Summary
Здесь мы представляем протокол для разделения тилакоидов растворимых комплексов электрофорезом геля родной зеленый. Основные шаги для анализа данных предоставляются и впоследствии зеленый гель полосы характеризуются по время коррелирует одного фотонов подсчета (TCSPC).
Abstract
Свет реакции фотосинтеза осуществляется серия пигментированной белковых комплексов в тилакоидной мембраны. Стехиометрии и организации этих комплексов высокодинамичные как длинные, так и шкал короткое время благодаря процессам, которые адаптируют фотосинтез к изменяющимся условиям окружающей среды (то есть, не фотохимического тушения, переходы между состояниями и Долгосрочный ответ). Исторически эти процессы были описаны спектроскопически с точки зрения изменений в хлорофилловое свечение, и спектроскопии остается жизненно важным методом для мониторинга фотосинтетической параметров. Существует ограниченное количество способов, в котором основной белок сложной динамики могут быть визуализированы. Здесь мы описываем быстрый и простой метод для разделения с высоким разрешением и визуализации тилакоидов комплексов, родной зеленый гель-электрофорез. Этот метод в сочетании с коррелированных по времени одиночных фотонов, считая подробных характеристик свойств флуоресценции хлорофилла полос, разделенных на зеленый гель.
Introduction
Фотосинтетические организмы должны постоянно корректировать их физиологии изменения экологических условий, чтобы максимизировать их производительность и успешно конкурировать с соседями1. Это особенно верно в отношении механизма, ответственного за свет реакции фотосинтеза, как освещенности условия может колебаться на трех порядков между тенями и полного солнечного света. Кроме того экологические факторы, такие, как засухи, холода или тепла стресс может уменьшить наличие углекислого газа для фиксации углерода, который является естественным электрона раковина для продуктов реакций света. Растения должны, таким образом, урожай и максимально эффективно использовать солнечной радиации при сохранении способности рассеивать избыток энергии света при необходимости. В то время как фотоокислительного ущерб по-прежнему происходит регулярно в всех условиях освещения2,3, неспособность управлять энергии поглощается возбуждения успешно может привести к катастрофическим клеток от повреждения и смерти. Существует несколько адаптивной механизмов, которые позволяют фотосинтетического аппарата быть настроены как изменения в существующих экологических условий, так и временные колебания (т.е., более длинные и короткие сроки)4. К ним относятся долгосрочный ответ (LTR) и не фотохимического тушения (ЕНОЛ). ЕНОЛ само по себе считается охватывать по крайней мере три других компонента явлений, включая переходы состояний (qT), быстро индуцибельной энергии закалочные (qE) и фотоингибированию (Ци)5.
Эти процессы были первоначально наблюдается и во многом определяется спектроскопических явления [например, ЕНОЛ относится к падению в наблюдаемых хлорофилловое свечение (тушения флуоресценции хлорофилла), это не за счет увеличения темпов Фотохимия]6. Термин «переходы состояния» аналогичным образом относится к наблюдаемые изменения в относительное количество флуоресцирования из PSI и PSII7. В то время как спектральные методы, которые сделали возможным перечисление этих явлений [в частности, амплитуда импульса модулируется отдела Флуоресценция (PAM)] и продолжают оставаться жизненно важным средством для наблюдения и рассекает фотосинтетических процессов в VIVO, немало биохимии необходима для выяснения механизмов, лежащих в основе этих спектроскопических наблюдений. Состояниями, например, включает в себя цикл фосфорилирования/дефосфорилирования белков LHCII STN7 киназы и фосфатазы TAP38/PPH1, соответственно8,9,10. Этот цикл регулирует физическое распределение LHCII антенны между двух фотосистем, перемещая часть тримеры LHCII от PSII к PSI, изменив таким образом поглощение сечения фотосистемы11,12. QE компонент ЕНОЛ быстро преобразует энергию избыток возбуждения в тепла через действия виолаксантина/зеаксантин эпоксидирования/деэпоксидации цикла и ОВО белка. Точная роль ОВО в этом процессе является еще не полностью понимает13. Обычно компонент Ци ЕНОЛ, фотоингибированию, приписывается повреждения D1 белок PSII. Восстановление полной фотосинтетической компетенции требует сложный ремонт процесс исправить поврежденные PSII photocenters. PSII ремонт цикл включает миграцию PSII комплексов из granal стеки, демонтаж комплексов, замена поврежденных D1 белков, сборка PSII комплексов и движение PSII комплексов обратно в granal стеки14. Точный характер фотоингибированию и PSII фотоповреждения остается предметом пристального внимания15.
