Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحصين الألبكة (باكوس لاما) مع المستضدات البروتين وإنتاج محددة مستضد "واحد المجال الأجسام المضادة"

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58471
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Division of Laboratory Animal Resources, University of Kentucky, 3River Hill Ranch

Summary

بما في ذلك التحصين وجمع الدم وعزل خلايا ب والتحديد أسلوب لإنتاج الأجسام المضادة لمجال واحد من الألبكة، وصف.

Abstract

في هذه المخطوطة، وصف طريقة لتحصين الألبكة واستخدام طرق البيولوجيا الجزيئية لإنتاج أجسام مضادة محددة مستضد مجال مفرد وأظهر. الإبليات، مثل الألبكة واللاما، أصبحت مصدرا قيماً للبحوث الطبية الحيوية نظراً لأنها تنتج نوع جديد من جسم السلسلة فقط الثقيلة التي يمكن استخدامها لإنتاج أجسام مضادة مجال مفرد. نظراً لأن الجهاز المناعي درجة عالية من المرونة، مجال مفرد الأجسام المضادة يمكن جعل العديد من المستضدات البروتين المختلفة، ووالتشكلات المختلفة حتى للمستضد، بدرجة عالية جداً من الدقة. هذه الميزات، بين أمور أخرى، جعل مجال مفرد الأجسام المضادة أداة لا تقدر بثمن للبحوث الطبية الحيوية. وتفيد التقارير وسيلة لإنتاج الأجسام المضادة لمجال واحد من الألبكة. ويرد وصف بروتوكول للتحصين وجمع الدم وعزل الخلية ب. ب-الخلايا تستخدم لبناء مكتبة تحصينا، الذي يستخدم في اختيار مجال واحد معين الأجسام المضادة عن طريق الغسل. مجال واحد محدد المفترضة الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها عن طريق الغسل تؤكدها سحب لأسفل، أليسا، أو فحوصات هلام-التحول. ثم يمكن استخدام الأجسام المضادة الناتجة عن مجال واحد أما مباشرة أو كجزء من كاشف هندسيا. وتشمل الاستخدامات جسم مجال واحد ومجال واحد على أساس جسم الحكام التطبيقات الهيكلية والبيوكيميائية والخلوية، والحية في والعلاجية. الأجسام المضادة لمجال واحد يمكن أن تنتج بكميات كبيرة كما البروتينات المؤتلف في نظم التعبير بدائية، وتنقيتها، واستخدامها مباشرة أو يمكن إجراء هندسة عكسية لتحتوي على علامات محددة أو العلامات التي يمكن استخدامها كالصحفيين في الدراسات الخلوية أو في التشخيص.

Introduction

الألبكة، وأعضاء آخرين من الأسرة الكامليد، وأصبحت مصدر شعبية لتوليد الأجسام المضادة لبحوث الطب الأحيائي1،،من23. وقد الإبليات نظام المناعة فريدة من نوعها حيث أنها تنتج الأجسام المضادة العادية فضلا عن الأجسام المضادة الوحيدة السلسلة الثقيلة التي تسمح بإنتاج أصغر بكثير من الأجسام المضادة مجال مفرد، مع الاحتفاظ بخصوصية عالية وعالية تقارب. وبالتالي، توفر الأجسام المضادة الكامليد كاشف تنوعاً مفيدة لمجموعة متنوعة من الأغراض. ويرد هنا طريقة لتحصين الألبكة وإنتاج أجسام مضادة في مجال واحد لمجموعة متنوعة من المستضدات البروتين. يمكن أن تنتج هذه الأجسام المضادة في الإبليات عبر عملية معقدة نسبيا فقط يتطلب التحصين عن طريق الحقن الصغيرة من البروتين المستهدف (antigen) و رسم دم4. بعد ذلك، يستخدم بناء مكتبة، M13 بالعاثية العرض5 والغسل مقابل مستضد المؤتلف6 لعزل وإنتاج أجسام مضادة مجال واحد مع الخصائص المرغوبة. نظراً لأن العملية يستفيد من قوة بالعاثية عرض التكنولوجيا، المستضدات خمسة أو أكثر يمكن أن تستخدم في وقت واحد للحيوان الواحد، مما يقلل من عدد الحيوانات المستخدمة والتكاليف المرتبطة بها.

