Summary
여기 선물이 solubilized thylakoid 단지 네이티브 그린 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 프로토콜. 녹색 젤 밴드는 이후 여 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 특징 및 데이터 분석을 위한 기본 단계 제공 됩니다.
Abstract
광합성의 빛 반응 thylakoid 막에 안료 단백질 복합물의 시리즈에 의해 수행 됩니다. 산출할 및이 단지의 길고 짧은 시간 비늘 광합성 환경 조건 변화에 적응 하는 프로세스 때문에 매우 동적 이다 (즉, 비-광화학 냉각, 상태 전환 및 장기 응답)입니다. 역사적으로, 이러한 프로세스는 시선 변화 측면에서 설명 엽록소 형광 그리고 분광학 광합성 매개 변수를 모니터링 하는 중요 한 방법에 남아 있다. 제한 된 수의 기본 단백질 복잡 한 역학 구상 될 수 있는 방법 있다. 여기는 고해상도 분리 및 thylakoid 단지, 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법의 시각화를 위한 빠르고 간단한 방법에 설명합니다. 이 메서드는 시간 상관 단일 광자 밴드 녹색 젤에 분리의 엽록소 형광 특성의 상세한 묘사에 대 한 계산 된 결합 이다.
Introduction
광합성 생물 끊임없이 변화 하는 환경 조건 그들의 생산성을 극대화 하 고 이웃1과 성공적으로 경쟁 하기 그들의 생리학을 조정 해야 합니다. 이 기계 주변광 조건 전체 햇빛과 그림자 사이 3 개의 크기 순서에 의해 변동 될 수 있습니다으로 광합성, 빛 반응에 대 한 책임의 특히 사실 이다. 또한, 가뭄, 감기, 또는 열 스트레스 같은 빛 반응의 제품에 대 한 자연 전자 싱크 탄소 고정을 위한 탄소가 산화물의 가용성을 줄일 수 있습니다. 식물 해야 합니다, 그리고 따라서 하 게 수확 하 고 필요에 따라 초과 빛 에너지를 발산 하는 능력을 유지 하면서 가능한 한 효율적으로 태양 복사를 활용. 반면 photooxidative 손상을 계속 발생 합니다 정기적으로 모든 조명 조건2,3, 실패 관리를 흡수 여기 에너지 성공적으로 치명적인 세포 손상과 죽음으로 이어질 수 있습니다. 몇 가지 적응 메커니즘 통용 환경 조건에서 변화 하 고 일시적인 변동 (즉, 길고 짧은 timescales 이상)4튜닝할 광합성 장치를 허용 하는 존재. 장기 응답 (LTR) 및 비-광화학 냉각 (NPQ) 포함 됩니다. NPQ 상태 전환 (qT), 냉각 (qE 급속 하 게 유도할 수 있는 에너지), 및 photoinhibition (제나라)5를 포함 하 여 적어도 3 개의 다른 구성 요소 현상, 포괄 하는 것으로 간주 그 자체 이다.
이러한 프로세스를 관찰 원래 되었고 광 현상으로 크게 정의 [예를 들어, NPQ 참조 한 방울의 속도 증가 때문만 아니다 (엽록소 형광의 냉각) 관찰된 엽록소를 형광에 광화학]6. "상태 전환" 유사 하 게 관찰 하는 의미에서 PSI과 PSII7에서 형광의 상대적인 양을 변경 합니다. 이러한 현상의 열거형으로 가능 하 게 만든 분 광 기법을 동안 [특히, 펄스 진폭 변조 (PAM) 형광 분광학] 계속 관찰 하 고 광합성 프로세스 에서 해 부를 위한 중요 한 수단 vivo, 훌륭한 제의로 생화학의 이러한 분 광 관측을 기본 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 필요한입니다. 상태 전환, 예를 들어, STN7 키 니 아 제 및 TAP38/PPH1 인산 가수분해 효소, 각각8,,910LHCII 단백질의 인 산화/dephosphorylation 주기를 포함 한다. 이 주기 조정 PSII에서 PSI, 그로 인하여 흡수 변화 LHCII trimers의 일부를 이동 하 여 두 개의 photosystems 사이 LHCII 안테나의 물리적 배포 photosystems11,12의 횡단면. 빠르게에 NPQ의 qE 구성 요소 violaxanthin/제 아 잔 틴 epoxidation/드-epoxidation 사이클과 PsbS 단백질의 활동을 통해 열 과도 여기 에너지를 변환합니다. 이 과정에서 PsbS의 정확한 역할은 여전히 하지 완전히 이해13. Photoinhibition, NPQ의 키 구성 요소는 일반적으로 PSII의 D1 단백질에 손상을 관찰 작용. 전체 광합성 능력의 복원 손상 된 PSII photocenters를 해결 하기 위해 정교한 복구 프로세스가 필요 합니다. PSII 수리 주기 PSII 단지는 granal 스택, 단지 철거, 손상 된 D1 단백질의 보충, PSII 단지의 리어셈블리 및 granal 스택14에 다시 PSII 단지의 움직임의 마이그레이션이 포함 됩니다. Photoinhibition PSII photodamage의 정확한 특성 강렬한 감시15의 주제에 남아 있다.
현상 상태 처럼 공부에 어려움 전환 또는 PSII 수리 부분에 복잡 한 생화학 시스템의 역학을 시각화 하기 위해 하나의 간단한 방법 사실에서 발생 합니다. 프로세스를 이해 하 고전 생 화 확 적인 방법은 고립에서 특성화 될 수 있도록 먼저 구성 요소를 별도 것입니다. 기본 젤 전기 이동 법 성공적인 노력에서 분리 하 고 더 많은 대리점 메서드 (즉 자당 기온 변화도 원심 분리 크로마토그래피)16thylakoid 막에서 photosystem 단지 특성화는 1980 년대에서 일어났다. 세제 시스템 부드럽게 solubilize thylakoid 막에서 네이티브 복합물을 개발 했다 곧 적응 전기 이동 별거 방법, 가장 주목할만 하 게 알 렌과 Staehelin17 과 베드로 Thornber18, 기한 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법. 동안 다양 한 기술 실험 무기고, 기본 페이지에서에서 대표 단 하나 광합성 연구에 널리 고용된 방법 만든 매력적인 특성의 수를 있다. 기본 페이지는 상대적으로 신속 하 고 간단, thylakoid 복합물의 많은 수의 고해상도 분리를 동시에 제공 하면서 약간 특수 장비가 필요. 이것은 네이티브 페이지 thylakoid 역학을 공부 하 고, 두 번째 차원 다양 한 세제 및 버퍼 시스템, 찾기 및 새로운 thylakoid 단지에 대 한 다양 한 시스템에 있는 표준 페이지와 함께 하는 편리한 도구.
