiciones hipóxicas es favorable pero no es vital para la producción de la iEP. Sin embargo, cultivadas en normoxia transduced FFT es mucho más lentas reprogramar y racimos de iEP se observan después de 10 días en lugar de cinco a ocho días (figura 3E).
Figura 1 : Expresión forzada de Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc reprograma fibroblastos murinos de adulto en progenitores eritroides que exhiben propiedades de las células eritroides de bona fide . (A) diseño Experimental para la transcripción factor-mediada reprogramación del reportero eritroides (R26 Epor Cre-eYFP) cola punta fibroblastos (TTF) EpoR + reprogramar células. (B–F) Tiempo curso de generación de la iEP de untransduced FFT (día 0) y a granel GTLM-transduced FFT en los días 5 y 8 (representante de n = 2-3). Transdiferenciación se evaluó por las imágenes de células vivas, campo brillante (B) de pozos individuales (escala de la barra, 50 μm); (C) May-Grünwald - Giemsa tinción cito-spin (barra de escala, 20 μm); (D) bencidina/Giemsa tinción cito-spin (barra de escala, 20 μm); (E) inspección macroscópica de los pellets de células; y citometría de flujo representativo (F) mostrando YFP / Ter119 expresión. (G) diámetro de la célula de iEPs cosechados durante los días 5 y 8 medido de varias diapositivas de cyto-spin, mostrando una disminución en el tamaño de la célula el día 8. Los datos se presentan como media ± SD (n = 21-25); p ≤ 0.0001 por impar t-test. (H) representante bencidina/Giemsa alta resolución imágenes de FFT GTLM-transduced en día 8. Barra de escala, 5 μm. (I) la expresión del mRNA relativa de genes relevante fibroblasto y eritroide-específica incluyendo genes de globina a untransduced (columnas gris) frente a granel de FFT FFT GTLM-transduced (columnas rojas) el día 8, determinados por qPCR. Los datos se presentan como media ± SD (n = 4-6 para iEPs, números = 2 para untransduced FFT). (J) gráfico muestra Resumen de análisis de citometría de flujo de tiempo-curso de untransduced TTF (día 0) y el volumen cosechado en el día 2, 4, 6 y 8 que muestra expresión YFP, CD45, CD71 y Ter119 TTF GTLM-transduced (n = 3). Los datos se presentan como media ± SD. figura adaptada de Capellera-Garcia S, et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : GTLM iEPs producen colonias rojo y no rojo en los ensayos de colonias BFU-E. (A) representante cytospin campo brillante y May-Grünwald-Giemsa imágenes de derivados del iEP rojo y no rojo colonias. Barras de escala, 50 μm (imágenes de la Colonia) y 10 (imágenes de cyto-spin). (B) recuentos de colonias generados a partir de FFT untransduced plateado, a granel día 5 iEPs y a granel día 8. Los datos se presentan como media ± SD (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0.0001 por ANOVA de dos vías. (C) la expresión del mRNA relativa de Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc en untransduced TTF y a granel TTF GTLM-transduced cosechada en día 5 y 8, determinado por qPCR. Primers fueron diseñados para que expresión endógena puede ser distinguido de expresión total. Los datos se presentan como media ± SD (n = 4-6 para iEPs, números = 2 para untransduced TTF). (D) generados a partir de recuentos de colonias plateado untransduced FFT y día a granel 5 iEPs generados duplicando la proporción de cada uno de los factores GTLM. Los datos se presentan como media ± SD (n = 3); ** p ≤ 0.001; p ≤ 0.0001 por ANOVA de dos vías. (E) expresión relativa de Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc en fibroblastos untransduced y colonias recogidas generados por iEPs GTLM-transduced (rojos y no rojo), 14,5 hígado fetal dpc y hueso adulto médula ósea, determinada por microarrays. Los datos se presentan como media ± SD; * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0.0001 por ANOVA de dos vías. (F) expresión relativa de los genes seleccionados conocidos por su expresión en eritroides (arriba), megacariocitos (medio) y macrófagos células (abajo) en fibroblastos untransduced y recogido las colonias generadas a partir de iEPs GTLM-transduced (rojos y no rojo), 14.5dpc hígado fetal y médula adulta, determinado por microarrays. Los datos se presentan como media ± SD; * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0.0001 por ANOVA de dos vías. Figura es una adaptación de Capellera-Garcia S, et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : GTLM reprogramación es un proceso robusto y fiable. (A) gráfico del número de racimos observados de 10.000 FFT y cuadros representativos el día 5 de GTLM reprogramación de fibroblastos de punta de la cola (TTF) que han sufrido tres pasajes (P3) o nueve pasajes (P9) antes de la reprogramación. Los datos se presentan como media ± SD (n = 6); son barras de escala 50 μm. (B–D) grupos de cuadros representativos del iEP 6 días después (B) GTLM reprogramación de fibroblastos de la punta de la cola; (C) GTLM reprogramación de fondos fiduciarios temáticos con la adición de vector de la expresión de p53DN; (D) GTLM reprogramación de p53 nocaut FFT (escala bares = 50 μm). (E) con cuadros representativos de iEP racimos después de 10 días de reprogramación GTLM realizada en condiciones normoxic (barra de escala = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a iEPs10. Las células eritroides reprogramado mucho se asemejó a bona fide eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo, genes y capacidad formadora de colonias. Este hallazgo corrobora el fundamento de la utilización de reprogramación directa como herramienta para la definición de factores de desarrollo en la hematopoyesis. Para apoyar la validez de este método, iEPs también se pueden generar usando inducción GTLM de fibroblastos embrionarios de ratón y fibroblastos de prepucio humano, mostrando que funciona para fibroblastos de diferentes orígenes y a través de especies10. En este informe, inducir la reprogramación de fibroblastos de ratón trazado linaje eritroide como una herramienta para visualizar la conversión a una célula eritroide. Uso de este ratón es útil pero no esencial para el protocolo. Rutinariamente realiza reprogramación utilizando múltiples tipos de fibroblastos de diferentes cepas de ratón e identificar iEPs mediante la expresión de marcadores de superficie celular de Ter119 y CD71.