أضداد الثدييات النموذجية أو المناعية هي جزيئات كبيرة تتكون من نوعين من سلاسل (2 سلاسل ثقيلة وسلاسل خفيفة 2)، التي ترتبط معا من خلال سندات ثنائي كبريتيد. هذه الأجسام المضادة كبيرة نسبيا، نستعرض الأوزان الجزيئية ~ 140-190 كاتشين للأنواع مفتش أكثر وفرة من البشر والفئران، والماعز والأرانب. بسبب هيكلها وحدة فرعية متعددة وعالية الوزن الجزيئي، وسندات ثنائي كبريتيد، يمكن المناعية الصعبة بدلاً من تنتج بكميات كبيرة، مما يجعل كلفتها عالية. في تسعينيات القرن العشرين، وقد اتضح أن تجعل الإبليات، الذي يشمل الإبل واللاما والالبكه، بالإضافة إلى نوع الثدييات النموذجية الغلوبولين المناعي، شكل جديد من الغلوبولين المناعي أن أبسط في الهيكل، تمتلك سلاسل ثقيلة فقط7. هذه الأجسام المضادة الكامليد فريدة تمتلك نفس القدرة على ربط المؤثرات الخارجية مع تقارب عالية على وجه التحديد ولكن تتكون فقط من البروتين من سلسلة8. علاوة على ذلك، يمكن أن يتم اقتطاعها الأجسام المضادة الكامليد تجريبيا إلى جزء بلغة وحدة ححالخامس حتى أصغر، تسمى أيضا جسم مجال واحد9. نظراً لصغر حجمها، مجال مفرد الأجسام المضادة هي مفيدة لمجموعة واسعة من تطبيقات البحوث الطبية الحيوية والمتاحة من مجموعة متنوعة من المصادر الأكاديمية والتجارية1،10. يبدو استثناء إلى النشاف غربي منذ أكثر في كثير من الأحيان مجال مفرد الأجسام المضادة الموجهة ضد تكيف تعتمد [ابيتوبس]، التي تضيع عادة ظروف يشوه المستخدمة في البقع الغربية.

حيث أنها تتكون من سلسلة ببتيد واحد، يمكن تحديد مجال واحد معين الأجسام المضادة وسهولة إنتاجها بكميات كبيرة المؤتلف البروتينات في البكتيريا. مجال مفرد الأجسام المضادة يمكن أيضا أن يكون وراثيا تحتوي على علامات محددة أو العلامات التي يمكن استخدامها ك "مجموعات مراسل" لتشخيص الأمراض11. يجعل هذا سهولة التلاعب مقرونا مرونة استخدام الأجسام المضادة مجال مفرد موردا هاما للباحثين في الجامعات وفي أماكن أخرى.

كما دعم جزء من "المعاهد الوطنية للصحة" الأساسية، جرى تكييف لإنتاج الأجسام المضادة لمجال واحد من الألبكة3،4الأساليب القائمة. الألبكة بمزايا كبيرة في كلا سهولة التعامل بالنسبة إلى أكبر أفراد الأسرة الكامليد، فضلا عن إمكانية الوصول. الألبكة مطروحة على نطاق واسع للحوم والألياف، وهكذا يمكن الحصول على الصعيد الإقليمي من الباكا المحلية المزارعين، الذين يمكن التعرف من خلال مواقعها على شبكة الإنترنت أو من خلال جمعيات مربي الدولة. تتوفر اثنين من سلالات الألبكة، سوري وهواكايا. هواكايا هي أكثر شيوعاً، وقد استخدمت لهذا البروتوكول، ولكن البروتوكول المنطبقة عموما أما سلالات وتنطبق أيضا على نطاق أوسع إلى أخرى الإبليات.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات مع الألبكة وفقا للبروتوكولات (2017-2627 و 2018-2925) أقرتها جامعة كنتاكي "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك).