즉, 네이티브 녹색 젤 했다 특히 경험이 손에, 신뢰할 수 없는 기술을 위한 명망 그것은 쉽게 퍼지, 더럽혀진 젤 몇 밴드와 함께 구성 된 가난한 결과 생산. 이 문제가 블루 기본 페이지19의 소개와 함께, 일부 해결 되었다. BN 버퍼 시스템에서 coommassie 염료를 사용 하 여 보다 강력한 단백질 분리를 합니다. 따라서, BN 페이지 종종 상대 초보자 설정에 대 한 쉽고 더 안정적인 기술 이며 단지 thylakoid 고해상도 분판을 제공할 수 있습니다. 이러한 이유로, BN-페이지는이 분야의 대부분의 작업에 대 한 선택의 방법 되었다. BN-페이지는 일반적으로 그것의 주요 결점은 녹색 젤 전기 이동 법, 보다 실행 속도가 느린 동시 다운스트림 희미 한 엽록소를 포함 밴드, 식별과 방해 coommassie 염료 얼룩이 광 특성화 문제입니다.
기본 젤에서 생 화 확 적인 정보 제공 그리고 분 광 기술에서 데이터와 함께 2D SDS 페이지 크게 강화 될 수 있다. 고용 시스템에 단지를 식별 하기 위해 기본 젤을 사용 하 여 중앙 문제는 식별 도전 수 있습니다 항상 (즉, 단백질 밴드에서 찾을 수 항상 대표 comigrating 단지 또는 구성 요소, 오히려 보다는 하나의 순수 정통 복잡). 분 광 특성 녹색 젤 밴드 안료에 대 한 생물 정보를 제공 하 고 확인할 어떤 유형의 단지 그들은 포함 하는 데 사용 수 있습니다. 엽록소 형광은 종종 극적으로 다른 스펙트럼 및 형광 수명 다른 광합성 안료 단백질 복합물의 특성 때문에 이런 맥락에서 특히 유용 합니다. 간단한 정상 77 K 형광 스펙트럼 네이티브 젤 단지의 정체성 확인에 유용한 있다 역사적으로, 현대 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. TCSPC 형광 수명에 따라 단지의 특성 뿐만 아니라 수 있습니다 하지만 또한 가능 하 게 내는 스펙트럼 구성 요소 간의 에너지 전달의 자세한 설명. 특성의이 종류는 다양 한 기본 젤 시스템 확산의 사용으로 점점 더 필요 해지고 있다 그리고 새로운 상 상속 단지 발견 더 나은 인증 단백질 복합물의 식별을 허용 하 고 제공 하는 새로운 이 단지 작동 하는 방법에 대 한 생물 정보입니다.
이 문서에서 제공 하는 거의 또는 전혀 경험과 네이티브 젤 전기 이동 법의 빛 반응의 메커니즘을 조사 하기 위해 네이티브 thylakoid 단지의 높은 해상도 달성 하는 데 그 수는 방법 광합성입니다. 이 기본적인 기술은 다음 결과 개선 또는 다른 종에 적용을 확장 하는 실험의 재량에 증강 수 있습니다. 우리는 다음 TCSPC, 기본 분석 및 기술에 의해 제공 하는 데이터의 프레 젠 테이 션에 대 한 몇 가지 단계를 네이티브 녹색 젤 밴드를 쓰는 과정을 설명 합니다. TCSPC 분석 기본 젤 전기 이동 법의 커플링 인증 및 밴드 내에서 단백질 복합물의 생물 특성을 제공 하 여 이러한 젤 시스템의 유틸리티를 확장 합니다. 여기에 설명 된 녹색 젤 시스템 기반으로 개발한 알 렌과 Staehelin17 일부 수정 하 고 슈왈츠 외에 사용 되는 동일 합니다. 20.이 시스템은 많은 중 하나입니다 하지만이 방법론에 대 한 유용한 특정 기능. Thylakoid 절연, 젤 전기 이동 법, 및 TCSPC 분석 편리 하 게 수행할 수 있습니다 하루에 샘플 저장 및 저하의 잠재적인 문제를 만듦으로써 그것은 충분히 빠른. 우리는 또한이 메서드는 결과 우수, 최적화의 정도 따라 좋은 제공 하면서 미숙한 사용자의 손에서 강력한 찾을.
명심 하는 네이티브 젤에 시각 단지 조사 유 기체의 생물학에 뿐만 아니라 사용 하는 세제 및 버퍼 시스템에 중요 하다. 다른 세제와 버퍼 시스템 우선적으로 분리, 단지의 다른 종류 그리고 주어진된 광합성 유기 체는 모두는 어떤 주어진된 상황에서 있을 것입니다, 다른 유기 체에서 다른 단지 것입니다. 여기서 설명 하는 시스템은 슈왈츠 외에 설명 된 대로 PSI 고급의 연구에 특히 적합 합니다. 20, 하지만 그것은 그 PSII 고급 공부에 대 한 스펙트럼의 더 불안정 끝에 떨어진다. Thylakoid 단백질의 네이티브 젤 전기 이동 법에 사용 되는 다양 한 세제 및 버퍼 시스템의 포괄적인 연구를 위해 Järvi 외를 검토 하는 것이 좋습니다. 21 그리고 Rantala 외. 22.