Nuestro método actual genera iEPs que exhiben un fenotipo eritroide primitivo en comparación con un fenotipo adulto definitivo. Una gran diferencia entre estas fases del desarrollo es la expresión de los genes de globina diferentes. Sin embargo, hemos demostrado además de Klf1 y Myb al patrón de expresión de GTLM cambios cóctel iEPs globina embrionaria predominante a adultos principalmente10,14. Curiosamente, además de Gata2 y Runx1 de trombopoyetina en el medio de los cuatro factores cóctel sesgos el proceso de reprogramación hacia el linaje megakaryocytic16.
El iEPs GTLM-inducida producir progenitores eritroides con una firma de expresión de genes primitivos y una capacidad proliferativa limitada. Además, el iEPs producir muy poca eritrocitos enucleated. La expansión de progenitoras eritroides pobres se explica por la falta de reprogramar a kit + definitivo las células eritroides, que potencialmente puede alcanzarse con la adición de otros factores que inducen reprogramación directa a iEPs con la expresión de un gene definitivo programa.
Nuestros datos también sugieren eficacia pobre enucleación se explica por el hecho de iEPs GTLM-inducido generar precursores con un primitivo, en lugar de un programa de expresión génica definitivo. Se trataron de varios intentos de optimizar las condiciones de cultivo sin enucleación mejorada. Curso intenta aumentar tanto eficiencia de proliferación y enucleación del progenitor se centra, por tanto, identificar factores faltantes para inducir la reprogramación a iEPs definitivos.
Para la óptima producción de colonias rojo iEP, es vital que las células son transduced con cuatro vectores y GTL genes se expresan en altos niveles. Lamentablemente el método actualmente más eficiente no permite el control previo de los títulos de vector. Un intento de mejorar la eficiencia en el uso de vectores lentivirales bicistronic no tuvo éxito, posiblemente debido a problemas con estequiometría inferior o niveles de expresión insuficiente. Mientras que se está trabajando para mejorar la reprogramación vectores, los restos de método más eficientes usando combinaciones de recién producen sobrenadante de vector con los vectores retrovirales anteriormente descritos expresan un único factor y ningún gen marcador de selección.
GTLM reprogramación a iEPs es el único protocolo reportado capaces de producir células progenitoras eritroides de una célula somática comprometida. Como un método de investigación herramienta DLR iEP por lo tanto tiene varias ventajas sobre otros eritroides celular sistemas modelo como líneas de la célula eritroide células HiDEPs/HuDEP (PMID: 23533656)17. Mientras que las células de HiDEPs/HuDEP son herramientas más convenientes para la producción de eritrocitos a gran escala y la evaluación de funciones de los genes durante la eritropoyesis terminal, la única ventaja de GTLM reprogramación a iEPs es la posibilidad de estudiar directamente de la base programas transcripcionales determinar destino de células eritroides. GTLM reprogramación proporciona una plataforma invaluable para estudiar tanto la eritropoyesis en los seres humanos y de ratón, por ejemplo, para estudiar el cambio de eritropoyesis primitiva y definitiva. Comprensión de este interruptor es de gran interés en el tratamiento potencial de las hemoglobinopatías como la Anemia de células falciformes, en la que los investigadores se esfuerzan revertir el interruptor en adultos a la hemoglobina fetal para aliviar la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés al informe.
Acknowledgments
Agradecemos a Evelyn Wang y Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonación y Harvey Lodish (Whitehead Institute) para proporcionar muchos de la plásmidos utilizada para generar la biblioteca retroviral. Agradecemos a Kavitha Siva y Sofie Singbrant (Departamento de Medicina Molecular y genética Therapy, Universidad de Lund), Göran Karlsson y Shamit Soneji (Departamento de Hematología Molecular, Universidad de Lund) para sus funciones en la descripción de la iEP. También nos gustaría reconocer y agradecer a Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, Parque de investigación biomédica de Barcelona), Violeta rayón-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Instituto de investigación médica de San Vicente y Departamento de medicina, Hospital de San Vicente, Universidad de Melbourne), Ángel Raya (institución catalana de investigación y estudios avanzados, Barcelona) y Vijay G. Sankaran (Instituto Broad del Instituto Massachusetts de tecnología y de Harvard, Cambridge ) por sus contribuciones anteriores a este trabajo. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Söderberg Ragnar (a j); el sueco de investigación Consejo (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (a j); la Fundación sueca para la investigación estratégica (a j); Fundación de Åke Wiberg (J.F.); una beca de integración de Marie Curie (a J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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