1-توليد أجسام مضادة محددة مستضد الألبكة

  1. معالجة الألبكة واعتبارات عامة
    1. الحصول على موافقة المؤسسية و/أو تنظيمية مناسبة.
    2. الحصول على الكبار الألبكة، أقل من 10 سنوات عمر مع هيئة شرط نقاط على الأقل 3.0 (الجدول 1-5)12. لأنهم قطعان الحيوانات، البيت كحد أدنى حيوانات اثنين ولكن يفضل أن يكون الثلاثة معا.
      ملاحظة: وينصح الذكور لأنه، بشكل عام، مزاج أكثر حتى وهم أسهل للعمل مع.
    3. فحص الحالة الصحية للحيوانات من خلال دراسة الطب البيطري بما في ذلك استعراض النظام الغذائي، الإسكان، والتطعيم والطفيلي مراقبة البرامج13. التأكد من أن الحيوانات حتى الآن مع التطعيمات المناسبة للمنطقة الجغرافية المحلية استناداً إلى توصيات البيطرية المهنية. تطوير برنامج مراقبة ecto--واندوباراسيتي بالتشاور مع طبيب بيطري استناداً إلى استعراض لتاريخ القطيع المنشأ والظروف المحلية المحددة13.
    4. التأقلم لمدة أسبوع على الأقل، بما في ذلك التدريب هالتر والتعرض إلى ضبط النفس.
    5. جمع عينة دم مل 4 للحصول على مصل لاستخدامه كعنصر تحكم قبل تحصين (راجع الخطوة 1، 4). تجميد الأمصال وتخزينها في-20 درجة مئوية في مختبرين 0.5 مل.
      ملاحظة: في هذا الوقت، يمكن أن تؤخذ الدم إضافية لإجراء تحليل خلايا الدم كامل (CBC) لرصد الحالة الصحية الأولية الحيوانات.
  2. إعداد مستضد
    1. إعداد البروتين المنقي مولدات المضادات في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) أو حبيس مخزنة المالحة (HBS) والتركيز على إيه وان ملغ/مل. حوالي الساعة 3 ملغ بروتين ضروري للبروتوكول كاملة، بما في ذلك التحصين، والغسل، وتأكيدا للحيوانات المستنسخة.
      ملاحظة: عرض عالية الدقة والانتقائية ضد المستضدات البروتين الكامليد الأجسام المضادة لكن هي عموما لا يناسب للبروتينات غير منظم أو المستضدات الببتيد التي عموما غير منظم.
    2. إنشاء مستضد النقاء، مع نقاء > 90% المطلوب. استخدام أسلوب تحليلي مثل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
      تنبيه: حيث يمكن أن يكون مجال مفرد الأجسام المضادة معزولة للملوثات بدلاً من البروتين المستهدف تلوث كبيرة مع غيرها من البروتينات قد يؤدي إلى مشاكل أثناء التحديد.
    3. تحضير مختبرين المجمدة من مستضد يحتوي على ما مجموعة 100 ميكروغرام من مستضد. 50 ميليلتر من تحضير 2 مغ/مل مثالي. 100 ميليلتر من 1 ملغ/مل هو الحل البروتين مخفف الأكثر مناسبة للتحصين. وبدلاً من ذلك، إذا antigen لا تخضع للتجميد/ذوبان الجليد ومن المعروف أن يكون مستقرا في حل طويل الأجل، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لضمان المستضد يمكن الخضوع لدورة تجميد/ذوبان الجليد، الجدران اختبار ينبغي الاستغناء عن قاسمة 20 ميليلتر من antigen إلى رقيقة أنبوب بكر والمفاجئة تجميدها في نيتروجين سائل. ذوبان الجليد على أنبوب وإجراء الطرد المركزي عالية السرعة، والتحقق من استرداد كمية بمقارنة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية/فيما قبل وبعد تجميد أو عن طريق تشغيل جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي اختبار antigen للإبقاء على النشاط البيولوجي. في حالة نجاح دورة ذوبان التجميد، مستضد المتبقية هي الأداة المجمدة في 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-80 درجة مئوية. إذا كانت هناك مشاكل مع دورة التجميد/ذوبان الجليد، البروتوكول يمكن أن تتكرر بالإضافة إلى نسبة تصل إلى 20% والغليسيرول.