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Protocol
1. 재고 솔루션 준비 네이티브 녹색 젤 쏟아져
- 40% 글리세롤, 200mm 글리신, 및 100 mM Tris pH 8.3에 버퍼의 구성 된 젤을 해결 하기 위한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다.
- 겹쳐 쌓이는 젤 40% 글리세롤, 200mm 글리신, 100 mM Tris 버퍼 pH 6.3에 구성 된에 대 한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다.
- 금형의 성장을 방지 하기 위해 4 ° C에서이 버퍼를 저장 합니다.
참고: 버퍼 되므로 안정적인 4 ° c, 달에 대 한 지속적인된 사용에 대 한 각 버퍼의 100-200 mL의 준비는 것이 좋습니다. - 250 mM Tris HCl pH 8.3 포함 하는 버퍼를 실행 하는 x 10의 1 리터를 준비 1.92 M 글리신, 및 1 %SDS. 벤치탑에 버퍼를 실행 x 10을 저장 합니다.
2. 재고 솔루션 대비 격리 및 Thylakoids의 가용 화
- TMK 균질 버퍼 및 10mm KCl, 10mm MgCl2, 50 m m Tris 버퍼 (pH 7), 포함 된 100 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 저장
참고: 이것은 조직 및 조작 thylakoid 샘플에 대 한 주요 버퍼 이다. 또는, 집중된 재고 솔루션 준비 하 고 필요한 (Tris 버퍼, MgCl2및 모든 KCl 수 있을 쉽게 저장 벤치탑에 집중 하는 1 M) 만큼 희석 될 수 있습니다. - TMK 버퍼 20 %w / 동결 대 1 mL aliquots에-20 ° C에서 각 세제를 용 해 하 여 재고 솔루션은 thylakoid의 가용 화 세제, B decyl maltoside (DM) 및 n-octyl B-d-glucoside (OG)을 준비 합니다.
- 또한 샘플 로딩 버퍼는 thylakoid 가용 화 버퍼 (SB)를 준비 합니다.
- 첫째, TMK 버퍼의 7 mLs 및 글리세롤의 3 mLs를 결합 하 여 만들어 TMK 글리세롤 버퍼.
- TMK 글리세롤 버퍼의 800 μ, DM 재고 솔루션의 100 μ 및 100 μ 및 재고 솔루션의 추가. 2 %DM 및 2%의 1 mL aliquots에-20 ° C에서 냉동 포함 하이 SB 작업 솔루션을 저장 합니다.
참고: 각 약 수 해 동 고 필요에 따라 refrozen 될 수 있습니다.
3. 나중에 사용에 대 한 녹색 미니 젤 쏟아져
- 별도 스택 및 15 mL 일회용 시험관에서 젤 솔루션 해결 준비.
참고: 제공 하는 볼륨은 1.5 m m 플레이트 스페이서를 사용 하 여 단일 미니 젤에 대 한 충분 한.- 겹쳐 쌓이는 젤 솔루션으로 만들기 위해 스태킹 젤 버퍼, 40% 아크릴 재고 솔루션 (39:1 C) 0.5 mL 및 스택 버퍼 x 1에서 4% 아크릴 아 미드의 5 mL을 주고 물의 3.25 mL x 4의 1.25 mL을 결합 합니다. 해결 젤 수 있도록 솔루션 해결 버퍼, 40% 아크릴 재고 솔루션 (39:1 C), 0.94 mL 및 버퍼 해결 x 1에서 5% 아크릴 7.5 mL를 주고 물 4.7 mL x 4의 1.875 mL을 결합 합니다.
- 해결 젤을 붓는 다.
- 추가 10% 염화 persulfate (AP)의 50 μ 해결 젤 솔루션에 다음 추가 TEMED의 10 μ, 튜브, 모자 하 고 부드럽게 섞어 여러 번 반전. 즉시 해결 젤 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 빗 이빨의 하단 상단 사이 대략 1 cm를 떠나 젤 격판덮개 사이 젤 솔루션을 붓는 다.
- 부드럽게 100% 에탄올 젤 단계로 해결 젤 위에 플라스틱.
참고: 15 분 이내 젤을 설정 하지 않는 신선한 APS 솔루션 여야 한다/또는 새로운 TEMED를 사용 해야 합니다. - 젤 생산은 후 (젤과 에탄올 사이의 인터페이스 쉽게 볼 수 있을 것입니다 하 고 젤 밀고 때 이동 하지 것입니다), 에탄올 및 흡수 성 종이 오 점 부.
- 겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 다.
- 추가 25 μ 10%의 스태킹 젤 솔루션에 AP 추가 TEMED의 5 μ 다음 모자 및 해결 젤과 같은 방식으로 혼합 하는 반전. 플레이트 사이의 공간을 완전히 채워집니다 때까지 해결 젤 위에 젤 솔루션을 부 어 하 고 10-잘 빗을 삽입 합니다.
참고: 때 사용 될 준비가 되어 있는, 젤에서 빗을 제거 하 고 우물 우물 직선 가리지 젤에 의해 확인 하는 물으로 린스. 젤은 적어도 몇 일 동안 장소에 4 ° C에 빗으로 저장할 수 있습니다.
- 추가 25 μ 10%의 스태킹 젤 솔루션에 AP 추가 TEMED의 5 μ 다음 모자 및 해결 젤과 같은 방식으로 혼합 하는 반전. 플레이트 사이의 공간을 완전히 채워집니다 때까지 해결 젤 위에 젤 솔루션을 부 어 하 고 10-잘 빗을 삽입 합니다.
4. 절연 원유 Thylakoid 막에서 시금치의 잎
참고: 모든 단계 실행 되어야 한다 밖으로 미리 냉장된 장비 및 버퍼를 사용 하 여 얼음에. 희미 한 조명 또한 것이 좋습니다. 실험의 재량에 따라 연구에서 생물 학적 과정, 효소 및 인산 가수분해 효소 억제제는 균질 전에 TMK 버퍼에 신선한 추가 되어야 합니다.
- 완전히 유리 Dounce 균질 화기와 TMK 버퍼에 시금치 잎을 균질.