Трудность в изучении явлений как государство переходы или PSII ремонт частично обусловлена тем фактом, что существует не один простой способ визуализации механики сложных биохимических систем. Классический биохимических подход к пониманию процесса является сначала отделить его компонентов, так что они могут быть охарактеризованы в изоляции. Родной гель-электрофорез возникло от успешных усилий в 1980-х для разделения и характеризуют комплексы фотосистем от тилакоидной мембраны с более препаративные методы (а именно сахароза градиентного центрифугирования и хроматография)16. Моющих систем, разработанных для нежно солюбилизировать последнего родной комплексы из тилакоидных мембранах вскоре были адаптированы для электрофоретического разделения методы, прежде всего, Аллен и Штелин17 и и Петра и Thornber18, рождая электрофорез геля для родной зеленый. В то время как представляющих только один из различных методов экспериментальной арсенала, родной страница имеет ряд привлекательных характеристик, которые сделали его метод широко занятых в исследованиях фотосинтеза. Собственные страницы относительно быстро и просто, требующих мало специализированное оборудование, обеспечивая высокое разрешение разделение большого числа тилакоидов комплексов одновременно. Это делает родной страница удобным инструментом для изучения динамики тилакоидов и, в сочетании со стандартной страницы второго измерения, а также разнообразные системы моющего средства и буфера, универсальная система для поиска и характеристике новых комплексов тилакоидов.
Это, как говорится, родной зеленый гели имели репутацию ненадежного техники, особенно в неопытных руках, как это легко производить плохие результаты, состоящий из нечеткой, замазанных текстов гели с несколько полос. Эта проблема была решена, в частности, с введением сине родной страница19. Использование красителя coommassie в системе буфер BN делает разделение белков более надежным. Таким образом BN-страница часто проще и надежнее техника для относительного новичка настроить и может обеспечить высоким разрешением цветоделение тилакоидов комплексов. По этим причинам BN-страница стал методом выбора для большинства работы этого поля. В то время как BN-страница обычно медленнее, для запуска, чем зеленый гель-электрофорез, его основным недостатком является то, что coommassie краски для окрашивания вмешивается идентификации слабый хлорофилл содержащих полос, а также ниже по течению спектральные характеристика проблематичным.
Биохимические информация, предоставленная родной гели и 2D SDS-PAGE может быть значительно укреплен, в сочетании с данными от спектроскопических методов. Независимо от системы работают, Центральная проблема с использованием родного гели для выявления комплексов является, что идентификация всегда может быть оспорено (т.е., белки найти в группе может всегда представляют comigrating комплексов или компоненты, скорее чем одно физиологически аутентичные комплекс). Спектральные характеристики обеспечивает биофизической информации о пигментах в полосы зеленого геля и может использоваться для определения, какие типы комплексов они могут содержать. Хлорофилловое свечение является особенно полезным в этом отношении из-за часто резко различных спектров и флуоресценции продолжительностей жизни, которые характерны для различных фотосинтетический пигмент белковых комплексов. В то время как простой установившемся 77K спектры флуоресценции исторически были полезны в подтверждение личности родной гель комплексов, современных коррелированных по времени одиночных фотонов подсчета (TCSPC) может обеспечить гораздо больше информации. TCSPC позволяет не только характеристика комплексов на основе флуоресценции продолжительностей жизни, но также делает возможным подробное описание передачи энергии между спектральных составляющих в рамках комплекса. Такого рода характеристика становится все более необходимой, как использование различных систем спреды родной гель и обнаруживаются новые предполагаемые комплексы, позволяя выявление белковых комплексов лучше пройти проверку подлинности и предоставление новых биофизической информации о том, как работают эти комплексы.
В этой статье мы предоставляем метод, который позволяет тех, кто имеет мало или нет опыта с родной гель-электрофорез для достижения высокого качества резолюции родной тилакоидов комплексов для целей расследования механики легких реакций фотосинтез. Эта базовая техника затем могут быть расширены на усмотрение экспериментатора улучшить результаты или расширить применимость других видов. Мы затем описать процесс для подвергая родной гель зеленые полосы TCSPC, а также некоторые шаги для базового анализа и представления данных, предоставляемых методом. Муфта родной гель-электрофорез с TCSPC анализом расширяет полезность этих систем гель, предоставляя аутентификации и биофизические характеристики белковых комплексов в пределах полосы. Зеленый гель системы, описанные здесь основана на разработанной Аллен и Штелин17 с некоторыми изменениями и является таким же, как используется в Шварц и др. 20. Эта система является одним из многих, но имеет специфические особенности, которые являются полезными для этой методологии. Это достаточно быстро, так что тилакоидов изоляции, электрофорез геля и TCSPC анализ удобным может выполняться в один день, позволит устранить потенциальные проблемы хранения проб и деградации. Мы также считаем, что этот метод является надежной в руках неопытных пользователей, обеспечивая результаты этого диапазона от хорошего до начальника, в зависимости от степени оптимизации.
Важно иметь в виду, что зависит от комплексов, визуализируется на родной гель моющего средства и буферной системы, используемые, а также на биологию организма под следствием. Различных моющих средств и буферной системы преференциально отдельных видов различных комплексов, и данный фотосинтетических организмов будет иметь различные комплексы от других живых организмов, не все из которых будут присутствовать при любых обстоятельствах. Системы, описываемой здесь особенно подходит для изучения мегакомплексов PSI, как описано в Шварц и др. 20, но он падает на более дестабилизирующее конце спектра для тех, кто обучается PSII мегакомплексов. Для всестороннего изучения различных моющих средств и буфера систем, используемых в родной гель-электрофорез тилакоидных белков рекомендуется пересмотреть ярви и др. 21 и Рантала и др. 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. штока решения подготовка для наливания родной зеленый гели
- Подготовьте 4 x концентрированной буферный раствор для разрешения гели, состоящий из 40% глицерина, глицин 200 мм и 100 мм трис-буфер с рН 8.3.