  3. التحصين
    1. مزيج يصل إلى خمسة مولدات المضادات، 200 مكغ كل منهما، مع adjuvant في وحدة تخزين نهائي من بين 300 إلى 1,000 ميليلتر. ينبغي أن تشكل adjuvant إيه فايف زيرو في المائة من وحدة التخزين النهائي باستخدام المياه كمخفف.
      ملاحظة: إذا كان المخزن المؤقت ضروريا، استخدم حبيس، والممسحات، أو جليكاين. وكثيراً ما تبين على pH بين 5 و 6 لتكون أكثر مواتي من محايدة تماما. تجنب أيونات التخصصات مثل الفوسفات أو حمض الليمون، نظراً لأنها يمكن أن تثير تخثر الدم.
    2. تقليم الشعر الألبكة مع لوس أنجليس كليبرز الكهربائية، في نمط هلال على طول القاعدة في الرقبة من الكتف إلى الكتف لكشف المناطق المتاخمة للعقد الليمفاوية القوس.
    3. عقد في الألبكة بالعنق، ببطء حقن مستضد تحت الجلد على طول قاعدة العنق قرب القوس الليمفاوية باستخدام إبرة ز 22. أداء خمس حقن ~ 200 ميليلتر (أو أقل) ~ 5 سم عن بعضها البعض.
      ملاحظة: وينبغي تقييد الحيوانات الموظف ثاني أثناء الحقن. الحقن ونزيف الألبكة تدعو إلى توخي الحذر نظراً لأنها عرضه للركل، ليس فقط من الخلف ولكن جانبية. وجود الحيوانات قريبة من بعضها البعض، في مجموعة، خلال الإجراءات الأمثل. نظراً لأن هم قطعان الحيوانات، وهم أكثر هدوءا في مجموعة وهناك حاجة قوية أقل من ضبط النفس أثناء الإجراءات.
    4. مراقبة الحيوانات لحقن وظيفة ~ 20 دقيقة لعلامات الحساسية المفرطة (راجع الخطوة 1، 6). رصد لالتهاب المترجمة في مواقع الحقن الأسبوعية، التي من غير المتوقع عند استخدام adjuvant الموصى بها. التأكد من أن تسرب الدم من موقع الحقن غير مفرطة.
    5. أداء خمس حقن تعزيز اللاحقة استخدام 100 ميكروغرام لكل مستضد أسبوعيا في الخليط. قص الشعر في مواقع الحقن قد يلزم أسبوعيا تبعاً للموسم. في فصلي الخريف والشتاء، شعر الحيوانات يمكن أن تنمو سريعاً.
  4. رسم الدم
    1. مقطع وتطهير الموقع جمع مع مسحات الكحول.
    2. كبح جماح الحيوان برفق مع الرقبة عقد وضع مستقيم وعلى التوالي.
      ملاحظة: يمكن تقييد الحيوانات يدوياً كما هو موضح في الفيديو. إذا كان متوفراً، استخدام المزلق الألبكة تقييد في الألبكة خلال النزيف والحقن يمكن أن تخفف من التعامل. لاستخدام شلال الألبكة، أدت إلى المظلة الألبكة هالتيريد وضبط النفس مع أشرطة الرقبة والأشرطة مع إصدارات سريعة. تتوفر إصدارات المظلة الألبكة من الموردين التجاريين.
    3. استخدام الإسقاط البطني عملية عرضية من الفقرات كعلامة بارزة، أوككلودي الوريد عن طريق تطبيق الضغط الآنسي فقط لعملية البطني.
      ملاحظة: لا يوجد أي ثلم jugular متميزة في الألبكة الكبار. ويحمي الأوردة حبل إسقاطات البطني لعمليات العمود الفقري عرضية. هذا الجلد السميك (مثلاً، 1 سم "القتال لوحة" أكثر من 1/3 الأوسط من الرقبة بالذكور) وعضلات الرقبة يجعل من الصعب تصور أو جس الوريد نفسه. وفي وقت لاحق، هو استخدام معالم العمود الفقري مؤشرات مفيدة للغاية لموقع جوجولار.
    4. أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة وسطى قليلاً (~ إصبع العرض) للإسقاط اتجاه المركز للرقبة. التلاعب الإبرة حتى تدفق الدم.