참고: 버퍼의 약 1 ~ 2 mL 작은 아기 시금치 잎에 대 한 일반적으로 충분 하다. 단일 아기 시금치 잎 일반적으로 1.5 m m 미니 젤에 여러 우물을 로드를 충분 한 자료를 제공할 수 있습니다. - 불용 성 파편 제거를 원유 잎 homogenate를 필터링 합니다.
- 간단한 필터링 장치, 섬세 한 작업을 잘라 반으로 닦아와 내 무 반으로 접어. 5 mL 일회용 주사기의 하단에 섬세 한 작업 지우기를 포장 하 고 미리 젖은 TMK 버퍼 지우기.
- 주사기 플런저를 사용 하 여 섬세 한 작업 지우기에서 초과 버퍼를 누르고는 지우기 필터 누르면 단단히 주사기의 하단에 플런저를 제거한 후 반드시.
- 지우기 필터의 중앙에 잎 homogenate 플라스틱 하 고 플런저를 사용 하 여 필터는 homogenate를 통과. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 필터링 된 homogenate를 수집 합니다.
- 펠 렛의 thylakoid 막을 포함 하 여 불용 성 물질을 4 ° C에서 10 분 동안 5000 x g에서 homogenate 원심 삭제는 상쾌한 고 TMK 버퍼의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 엽록소의 동일한 총 금액을 포함 하는 각 샘플을 아래 설명 된 대로 각 resuspended thylakoid 샘플의 볼륨을 조정 하 여 각 샘플에서 엽록소의 양을 정상화.
참고:이 각 샘플 세제의 같은 볼륨에서 solubilized을 하면 고 가용 화 펠 릿 볼륨에 있는 다름 때문에 변화를 최소화 합니다.- Resuspended thylakoid 막의 각 샘플에서 엽록소를 추출, 50 μ aliquot microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 걸릴 하 고 그것에 메탄올의 950 μ를 추가 합니다. 캡 튜브와 여러 번 반전 하 여 섞는다.
- 펠 렛의 침전 된 단백질을 10 분 동안 10000 x g에 메탄올/엽록소 추출 원심
- 리 포 라 외 알에 따라 상쾌한을 포함 하는 안료의 엽록소 농도 결정 합니다. 23.는 분 광 광도 계를 사용 하 여 1 ㎝ 베트 652, 665 nm에서 흡 광도 신호를 받아. 아래 수식을 사용 하 여 총 엽록소 농도를 확인 합니다.
Chls는 + b (μ g/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm) - 가이드로 서 엽록소 농도 측정을 사용 하 여 제거 하 고 엽록소의 동일한 총 금액을 포함 하는 각 튜브를 필요에 따라 각 샘플에서 일부 볼륨 삭제.
- 10 분 제거에 대 한 5000 x g에서 원심 분리 하 여 다시 펠 렛의 thylakoid 막 그리고 삭제는 상쾌한. 펠 릿의 발음 하지 않고 모든 상쾌한을 제거 하려면 주의 해야 합니다.
5. 네이티브 젤에 로딩을 위한 Thylakoid 막의 가용 화
- TMK 30% 글리세롤 세제 솔루션 (SB)의 약 수를 해 동 하 고 섞어 여러 번 반전. 얼음에 그것을 유지.
- 1 mg/mL의 엽록소 농도 주고 SB의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 thylakoid 펠 릿을 디졸브.
참고:이 농도 실험적으로 결정 되어야 최적의 가용 화 상태를 찾기 위한 출발점. 엽록소 농도 비교 만들 수 있도록 샘플 사이 같은 유지 되어야 한다. - 플라스틱를 위아래로 반복 해 서 샘플의 볼만 않도록 주의 하면서. Thylakoid 샘플 solubilize을 허용 하도록 얼음에 계속.
참고: 적어도 10 분 동안 Solubilize. 가용 화 시간 충분히 샘플 가용 화 시간에 차이 최소화 해야 합니다.
예: 3 분 모든 샘플을 solubilize를 해야 하는 경우 다음 30 분 정도 허용 되어야 한다 가용 화에 대 한. - 펠 렛의 불용 성 물질을 4 ° C에서 10000 x g에서 solubilized thylakoids 원심
참고: Solubilized thylakoid 샘플은 안정적인 얼음에 시간 동안, 하지만-70 ° C에서 보관 피해 야 한다, freeze-thaw 주기 megacomplex 밴드의 손실 될 수 있습니다.
6. 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Solubilized Thylakoid 단백질의 분리
- 이전 준비 기본 젤에 직접 단계 5.4에서 solubilized thylakoid 표면에 뜨는 로드. 1.5 m m 젤 잘 당 solubilized thylakoid의 15 μ 로드.
- SDS 페이지 젤 버퍼를 실행 하는 x 1을 사용 하 여 기본적으로 동일한 방식으로 네이티브 녹색 젤을 실행 합니다. 100 V에서 젤을 실행 하 고 완화 젤의 저항 난방을 실행 하는 동안 젖은 얼음에 전체 젤 탱크를 놓습니다.
참고: 젤 젤 (그림 1)의 하단에 도달 마이그레이션 앞에 무료 안료에 대 한 약 2 시간을 요구 해야 합니다.
7. 네이티브 녹색 젤 Thylakoid 복잡 한 밴드의 절단
참고: 젤에서 관심의 특정 밴드 절 개은 빔 경로에 배치 하 고 인근 단지에서 길 잃은 형광 수집 되지 않도록 방지 하기 위해 밴드를 허용 해야 합니다.
- 젤 전기 이동 법 셀 린스 증류수와 젤 접시의 버퍼를 실행에서 제거 합니다. 젤에서 상단 플레이트를 제거 하 고 증류수와 젤을 씻어.
- 바닥 유리 접시에 젤을 유지 하 고 얼음에 젤과 접시를 놓습니다. 때 사용 중, 어둠 속에서 젤을 유지 하 고 밖으로 건조에서 그것을 막기 위하여 플라스틱 포장으로 커버.