- Подготовьте 4 x концентрированной буферный раствор для укладки гели, состоящий из 40% глицерина, глицин 200 мм и 100 мм трис, буферизуются до pH 6,3.
- Храните эти буферы на 4 ° C, чтобы предотвратить рост плесени.
Примечание: Буферы стабильны для месяцев при температуре 4 ° C, поэтому рекомендуется подготовка 100-200 мл каждого буфера для дальнейшего использования. - Подготовка 1 Л 10 x работает буфер, содержащий 250 мм Tris-HCl рН 8.3, 1,92 М глицин и 1% SDS. Магазин 10 x работает буфер на benchtop.
2. Стоковый раствор подготовка для изоляции и солюбилизация тилакоидов
- Подготовка 100 мл ТМК гомогенизации буфер, содержащий буфер Tris 50 мм (рН 7), 10 мм MgCl2и 10 мм KCl и хранить при 4 ° C.
Примечание: Это основной буфер для гомогенизации и манипулирования тилакоидов образцы. В качестве альтернативы концентрированные растворы акций могут быть подготовлены и разбавляют при необходимости (трис-буфер, MgCl2и KCl могут легко храниться на benchtop концентратов 1 М). - Подготовка запасов решения тилакоидов солюбилизация моющих средств, maltoside B-децил (DM) и n октиловый B-d глюкозид (ОГ), путем растворения каждого моющего средства в ТМК буфера на 20% w / v. Замораживание при-20 ° C в 1 мл аликвоты.
- Подготовьте тилакоидов солюбилизация буфера (SB), который также является пример загрузки буфера.
- Во-первых, сделать ТМК глицерин буфера путем объединения 7 mLs ТМК буфера и 3 мл глицерина.
- Для 800 мкл буфера ТМК глицерин добавьте 100 мкл DM Стоковый раствор и 100 мкл ОГ Стоковый раствор. Храните этот SB рабочий раствор, содержащий 2% DM и 2% ОГ, Замороженные при температуре-20 ° C в 1 мл аликвоты.
Примечание: Каждый Алиготе можно разморозить и размораживают при необходимости.
3. лить зеленый мини-гели для последующего использования
- Подготовьте отдельный укладки и решении решения гелем в 15 мл одноразовые пробирки.
Примечание: Объемы предоставляемых достаточно для одного мини-гель, используя распорки плита 1,5 мм.- Чтобы сделать укладки решения гелем, смешайте 1,25 мл 4 x укладка гель буфер, 0,5 мл 40% акриламида раствор (39: 1 C) и 3,25 мл воды дать 5 мл 4% акриламида в 1 x укладки буфера. Чтобы сделать разрешая гель решение объединить 1,875 мл 4 x буфер, 0.94 мл 40% акриламида раствор (39: 1 C) и 4,7 мл воды дать 7,5 мл 5% акриламида в 1 x разрешение буфера.
- Залейте разрешая гель.
- Добавьте 50 мкл 10% Персульфат аммония (APS) решение разрешая гель, а затем добавить 10 мкл TEMED, крышка трубки и осторожно перевернуть несколько раз перемешать. Сразу же перелейте геля раствор между пластинами гель, оставив примерно 1 см между верхней части разрешая гель и нижней части гребня зубов для штабелируя гель.
- Аккуратно Пипетка 100% этанола на вершину разрешая гель до уровня геля.
Примечание: Если гель не задано в течение 15 мин, свежие APS решения следует принять и/или новых TEMED должны использоваться. - После того, как Гель полимеризуется (интерфейс между гель и этанола будет легко виден и не будет двигаться, когда отклоняется гель), залить этанола и пятно с фильтровальной бумаги.
- Залейте штабелируя гель.
- Добавить 25 мкл 10% APS для укладки решения гелем, 5 мкл TEMED, затем добавить шапку и инвертировать смешивать в том же порядке, разрешая гель. Залейте раствор гель на вершине разрешая гель, до тех пор, пока полностью заполняется пространство между пластинами и вставить гребень 10-хорошо.
Примечание: Когда готов к использованию, снимите гребень из геля и Промыть лунки с водой, убедившись, что колодцы являются прямой и беспрепятственный гелем. Гель может храниться с гребнем на месте при температуре 4 ° C для по крайней мере несколько дней.
- Добавить 25 мкл 10% APS для укладки решения гелем, 5 мкл TEMED, затем добавить шапку и инвертировать смешивать в том же порядке, разрешая гель. Залейте раствор гель на вершине разрешая гель, до тех пор, пока полностью заполняется пространство между пластинами и вставить гребень 10-хорошо.
4. изоляция сырой тилакоидной мембраны из шпината листья
Примечание: Все шаги должны осуществляться на льду, с использованием предварительно охлажденные оборудования и буферов. Рекомендуется также тусклое освещение. В зависимости от экспериментатора усмотрению и биологических процессов в рамках исследования Ингибиторы протеаз и/или фосфатазы следует добавить свежие буферы ТМК до гомогенизации.