      ملاحظة: حبل الوريد والشريان السباتي قريبة من بعضها البعض. الدم الوريدي يمكن أن يكون في لون أحمر تماما ولكن لا تزال أكثر قتامة من الدم الشرياني. وبعد جمع وينبغي أن تطبق الضغط على الموقع عن 0.5-1 دقيقة (أو لفترة أطول إذا تم الوصول إلى السباتي) حتى يتم ضمان الأرقاء.
    5. رسم 4-10 مل دم لأغراض التحليل. الاستفادة من 1.5 بوصة، ز 20 إبرة عادة بالاقتران مع المحاقن الحجم المناسب أو أنابيب جمع الدم. استخدام أنابيب يدتا أعلى ك2خزامي لجمع الدم كله عند تنقية الخلايا الليمفاوية. استخدام أنابيب فصل المصل أعلى الذهب (دينار بحريني) عند جمع الدم لإنتاج المصل.
    6. رسم 50-100 مل دم لأغراض الإنتاج. استخدام ملحق إضافي 12 بوصة تسريب تعيين مع مجموعة ضخ مجنحة ز 19-20 "فراشة".
      ملاحظة: يسمح تكوين تعيين ملحق مساعد لملء أنابيب جمع الدم متعددة، والسماح فينيبونكتوريست للتركيز على تحقيق استقرار الإبرة جمع. إضافة مجموعة ضخ يستوعب الحركة المحتملة للحيوان (الإجراء 3-5 دقائق)، ويعطي مسافة عمل مريحة لمشغلي.
  5. المناعة الرصد
    1. تنفيذ ثلاثة أو أربعة أيام بعد 3rd وحقنال 5، تجاوز اختبار صغير من كل الحيوانات للحصول على الأمصال للاختبار. تجميد وتخزين الأمصال في مختبرين 0.5 مل. الحصول على عينات دم إضافية لمراقبة صحة الحيوان، وفي الوقت نفسه كما ورد أعلاه.
    2. التأكد من وجود أجسام مضادة محددة مستضد بإليزا استخدام الأمصال التي تم الحصول عليها من اختبار تجاوز الهوامش في نقاط زمنية محصنة قبل ثلاثة أسابيع وخمسة أسابيع. فمن الأفضل أن تجاوز هوامش نهائية بينما ما زال يتزايد عيار الأجسام المضادة.
    3. إنشاء لوحات تقارب مستضد استخدام لوحات 96-كذلك المعالجة السطحية. تمييع 0.1 ميكروغرام من المستضد في المخزن المؤقت لكربونات الصوديوم 100 مم، الرقم الهيدروجيني 9.0. إضافة 100 ميليلتر من الحل لكل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تخفيف العشرة لكل مستضد يتم اختبارها في مكررة. عنصر تحكم فارغاً جيدا على استعداد التي هي مغلفة بكربونات المخزن المؤقت فقط.
    4. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، عكس اللوحة إزالة محتويات الآبار وتغسل ثلاث مرات مع 0.1 مل من برنامج تلفزيوني، 0.1% 20 توين (برنامج تلفزيوني-T).
    5. كتلة الآبار عن طريق إضافة 0.1 مل من جيش صرب البوسنة (5 ملغ/مل) في برنامج تلفزيوني-T وتفرخ لوحة ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    6. أغسل لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-T عن طريق بيبيتينج الحل أغسل في البئر ثم إزالة الحل أغسل بعكس اللوحة.
    7. إعداد تخفيف شقين المسلسل من 0.3 مل كل من الأمصال قبل محصنة ومحصنة في برنامج تلفزيوني-T المخزن المؤقت باستخدام إضعاف ابتداء من 1/100، وتصل إلى 400، 1/102.
    8. إضافة 100 ميليلتر من كل تخفيف إلى الآبار والسماح لاحتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    9. إزالة المصل من كل بئر وتغسل مع 0.2 مل من برنامج تلفزيوني-T ثلاث مرات.
    10. احتضان كل جيدا مع 0.1 مل من الماعز مترافق HRP اللاما المضادة الأجسام المضادة مفتش في إضعاف 1:20,000 ح 1.