- 유리 접시에 남아 있는 젤, 삭제할 때 TCSPC 분석에 대 한 준비의 각 밴드. 깔끔하게 날카로운 메스 또는 면도칼 블레이드와 함께 밴드를 삭제할 및 삭제 밴드 아니 오염 밴드 자료 포함 처리.
8. 실내 온도 정상 형광 스펙트럼의 수집
- TCSPC에 의해 분석 될 것 이다 각 복합, 실내 온도 형광 스펙트럼 형광 분석기를 사용 하 여 600와 800 nm 사이 가져온 것입니다.
참고:이 스펙트럼을 수집 하는 데 사용 하는 여기 파장 TCSPC에 사용 되는 파장을 일치 해야 합니다.
9입니다. 녹색 젤 밴드 TCSPC
참고: TCSPC 설치의 묘사 그림 2 를 참조 하십시오.
- 샌드위치 두 유리 현미경 간의 젤 조각을 슬라이드. 사용 하 여 마스킹 테이프, 현미경 슬라이드 중의 각 끝에 놓이고를 슬라이드 수 있습니다 개최 함께 단단히 젤 슬라이스를 압축 하지 않고 스페이서를 만들려고 이상 여러 번 접혀.
참고: 이것은 현미경 슬라이드 사이 하 젤 조각을 통해 레이저 빔에 대 한 경로 만듭니다. - 신호 산란이 줄어 부드러운 인터페이스를 만드는 유리 슬라이드의 가장자리에 젤 조각에 물 작은 금액을 추가 합니다.
- 클램프는 빔 공격 허용 하는 젤이 샌드위치는, 유리 슬라이드의 측면을 통해 빔 경로에 수직인 형광 방출 격판덮개의 오픈 가장자리 통해 젤 슬라이스를 젤/슬라이드 빔 경로에 샌드위치.
참고: 여기 파장 사용 실험에 따라 달라 집니다. 435의 파장 nm 엽록소 a와 엽록소 b, 465 하면서 자극 한다 nm 우선적으로 엽록소 b를 자극 합니다. 이 경우, 435 nm 여기 파장으로 사용 되었다. - 각 단지에 대 한 형광 방출 스펙트럼에 걸쳐 정기적으로 10000 총 데이터 포인트를 수집 합니다. 예를 들어 수집 데이터 모든 10 nm, 시작 680 nm와 결말을 750 nm.
참고: 적절 한 신호 수집을 방지 하는 photobleaching는 그 신선한 예제 사용할 수 있도록 공부 각 단지에 대 한 여러 젤 밴드를 준비 합니다.
10입니다. TCSPC (데이터 분석)
- 주어진된 복합물을 위해 먼저 수집 하는 모든 파장에 대 한 각 감퇴 곡선의 피크 높이 정상화.
참고:이 단계는 DAS의 건설에 대 한 필요 하지 않습니다 하지만 중첩 하 여 데이터의 첫 번째 검사로 시각적으로 서로 비교 감퇴 곡선에 대 한 허용. - 꼬리-경기 각 감퇴 곡선 아래에 설명 된 복잡 한의 정상 상태 형광 스펙트럼을.
- 이후 부패 신호 몇 나노초 후 일반적으로, 밖으로 평평 했다 timepoint 선택 하십시오.
- 각 파장에 대 한 정상화 감퇴 곡선 선택한 timepoint에 신호 강도 그 파장에 정상 상태 형광 스펙트럼의 값 (즉, 선택한 timepoint에 함께 한 모든 파장의 값 다시 만들어집니다 정상 상태 형광 스펙트럼을).
- 아래 설명 된 대로 일치 하는 꼬리 감퇴 곡선에서 부패 부 스펙트럼 (DAS) 구축.
- 데이터를 사용 하 여 꼬리 일치 감퇴 곡선에서 일정 한 시간 간격으로 파장 대 형광 강도 그래프는 플롯의 시리즈 구성 (예를 들어, 모든 10 ps). 예를 들어 50 ps에서 DAS 파장 대 50 ps에 각 감퇴 곡선의 값을 플롯 하 여 생성 됩니다.
- 시간이 지남에 형광 스펙트럼의 감퇴를 보여 주는 폭포 스타일 음모를 만드는 부패 관련 된 스펙트럼의 모든 오버레이.
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Representative Results
녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 레인 1 시금치 thylakoids, 명확 하 고 날카로운 녹색 밴드의 최대 수를 볼 수 있습니다의 녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 이상적인 결과의 예를 제공 합니다. 이러한 결과 다소 불규칙 하 고, 일부 레인 1에서 본 밴드의 모든 정상적으로 주어진된 샘플에 존재 하기 때문에. 추가 샘플 정리, 엽록체 격리 thylakoid 가용 화, 그리고 그라데이션 젤 전기 이동 법 (4-7% 아크릴 아 미드)는 또한 일반적으로 최적의 결과 달성 하는 데 필요한 전에의 형태로. 레인 2와 함께 5% 비 그라데이션 젤 여기 상세한 프로토콜을 사용 하 여 달성 3 현재 더 많은 전형적인 결과 이다. 4, 5, 및 6 차선 증가의 thylakoid 샘플의 가용 화에도 불 쌍 한 결과의 예를 제공 합니다. 레인 7 시금치 대신 애기 thylakoids로 일반적인 결과의 예를 제공 합니다. Note는 애기 젤 상단에 megacomplex 밴드 하는 경향이 제대로 해결 될 그 시금치에 비해.