- Полностью гомогенизировать листья шпината в буфере ТМК с гомогенизатор Dounce стекла.
Примечание: Примерно 1-2 мл буфера обычно достаточна для листьев шпината маленький ребенок. Листья шпината один ребенок обычно может обеспечить достаточно материала, чтобы загрузить несколько скважин на мини-гель 1.5 мм. - Фильтрация сырой листьев огневки для удаления нерастворимых мусора.
- Чтобы сделать простой фильтрации устройство, вырезать деликатную задачу уничтожить в половине и сложите его в четверти. Упаковать деликатную задачу очистки в нижней части одноразовые шприц 5 мл и предварительно смочить салфетку с ТМК буфера.
- Используйте поршень шприца избыток буфер из деликатную задачу очистки и убедитесь, что фильтр очистки твердо прижимается к нижней части шприц после удаления поршень.
- Пипетка листьев огневки на центр очистки фильтра и использовать поршень пройти огневки через фильтр. Соберите отфильтрованных огневки в пластиковых пробирок 1.5 мл.
- Центрифуга огневки на 5000 x g 10 мин при 4° C для пеллет нерастворимый материал, включая тилакоидной мембраны. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл ТМК буфера.
- Нормализует количество хлорофилла в каждой пробе, регулируя объем каждого образца ресуспензированы тилакоидов, так что каждый образец содержит же общее количество хлорофилла, как описано ниже.
Примечание: Это позволит каждый образец, чтобы быть солюбилизирован в том же объеме моющего средства и минимизирует вариабельность в солюбилизация из-за различий в объеме Пелле.- Чтобы извлечь хлорофилл от каждого образца ресуспензированы тилакоидной мембраны, взять 50 мкл аликвота в пробки microcentrifuge 1,5 мл и добавить 950 мкл метанола на него. Крышка трубки и смешайте переворачивать несколько раз.
- Центрифуга экстракт метанол/хлорофилла в 10000 x g за 10 мин до Пелле осажденный белки.
- Определите концентрацию хлорофилла пигмента, содержащие супернатант согласно Порра и др. 23. принять поглощения чтений 652 и 665 нм, используя спектрофотометр и 1 см кювета. Определение концентрации всего хлорофилла, используя уравнения ниже:
CHLS + b (мкг/мл) = 22.12 (Abs 652 Нм) + 2,71 (Abs 665 нм) - Используя измерения концентрации хлорофилла в качестве руководства, снимите и выбросьте некоторый объем от каждого образца, при необходимости, так что каждая трубка содержит же общее количество хлорофилла.
- Повторно Пелле тилакоидной мембраны центрифугированием в 5000 g x 10 мин удалить и удалить супернатант. Будьте осторожны, чтобы удалить все супернатант без аспирационных любой из гранул.
5. солюбилизация тилакоидной мембраны для загрузки на родной гели
- Оттепель Алиготе ТМК 30% глицерина моющим раствором (SB) и перевернуть несколько раз перемешать. Держите его на льду.
- Растворяют гранулы тилакоидов, добавив соответствующий объем SB дать хлорофилл концентрации 1 мг/мл.
Примечание: Эта концентрация является отправной точкой для нахождения оптимального солюбилизация условия, которые должны быть определены эмпирически. То же самое между образцы позволяют проводить допустимые сопоставления должны храниться концентрации хлорофилла. - Пипетка вверх и вниз несколько раз будучи осторожны, чтобы избежать вспенивания образца. Держите на льду, чтобы позволить тилакоидов образцов, чтобы солюбилизировать последнего.
Примечание: Солюбилизировать последнего по крайней мере 10 минут. Солюбилизация время должно быть достаточно долго, что разница во времени солюбилизация между выборками сводится к минимуму.
Пример: Если для солюбилизировать последнего все образцы требуются 3 минуты, то примерно 30 минут должны быть разрешены для солюбилизация. - Центрифуга растворимых тилакоидов на 10000 x g при 4 ° C до Пелле нерастворимый материал.
Примечание: Солюбилизирован тилакоидов образцы являются стабильными на льду для часов, но следует избегать хранения-70 ° c, так как циклов замораживания оттаивания может привести к потере Мегакомплекс полос.
6. разделение растворимых тилакоидных белков, родной гель-электрофорез
- Загрузите растворимых тилакоидов супернатанта подготовлен на шаге 5.4 непосредственно на родной гель подготовленных ранее. Для геля 1,5 мм нагрузка 15 мкл растворимых тилакоидов за хорошо.
- Запуск собственного зеленого геля по существу таким же образом как Гели SDS-PAGE с помощью 1 x работает буфер. Побегите гель на 100 V и место весь гель танк на мокрый лед для продолжительности выполнения для смягчения резистивный нагрев геля.
Примечание: Гель потребуется около 2 часов для свободного пигмента в начале миграции достичь нижней части геля (рис. 1).
7. иссечение тилакоидов комплекс полос от родной зеленый гели
Примечание: Вырезание конкретные группы интереса от геля необходимо разрешить группы помещается в пути луча и для предотвращения сбора бродячих флуоресценции из близлежащих комплексов.
- Удалите гель из клеток электрофореза и промыть работает буфер офф гель пластины с дистиллированной водой. Снимите верхнюю крышку от геля и промойте гель с дистиллированной водой.
- Держите гель на нижней стеклянной пластиной и поместите гель и пластины на льду. Когда не в пользе, держите геля в темноте и накрыть полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить его от высыхания.
- С гелем, оставшиеся на стеклянной пластине акцизных каждой полосе интерес, когда вы будете готовы для TCSPC анализа. Акцизный полос чисто с острым скальпелем или лезвием бритвы и заботиться, что подакцизным полоса содержит не загрязняющих материал ремешка.
8. сбор спектров флуоресценции установившегося комнатной температуры
- Для каждого комплекса, который будет проанализирован программой TCSPC спектр флуоресценции комнатной температуре принимается между 600 и 800 Нм, используя спектрометр флюоресценции.
Примечание: Длина волны возбуждения, используемые для сбора этого спектра должны соответствовать волны, используемые для TCSPC.
9. TCSPC полос зеленого геля
Примечание: Обратитесь к рис для изображением TCSPC установки.
- Сэндвич-гель срез между двумя слайдами микроскопии стекла. Используйте липкую ленту, размещены на каждом конце одной из слайдов микроскопии и сложить несколько раз, для создания прокладки, чтобы слайды могут проводиться вместе твердо без сжатия среза геля.
Примечание: Это создаст путь для лазерный луч пройти между Микроскоп слайды и через гель срез. - Добавьте небольшое количество воды в гель срез на краю стекла слайды для создания гладкий интерфейс, который позволит уменьшить сигнал рассеяния.
- Зажим, гель/слайд бутерброд на пути луча, так, чтобы луч ударяет гель срез открытого края плит, позволяя выбросов флуоресценции быть через сторону стекла слайды, в которых зажата гель, перпендикулярной траектории луча.
Примечание: Длина волны возбуждения используется будет зависеть от эксперимента. Волны 435 Нм будет волновать хлорофилла a и b хлорофилла, а 465 Нм преференциально будет волновать b хлорофилла. В данном случае, 435 Нм был использован в качестве волны возбуждения. - 10000 точек данных на регулярной основе Соберите спектра флуоресценции выбросов для каждого комплекса. Например, сбор данных каждые 10 Нм, начиная на 680 нм и заканчивая на 750 Нм.
Примечание: Подготовьте несколько полос гель для каждого комплекса быть изучены, так что свежий пример доступен в том случае, если Фотообесцвечивание предотвращает надлежащего сигнала коллекции.
10. TCSPC (анализ данных)
- Для данного комплекса сначала нормализуют пик высоту каждой кривой распада для всех длин волн собраны.
Примечание: Этот шаг не является необходимым для строительства Дас, но позволяет для распада кривых накладными и визуально сравнить друг с другом как первый осмотр данных. - Хвост матч каждой распада кривой спектра флуоресценции устойчивого состояния комплекса, как описано ниже.
- Выберите timepoint, после чего распада сигнал плоские, обычно после несколько наносекунд.
- Для каждой длины волны, нормализовать распада кривой, так что интенсивности сигнала на выбранном timepoint равным значению спектра флуоресценции стабильного состояния на том длина волны (то есть, значения всех длин волн вместе в выбранных timepoint будет повторно создать спектр флуоресценции устойчивого состояния).
- Постройте распада младший спектры (ДАС) от хвост согласованной распада кривых, как описано ниже.
- С помощью данных точек из кривых хвост согласованной распада построить ряд участков, изображая диаграммой интенсивности флуоресценции против волны через регулярные интервалы времени (например, каждые 10 л.с.). К примеру DAS на 50 л.с. построен путем построения значение каждой кривой распада на 50 л.с. против волны.
- Наложение все связанные распада спектров для создания сюжета стиль водопад, который показывает распад спектра флуоресценции со временем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты для зеленой электрофорез представлены на рисунке 1. Переулок 1 приведен пример идеальных результатов для электрофореза геля зеленым шпинатом тилакоидов, в котором видны максимальное количество четкие, резкие зеленые полосы. Эти результаты несколько нетипичных, отчасти потому, что не все группы видели в полосе 1 обычно присутствуют в данной выборке. Дополнительные примеры очистки, в виде хлоропласта изоляции до тилакоидов солюбилизация, градиент гель-электрофорез (4-7% акриламида) необходимы также и обычно для достижения оптимальных результатов. Полосы 2 и 3 настоящего более типичные результаты, достигнутые с помощью протокола подробно здесь в сочетании с гелем с уклоном 5%. Полос, 4, 5 и 6 являют собой пример плохие результаты из-за увеличения степени под солюбилизация тилакоидов образца. Переулок 7 приведен пример типичные результаты, достигнутые с Arabidopsis тилакоидов вместо шпината. Обратите внимание, что для выращивания арабидопсиса Мегакомплекс полосы в верхней части геля, как правило, плохо решаются по сравнению с теми в шпинат.