네이티브 녹색 젤 밴드에서 데이터를 수집 하기 위해 사용 하는 TCSPC 설치의 그래픽 묘사는 그림 2에 표시 됩니다. 그림 3 단계 10에서에서 설명한 대로 TCSPC 데이터 수집 후 분석을 시작을 위한 일반적인 워크플로 보여 줍니다. TCSPC 데이터를 수집 하는 때 주어진된 파장에 각 곡선의 데이터 요소, 또는 "계산" 임의의 수를 나타냅니다. 겹치더라도 이러한 커브는 하나의 또 다른, 그림 3A와 같이, 곡선 비해 수 없습니다 서로 직접 같은 규모에 표시 되지 않습니다 때문에 모두 동일한 시작 시간 지점으로 등록 수 있습니다. 데이터 분석의 첫 번째 단계는 해당 악기 응답 함수 (IRF)에 각 곡선 비교 하 따라서입니다. 주어진 곡선 IRF의 피크 시간 t로 설정 되어 = 0, 그림 3B와 같이 해당 형광 감퇴 곡선의 첨단 중첩는 IRF의 첨단으로 설정 됩니다. 이것을 나중에 분석에 대 한 동일한 시간 등록 모든 커브를 설정 합니다.
DAS의 건설에 대 한 필요는 없습니다, 하는 동안 유용한 비교를 곡선 데이터의 첫 번째 분석으로 만들 수 있습니다이 시점에서 모든 커브 같은 피크 높이를 정상화. 그림 3C, 그림 3A 에서 제시 하는 LHCII에 대 한 동일한 감퇴 곡선 그림 3B, 그리고 피크 높이 정규화 시간 등록 후 표시 됩니다. 그림 3D에서 볼 있듯이, 다른 단지에서 피크 정규화 감퇴 곡선 수 다음 수 중첩 하나의 또 다른 수를 단지 행동에 차이 수 있도록 주어진된 파장에. 예를 들어 LHCII는 천천히 부패 독특하게 긴 형광 PSI 형광 강하게 래 아주 급속 하 게 부패 하는 반면. 있기 때문에 명확 하 게 복 형 밴드 5 형광 감퇴 곡선 부분에 매우 암시 데이터의 흥미로운 예제를 제공 합니다. 밴드 5 복잡 한에 대 한 초기 형광 감퇴 곡선 약 500 ps PSI로 동일 요금을 다음과 같이 아직 이후 더욱 빠르게 부패. 이 종류의 결과 흥미로운 건설 부패 관련 스펙트럼 (DAS)에 의해 더 자세히 분석할 수 있습니다.
그림 4, 대표 DAS 폭포 플롯 복잡 한 LHCII 및 밴드 5 표시 됩니다. 먼저 DAS의 건설은 주어진된 복잡 한에 대 한 감퇴 곡선 꼬리-일치 복합, 실내 온도 형광 스펙트럼 필요 단계 11.2에서에서 설명 된 대로. LHCII에 대 한 일치 하는 꼬리 감퇴 곡선의 결과 그림 4A에 표시 됩니다. DAS는 단계 11.3에서에서 설명 된 대로 이러한 곡선에서 다음 구성 됩니다. LHCII에 대 한 DAS 그림 4A 에서 감퇴 곡선에서 건설 되었다 고 결과 그림 4B에서 표시 됩니다. 0과 100 ps 사이의 DAS 명확성을 위해 생략 되었고 격리 된 LHCII에 대 한 모든 100 ps 독특하게 느린 부패 때문에 그 후에 표시. LHCII에 대 한 DAS는 동적 특징의 부족에 대 한 주목할 만한 하 고 LHCII 형광 스펙트럼의 모양은 시간이 지남에 따라 신호 부패 한다 동일 하 게 유지. 형광 스펙트럼의 부패 또한 최대 형광 도달 100 ps를 요구, 지연 됩니다. 이 제안, 단백질 복합물을 수확 하는 고립 된 빛에 대 한 예상 대로 에너지 전송 되지 않습니다 형광 부패 한다로 단지 내에 정력적으로 뚜렷한 안료 사이. 이 예외는 처음으로 100 ps의 복잡 한 동안 여기 에너지의 초기 재분배 때문에 아마도 중에 발생 하는 스펙트럼의 변화.
밴드 5 복잡 한 DAS 그림 4C, LHCII에 대 한 표시 된 비슷한 패션에에 표시 됩니다. 밴드 5는 여러 가지 방법으로 LHCII에는 교육적 대조를 제공합니다. LHCII에 비해, 형광 밴드 5에서 부패 훨씬 더 빠르게만 30 ps에서 최대 강도 도달 하 고 500 ps 후 초기 강도의 20% 미만 부패. 복잡 한 밴드 5의 형광 스펙트럼 또한 방출 자연 붕괴도 흥미로운 역학의 숫자를 전시 한다. 에서는 명확 하 게 0와 60 ps에서 스펙트럼 비교 720에서 형광에 증가 비용 680, 710 nm에서 형광 nm. 이후, 690 쪽으로 680 nm 교대에서 피크 nm 및 710 쪽으로 다시 720 nm 교대에 피크 동안 확장 nm (예., 500 ps 60 ps를 비교). 이 형식의 데이터 PSI 안테나를 결국 PSI 코어 LHCII에서 에너지 전송에 대 한 증거를 제공 하는 동안 연결 되지 않은 LHCII 안테나 단백질의 존재를 배제 하는 데 도움이 됩니다.
이러한 역학 또한 것이 좋습니다 수 해결 되지 않은 봉우리 약 680는 nm, 690 nm, 710, 및 720 nm. 이 데이터는 어디 스펙트럼 기능 해결 될 수 더 가까이 간격 TCSPC 데이터를 수집 하 여 예에 따라서 제공 합니다 (예: 모든 5 nm 보다는 모든 10 nm). 그러나, 높은 스펙트럼 분해능의 부재에도 밴드 5 복잡 한 DAS는 단지 내 여러 fluorescing 종 간의 에너지 전송에 대 한 증거의 예입니다. 거기 또한 나타납니다 740 위에 급속 하 게 부패 피크 nm, 제안 데이터는 또한 스펙트럼 특징 더를 포함 하는 광범위 한 스펙트럼을 통해 수집 한다.
그림 1: 대표 녹색 젤 결과. 녹색 젤 밴드 TCSPC 분석 대상이 PSI-LHCII 표시 됩니다 (photosystem 나 LHCII 고급), PSI (photosystem 나 LHCI), 밴드 5 (PSI LHCII 복잡 한), PSII-LHCII (photosystem II 및 빛-수확 복잡 한 II 관련), PSII (photosystem II 코어 복잡 한), 및 LHCII (라이트-복잡 한 2 차 수확). 레인 1 가용 화와 녹색 젤 전기 이동 법 4-7% 아크릴 그라데이션 젤에 전에 엽록체 격리에서 발생 하는 이상적인 밴딩 패턴을 보여 줍니다. 레인 2와 3에 비 그라데이션 5% 아크릴 아 미드 젤 간단한 thylakoid 절연 및 전기 이동 법에서 평균 결과 보여줍니다. 4-6 차선 가용 화에서의 증가 심각도 표시. 레인 7 간단한 프로토콜을 사용 하 여 애기에 대 한 대표적인 결과 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시간 상관 단일 광자 세 악기의 도식. 광원은 수 동적으로 모드 잠금 NdYVO4 레이저 캐비티 버려진된 염료 레이저를 펌프 하는. 변수 반복 속도 파장에 5 ps 펄스는 autocorrelator를 사용 하 여 특징입니다. 펄스는 참조 포토 다이오드 및 샘플 흥미로운 나머지 하려고 하는 한 부분으로 분할 된다. 샘플 방출 현미경 목표를 사용 하 여 수집 하 고 편광된 구성 요소는 두 검색 채널을 사용 하 여 검색. 샘플 방출 시간은 어디, 검출 전자 제품을 사용 하 여 CFD 상수 분수 판별자, 전술 = = 시간에 진폭 변환기, 그리고 MCA = 다중 채널 분석기. 시간 해상도 악기 응답 함수 (ca. 40 ps)에서 결정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표적인 원시 TCSPC 데이터와 정규화 된 형광 부패 곡선. (A) LHCII에 대 한 원시 TCSPC 데이터의 오버레이. TCSPC 데이터 수집 된 모든 10 nm 670 nm 740 nm (B) A 대표 곡선 표시 시간 등록 악기 응답 함수 (IRF)에 형광 데이터의 사이. (C) (A)에서 LHCII 데이터 1의 최대 피크 높이를 정규화 커브 모두 그들의 각각 IRFs에 등록 했다. (D) 형광 붕괴의 오버레이 680에서 곡선 PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII, 및 밴드 5 nm. 모든 감퇴 곡선 1의 최대 피크 높이를 정상화 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 폭포-스타일 DAS의 건설. (플롯 A) 꼬리 DAS의 건설에 대 한 준비에 LHCII 감퇴 곡선의 일치 합니다. (B) DAS LHCII에 대 한 시간 t에 대 한 플롯 = 0, 모든 100 ps 100에서 500 ps 1000 추 (C) DAS에서 플롯 밴드 5 t에서 모든 30 ps = 0 210 ps 및 모든 100 ps 500 ps 그 후. 모두 (b)와 (C), 시간 = 0은 40 추 IRF에 의해 정의 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
성공적인 thylakoid 가용 화 및 실행 기본 젤 중요 한 왜곡 없이 젤에 여러 가지 표시 녹색 밴드의 해상도 또는 밴드의 번짐 발생 합니다. 젤 오버 로드, 높은 세제 농도, 잘못 된 샘플 pH으 소재, 젤 너무 빠르게 또는 너무 높은 온도에서 실행 되며 잘못 부 젤 제대로 해결된 thylakoid 단지에 기여할 수 있는 모든 요소. 젤 자체의 조건 최적화 하는 동안 (예., 아크릴 그라데이션 농도), 그것은 관심의 밴드의 해상도 최대화 하기 위해 도울 수 있다. 그것은 우리의 경험을 가용 화 조건 및 시료 자체의 생물학은 품질과 수량 thylakoid 단지 네이티브 녹색 젤에 해결에 기여 하는 가장 중요 한 요인. 그것은 모든 단지 모든 생물 조건 하에서 있을 것입니다 기억 하는 것이 중요입니다.
네이티브 녹색 젤은 정상적인 SDS 페이지 미니 젤 본질적으로 동일한 방식으로 따라 진다. 젤 아침에 부 수 하 고 나중에 같은 날, 사용할 준비가 또는 젤에 빗 몇 일 및 성능에 중요 한 변경에 대 한 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 표준, 쉽게 사용할 수 있는 39:1 C 아크릴 솔루션 스택 및 해결 젤을 부 어 사용할 수 있습니다. 소위 "큰 공" 젤 높은 acrylamide:bis를 사용 하 여 만들 수 있습니다-아크릴 비율 (예., 100: 1 C) 하지만 우리는 젤 상단에 고급의 분리를 증가 시키기 위해이 또한에 급격히 발생 하는 경향이 발견 해결 밴드. 우리의 경험에서는, 5-7%의 선형 아크릴 아 미드 농도 기온 변화도 낮은 C 비율에 밴드 고해상도 (밴드 구분의 가장 큰 수)으로 이루어집니다. 그러나, 전 그라데이션 사용할 수 없는 경우, 매우 만족 스러운 밴드 분리 및 해상도 달성 될 수 있다 약 5%의 해결 젤 농도와 아크릴. 그것은 중요 한 그 전기 수는 단지 변성, 젤의 난방을 감소 하 고 높은 해상도로 서로에서 분리 네이티브 단지 상대적으로 낮은 전압에서 실시.
여기에서 주어진 thylakoid 격리에 대 한 방법은 빠른 하지만 상대적으로 "더러운" (즉, 다른 세포 또는 다른 세포 막에서 thylakoid 막에서 엽록체를 분리 하려고 시도 하지 않습니다). 이것은 단백질만 엽록소를 포함 하는 시각 이후 thylakoid 단지 및 후속 형광-기반 측정, 머릿속의 목적을 위해 충분. 주목 해야 한다 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 (예., 두 번째 차원 SDS 페이지 및 단백질 검출), 비 thylakoid 단백질 있을 것입니다. 또한 엽록체 가용 화, 가용 화 전에 불용 성 물질의 제거로 인해 아마도 전에 격리 때 최고의 해상도 달성은 주목 한다. 때는 메서드는 여기에 설명 된 다음, 다른 균질 방법 같은 믹서 기를 사용할 수 있습니다, 하지만 유리 Dounce 균질 화기 신속 하 고 효과적 이며 수 있습니다 양적 유지 하려면 모든 무 균된 잎 자료. 버퍼-잎 물자의 비율 우리의 지식에 중요 한 표시 되지 않습니다. 약 2 mL 한 버퍼의 아기 시금치 잎의 절반 편리한 출발점 이지만 실험 필요에 따라 조정 될 수 있습니다.