Графическое изображение TCSPC установки, используемых для сбора данных от родной гель зеленые полосы показан на рисунке 2. На рисунке 3 показана типичная последовательность действий для начала анализа, после TCSPC данные были собраны как описано в шаге 10. Когда TCSPC данные собираются, каждой кривой при данной длине волны представляет собой произвольное количество точек данных, или «считает». Когда эти кривые накладываются друг с другом, как показано на рисунке 3A, кривые нельзя сравнивать друг с другом непосредственно потому, что они не представлены в том же масштабе и не все могут быть зарегистрированы в той же начальной точке времени. Первым шагом в области анализа данных является поэтому сравнение каждой кривой его соответствующую функцию ответа инструмент (МАФ). Пик МАФ для данной кривой устанавливается в момент времени t = 0, и передний край соответствующей кривой распада флуоресценции присваивается перекрываются переднего края МАФ, как показано на рисунке 3B. Это установит все кривые в том же время регистр для последующего анализа.
Хотя не необходим для строительства Дас, нормализации всех кривых на одинаковой высоте пика в этот момент позволяет полезным Сравнение кривых, чтобы быть сделаны как первый анализ данных. В рисунке 3 cже распада кривых для LHCII, представлен на рисунке 3A отображаются после регистрации время, как рисунок 3Bи пик высотой нормализации. Как видно на рисунке 3D, пик нормированный распада кривых из различных комплексов затем может быть накладными, друг с другом при данной длине волны, позволяя различия в поведении между комплексами для отображения. Например LHCII имеет характерно долгоживущих флуоресценции, который распадается медленно, тогда как PSI флуоресценции сильно угасает, распадаясь очень быстро. Кривая распада группы 5 флуоресценции обеспечивает интересный пример очень наводящий данных, отчасти потому, что это явно двухфазный. Кривая распада первоначальный флуоресценции для группы 5 комплекс следует той же скоростью, как PSI для примерно 500 л.с пока распадов даже более быстро после этого. Интригующие результаты такого рода может быть проанализированы более подробно построения распада связанных спектры (DAS).
В Рисунок 4представитель дас водопад участки отображаются для LHCII и Группа 5 комплекса. Строительство дас сначала требует, что распад кривых для данного комплекса хвост соответствовать спектр флуоресценции комнатной температуре для комплекса, как описано в шаге 11.2. Результаты сопоставления хвост распада кривых для LHCII показаны на рисунке 4A. DAS затем построены из этих кривых, как описано в шаге 11.3. DAS для LHCII были построены от распада кривых, показано на рисунке 4A и результаты представлены в рисунке 4В. DAS между 0 и 100 ПС были опущены для ясности и представил только каждые 100 л.с. Впоследствии благодаря характерно медленное разрушение для изолированных LHCII. Дас LHCII примечателен отсутствие динамических функций, и форму спектра флуоресценции LHCII остается таким же, как сигнала убывает со временем. Распад спектра флуоресценции также задерживается, требующих 100 л.с. для достижения максимальной флуоресценции. Это свидетельствует о том, как и следовало ожидать для изолированных света уборки белковых комплексов, что энергия не передается между энергетически различных пигментов в пределах комплекса как флуоресценции разлагается. Исключением из этого является сдвиг в спектре, происходящих во время первых 100 л.с, предположительно из-за первоначального перераспределения энергии возбуждения во всем комплексе.
DAS для группы 5 комплекса показано в Рисунок 4 c, построена таким же образом, как показано на LHCII. Группа 5 обеспечивает поучительным контраст LHCII несколькими способами. По сравнению с LHCII, флуоресценции от 5 группа распадается гораздо более быстрыми темпами, достигнув максимальной интенсивности в только 30 л.с и распадаться до менее чем 20% от первоначального интенсивности после 500 л.с. Спектр флуоресценции Группа 5 комплекс также экспонатов целый ряд интересных динамики как выбросов разлагается. Сравнения спектров на 0 и 60 л.с ясно показывает увеличение в флуоресцировании на 720 Нм за счет флуоресценции 680 и 710 Нм. После этого, пик на 680 нм сдвиги к 690 нм и расширяет, во время пика 720 Нм смены обратно к 710 Нм (например., сравнить 60 л.с. до 500 л.с.). Данные этого типа помогает исключает наличие несвязанных LHCII антенна белков во время предоставления доказательств для передачи энергии от LHCII PSI антенны и в конечном итоге ядром PSI.
Эти динамики также предположить, что существует вероятность быть неразрешенные вершины около 680 нм, 690 нм, 710 Нм и 720 Нм. Эти данные таким образом пример где спектральные характеристики можно лучше решить путем сбора данных TCSPC ближе интервалы (например каждые 5 Нм, а не каждые 10 Нм). Однако, даже в отсутствие спектральным разрешением, DAS для группы 5 комплекса являются примером доказательств для передачи энергии между несколькими флюоресцирующей видов в пределах комплекса. Там также, как представляется, быстро распадаться пик выше 740 нм, предполагая, что данные должны быть собраны также более широкого спектра включить далее спектральной функции.