엽록소를 가용 화 버퍼의 적절 한 비율 녹색 젤 성능의 최적화를 위해 중요 이며 특정된 식물 종 또는 실험적인 체제에 대 한 실험에 의해 결정 되어야 한다. 적절 한 가용 화 흰 전 분 펠 릿 위에 명확 하 고 깊은 에메랄드 그린 상쾌한 발생 합니다. 하얀 펠 릿 위에 녹색 물자의 레이어는 thylakoids에서 solubilized 되었습니다 나타냅니다. 그것에 밴드의 번짐 등 젤 불 쌍 한 마이그레이션 높아집니다과 정확한 밴딩 패턴을 제공 하지 것입니다로 가용 화에서 피해 야 한다. 이 메서드에 의해 생성 thylakoid 펠 릿 resuspend을 solubilize 쉽게 해야 합니다. 신속 하 고 균질 resuspended 수 있는 소형 펠 릿의 경우 다른 방법은 것이 좋습니다. 샘플 먼저 다음 추가 된 세제의 2 배 농도 포함 하는 TMK 글리세롤 버퍼의 추가 반 볼륨 TMK 글리세롤 버퍼의 절반 볼륨에 resuspended 수 있습니다.
그것은 어떤 megacomplex 밴드의 밀도의 손실에 발생할 수 있습니다,-가용 화 또한 피해 야 한다. 또한, 그것은 젤에 샘플의 더 큰 볼륨을 로드 하 여 오버 가용 화에 대 한 만들 수-우리는 분리;의 품질을 감소 로드에 1.5 m m 젤 잘 당 샘플의 15 μ 발견 비록, 이렇게 하는 것은 단지 낮은 풍부한 시각화 하려면 바람직한 수 있습니다. 반대로, 15 μ 향상 시킬 수 있는 보다 적게 로드 밴드 해상도 번짐 줄어들지만 일부 저밀도 밴드의 가시성을 감소 시킬 것 이다. 일반적으로, 증가 단백질 농도 세제 농도 증가 밴드 왜곡을 하 고 번짐 젤.
시간 상관 단일 광자의 녹색 젤 복합물 (TCSPC) 분석 계산, 대 여기 및 방출 파장 실험 그들의 판단에 의해 선택 되어야 한다. 그러나 우리의 목적을 위해 선택한 흥분 파장은 435 nm, 엽록소 a와 엽록소 b. 다른 파장 수를 자극 하는 것입니다, 특정 chlorophylls 또는 다른 안료를 더 선택적으로 자극 하는 데 사용 되는 (예를 들어, 는 여기 파장 약 465 nm 우선적으로 엽록소 b를 자극 것입니다). 740 680에서 영역 덮고 마찬가지로, 형광 방출 스펙트럼 nm LHCII, PSI과 PSII 보고 방출 스펙트럼에 따라 선정 되었다. 따라서,이 지역 우리의 목적에 대 한 관심의 모든 관련 스펙트럼 기능을 다룹니다. 데이터를 수집 하는 파장 간격은 실험의 재량까지 있습니다. 모든 5와 같은 짧은 간격 대신에 모든 10 nm nm, 가능 하 게 됩니다 자세한 부패 관련 된 스펙트럼을 구성 하지만이 더 많은 시간이 필요 하 고 필요 하지 않을 수 있습니다. 반대로, 더 긴 간격으로 관련 스펙트럼 정보를 해결 하려면 실패할 수 있습니다.
단순히 overlaying 정규화 된 형광 다른 단지에서 감퇴 곡선 그 단지에 대 한 공개 정보를 제공할 수 있습니다. LHCII에서 형광 등은 PSI 자연 붕괴에서 형광 동안 독특하게 긴 훨씬 더 빠르게입니다. 케어는 악기 응답 함수 (IRF) 관찰된 붕괴 속도 악기의 응답 시간에서 일시적으로 해결 되도록에 대 한 데이터를 검사 하이 시점에서 취해야 한다.
건설 부패 관련 (DAS) 스펙트럼 TCSPC 데이터에서 보고 격리 감퇴 곡선에서 가능한 보다 단지 내 chromophores 사이의 에너지 전송의 훨씬 더 상세한 사진을 만듭니다. DAS 때, 꼬리 TCSPC 감퇴 곡선 정상 상태 형광 스펙트럼을의 일치 때문에 필요한 TCSPC에 의해 수집 된 신호 강도 임의의. 그러나 5000 ps 등 오랜 시간 점에서, 주어진된 파장 (부패의 "꼬리")에서 형광 강도 그 파장에 대 한 정상 상태 형광 강도 동일. 정상 상태 형광 스펙트럼 그들의 꼬리는 정상 상태 스펙트럼에 해당 모든 TCSPC 자연 붕괴의 정상화에 따라서 사용할 수 있습니다. 이 각 감퇴 곡선에 대 한 형광 신호의 진정한 상대 강도 제공합니다. DAS, 겹치더라도 함께 폭포 플롯 스타일에서의 전체 시리즈는 시간이 지남에 형광 스펙트럼의 감퇴의 그래픽 묘사를 제공 한다. 음모는 충분히 시간 포인트 (감퇴 곡선의 꼬리)를 실시 하는 경우 정상 형광 스펙트럼을 폭포 플롯 붕괴 것입니다. 가장 이른 시간 포인트, 다른 한편으로, TCSPC 악기의 응답 함수에 의해 결정 됩니다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
자금 지원과 미시간 주립 대학에 화학의 부에 의해 제공 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
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