Рисунок 1: представитель зеленый гель результаты. Полосы зеленого геля, подвергнуты анализу TCSPC помечены PSI-LHCII (фотосистемы я LHCII мегакомплексов), PSI (фотосистемы я LHCI), Группа 5 (PSI-LHCII комплекс), PSII-LHCII (фотосистемы II и связанных с ними светособирающего комплекса II), PSII (фотосистемы II ядро комплекса) и LHCII (светособирающего комплекса II). Переулок 1 показывает идеальной диапазонов трафареты, возникающие из хлоропласта изоляции до солюбилизация и зеленый гель-электрофорез на градиент гель акриламида 4-7%. Полосы 2 и 3 показывают средние результаты от простых тилакоидов изоляции и электрофорез на гель акриламида с уклоном 5%. 4-6 полос показывают увеличение тяжести под солюбилизация. Переулок 7 показывает представитель результаты для выращивания арабидопсиса с помощью простой протокол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема коррелированных по времени одиночных фотонов, считая инструмент. Источник света — пассивно к морю режим NdYVO4 лазер, что насосы лазер демпингового краски полости. 5-ПС импульсов в переменной второгодников и длин волн характеризуются с помощью autocorrelator. Импульсы делятся с одной части собирается ссылку фотодиод и отдых, захватывающий пример. Пример выбросов собирается с помощью микроскопа цель, и поляризованный компоненты определяются с использованием двух каналов обнаружения. Пример выбросов является время, решена с помощью обнаружения электроники указано, где CFD = постоянную часть дискриминатора, TAC = время амплитуда конвертер и MCA = Многоканальный анализатор. Разрешение по времени определяется функция реагирования инструмент (ОК. 40 л.с.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель необработанных данных TCSPC и нормализованных флуоресценции распад кривых. (A) наложение необработанных данных TCSPC для LHCII. TCSPC данные каждые 10 Нм между 670 нм и показываю представитель кривой A 740 Нм (B) время регистрации данных флуоресценции в функцию ответа инструмент (МАФ). (C) LHCII данные от (A) нормированный максимальный пик высотой 1, после того, как все кривые были зарегистрированы в их соответствующих ИСБР. (D) наложение флуоресценции распада кривых в 680 нм для PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII и группы 5. Все кривые распада были нормализованы максимальный пик высотой 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: строительство водопад стиль дас. (A) хвост соответствия распада кривых для LHCII в рамках подготовки к строительству дас участков. (B) DAS участков для LHCII за время t = 0, за каждые 100 л.с. от 100 до 500 л.с., а в 1000 ПС Дас (C) участков для группы 5 каждые 30 л.с. от t = 0 до 210 л.с и каждые 100 л.с. Впоследствии до 500 л.с. Для обоих (B) и (C), время = 0 определяется МАФ, который является 40 ps. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешный тилакоидов солюбилизация и родной гель запустить приведет к резолюции несколько отдельных видны зеленые полос на гель без существенных искажений или мазать полос. Перегрузка гель, высокой концентрации моющего средства, неправильный пример рН, сжимающих материал, управлением гель слишком быстро или при слишком высокой температуре, и неправильно налил гель являются все факторы, которые могут способствовать плохо решен тилакоидов комплексов. Во время оптимизации условий геля самой (например., градиент концентрации акриламида), это может помочь увеличить разрешение полос интерес. Это наш опыт, что солюбилизация условий и биологии самого материала образца являются наиболее важных факторов, способствующих качество и количество тилакоидов комплексов решен на родной зеленый гели. Важно помнить, что не все комплексы будут присутствовать во всех биологических условиях.
Родной зеленый гели разливают по существу так же, как обычный мини-Гели SDS-PAGE. Гели можно лить в первой половине дня и готовы к использованию позднее в тот же день, или они могут храниться при температуре 4 ° C на несколько дней с гребнем в геле и никаких существенных изменений в производительности. Стандартные, легко доступных 39: 1 C акриламида решения может использоваться налить укладки и разрешая гели. Так называемые «большие поры» гели могут быть сделаны с помощью выше acrylamide:bis-акриламида соотношения (например., прочитанных C) для того чтобы увеличить отделение мегакомплексов в верхней части гели, но мы найти, что это также приводит к менее резко решена полос. По нашему опыту высоким разрешением группа (с наибольшее количество полос разделены) достигается на более низкий коэффициент C и с линейной акриламида градиента концентрации 5-7%. Однако, если бывший градиент не доступен, весьма удовлетворительным полоса разделения и резолюции может быть достигнуто с разрешая гель концентрации около 5% акриламида. Важно, что что электрофорез осуществляться на относительно низкого напряжения для уменьшения нагрева гель, который может денатурировать комплексы и разрешить собственные комплексы отделить друг от друга с высоким разрешением.
Метод для изоляции тилакоидов здесь быстрый, но относительно «грязных» (то есть, он не пытается отделить от других органеллы или тилакоидной мембраны из других клеточных мембран хлоропластов). Это достаточно для целей визуализации тилакоидов комплексов и последующих измерений на основе флуоресценции, поскольку визуализируются только хлорофилл содержащих белков. Следует отметить, что для других приложений, ниже по течению (например., второе измерение обнаружения SDS-PAGE и белка), не тилакоидных белков, будет присутствовать. Следует также отметить, что самое лучшее разрешение достигается, когда хлоропластов изолированы до солюбилизация, предположительно из-за удаления нерастворимых материалов перед солюбилизация. Когда следующий метод, описанный здесь, другие гомогенизации методы, такие как блендер могут быть использованы, но гомогенизатор Dounce стекла является быстрым и эффективным и позволяет всем гомогенизированный лист материала будет сохранена количественно. Отношение буфера для листовой материал не представляется важным, чтобы наши знания. Примерно 2 мл буфера для одного половину листьев шпината ребенка является удобной отправной точкой, но может быть скорректирована по экспериментальной потребностей.
Соответствующий коэффициент солюбилизация буфера Хлорофилл имеет решающее значение для оптимизации производительности зеленого геля и должны определяться экспериментатор для данного растения или экспериментальной установки. Надлежащего солюбилизация приведет к четкий, глубокий изумрудно зеленый супернатант выше гранул белого крахмала. Слой зеленого материала на вершине белые гранулы указывает, что тилакоидов были под солюбилизирован. Следует избегать под солюбилизация, как это приведет к плохой миграции на геле, включая размытие из полос и не будет предоставлять точную диапазонов шаблон. Тилакоидов окатышей, производимые этот метод должен быть легко Ресуспензируйте и солюбилизировать последнего. В случае компактный гранулы, которые не могут быть высокомобильна быстро и равномерно рекомендуется использовать альтернативный метод. Образцы можно сначала высокомобильна половину объема буфера ТМК глицерин, к которому добавляется дополнительный половину объем буфера ТМК глицерин, содержащий 2 X концентрации моющих средств.
Также следует избегать чрезмерной солюбилизация, как это может привести к потере плотности некоторых Мегакомплекс полос. Кроме того это не возможно компенсировать чрезмерное солюбилизация путем загрузки большего объема выборки на гель - мы нашли, что загрузки более чем 15 мкл образца в колодец на геле 1,5 мм снижает качество разделения; Хотя, это может быть желательным для того, чтобы визуализировать комплексы с низкой изобилия. И наоборот загрузка меньше, чем 15 мкл может улучшить группы резолюции и снижения размытости изображения, но уменьшит видимость некоторые низкой полосы. В целом увеличение белка концентрацию и увеличение концентрации моющего средства способствуют группы искажения и геля мазать.
Для коррелированных по времени одиночных фотонов подсчета (TCSPC) анализ зеленый гель комплексов волны возбуждения и выбросов должны выбираться экспериментатора по своему усмотрению. Для наших целей, выбранной возбуждения волны был 435 Нм, который будет волновать хлорофилла a и хлорофилл b. различных длинах волн может, однако, использоваться для возбуждения конкретных хлорофиллов или другие пигменты более выборочно (например, возбуждение Длина волны около 465 Нм преференциально будет волновать хлорофилл b). Аналогично, флуоресценции эмиссионный спектр охватывает от 680 до 740 нм было выбрано, основываясь на зарегистрированных выбросов спектры для LHCII, PSI и PSII. Таким образом этот регион охватывает все соответствующие спектральные особенности, представляющие интерес для наших целей. Также на усмотрение экспериментатор волны интервалы, на которых собираются данные. Более короткие интервалы, например каждые 5 нм Вместо каждые 10 Нм, позволит построить более подробную распада связанных спектра, но это требует больше времени и не может быть необходимым. И наоборот более длительные интервалы могут не разрешить соответствующие спектральные данные.
Просто накладывая нормализованных флуоресценции распада кривых из различных комплексов может обеспечить раскрытие информации о этих комплексов. Флуоресценции от LHCII, например, характерно долгоживущих, хотя флуоресценции из PSI разлагается намного более быстрыми темпами. Следует на данный момент для изучения данных против инструмент функция реагирования (МАФ) для обеспечения что наблюдается упадок кинетики височно разрешаются от время отклика инструмента.
Строительство распада связанных спектры (ДАС) из TCSPC данных создает гораздо более подробную картину передачи энергии между хромофоры в комплексе чем возможно просто глядя на изолированных распада кривых. При построении Дас, хвост соответствие кривых распад TCSPC спектр флуоресценции устойчивого состояния необходима потому, что интенсивность сигнала, собранные TCSPC является произвольным. В точках долгое время например 5000 л.с однако интенсивность флуоресценции при данной длине волны («хвост» распада) совпадает с интенсивности флуоресценции устойчивого состояния для этой волны. Спектр флуоресценции установившегося таким образом может использоваться для нормализации все TCSPC разлагается таким образом, что их хвосты эквивалентны спектра устойчивого состояния. Это дает истинное относительной интенсивности флуоресценции сигнала для каждой кривой распада. Вся серия Дас, когда выложил вместе в водопад стиль печати, обеспечивает графическим изображением распада спектра флуоресценции со временем. Если участки осуществляется достаточно долго времени точки (в хвосты распада кривых) участок водопад будет распадаться вплоть до спектр флуоресценции устойчивого состояния. Ранние момент времени, с другой стороны, определяется функцией ответ TCSPC инструмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Финансирование и поддержка были предоставлены Департаментом химии в университете штата Мичиган.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
References
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