      ملاحظة: الاستجابة المناعية تقاس يشمل كلا التقليدية فضلا عن الأجسام المضادة الوحيدة السلسلة الثقيلة، التي موجودة في نسب متساوية تقريبا في الدورة الدموية3،14.
    11. إزالة الحل جسم وتغسل كل جيدا مع 0.2 مل من برنامج تلفزيوني-T ثلاث مرات.
    12. إضافة 100 ميليلتر من الركازة البيروكسيديز اللونية إلى البئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى كثافة نقاط تركيز أعلى اثنين قد تصبح المشبعة، التي عادة ما يستغرق 5-10 دقيقة.
    13. إضافة 100 ميليلتر من حامض الكبريتيك 0.1 متر لكل بئر لوقف رد الفعل.
    14. قياس امتصاص لكل بئر في 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
    15. مؤامرة امتصاص كتركيز دالة.
  6. المضاعفات المحتملة ورصد الباكا
    1. التأكد من ملائمة الألبكة الرصد طوال فترة الإجراءات.
      ملاحظة: الإجراءات التي لا يتوقع أن تسبب تأثيرات ضارة. صحة ورفاه الحيوان ينبغي أن ترصد يوميا الأفراد تربية و/أو البحوث أثناء الرضاعة وسقى. أي الحيوان مع أوناليفياتيد الاعتلال الطبيعي المستحثة تجريبيا، أو عفوية ينبغي إليها للتقييم الخدمات البيطرية مع treatment(s) تقدم حسب الاقتضاء، تصل إلى القتل الرحيم إنسانية، إذا لزم الأمر.
      هي العواقب السلبية المحتملة المرتبطة بتقدم نزيف وكدمات وورم دموي. وينبغي رصد الحيوانات لرسم الدم بعد 20 دقيقة للبحث عن العلامات للنزيف. وينبغي استخدام ضغط إضافي على المواقع. إذا لم يتوقف النزيف، وينبغي الاتصال بالطبيب بيطري.
      وتشمل الآثار السلبية المحتملة الأخرى المرتبطة بالحقن والنزيف تشكيل الحبيبي والتهاب. ليس من المتوقع تشكيل الحبيبي ولم يحترم في جامعة كنتاكي. يمكن أن يحدث التهاب موقع الحقن (احمرار أو تورم) وينبغي استرعاء انتباه الطبيب البيطري. التسييل الإنتاج يمثل وحدة تخزين كبيرة محتملة من الدم، وينبغي أن ترصد الحيوانات لضمان أن تكون مستقرة ونشطة بعد جمع الدم.
      الحساسية المفرطة والردود ﻻنبعاثات هي الآثار السلبية الخطيرة على الأرجح اثنان، ولكن نادراً ما تحترم. إذا كانت لتحدث، سوف يحدث بعد وقت قصير من حقن مستضد تاق وتتجلى بزيادة في درجة حرارة المستقيم وضعف والتقيؤ، ومشاكل في التنفس أو الإسهال. يمكن رصد درجة حرارة المستقيم بعد كل حقن الكشف عن أي زيادة في درجة حرارة الجسم. إذا كانت هذه هي المعترف بها، إعلام الطبيب بيطري فورا لتشاور. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون "تحطم الأدوات لحالات الطوارئ" (مثلاً، أدرينالين والقشرية ومضادات) أعد بالتشاور مع طبيب بيطري المتاحة لعلاج الحيوانات التي يشتبه في حدوث رد فعل سلبي.

2-تنقية الخلايا الليمفاوية لبناء مكتبة جسم مجال مفرد

  1. جمع 50 مل دم ثلاثة إلى خمسة أيام بعد الحقن الماضي (راجع الخطوة 1، 4).
    ملاحظة: التجهيز السريع للدم وعزل الحمض النووي الريبي من المهم الحصول على15،مكتبة مناسبة حجم3، هو أمر مهم جداً لنجاح الغسل.
  2. تمييع 15 مل الدم التي تم جمعها مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. استخدام أنبوب فصل الخلايا اللمفاوية لعزل الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي (ببلس) بكثافة الطرد المركزي التدرج وفقا لاقتراحات المصنوعات.
    تنبيه: إرشادات الشركة المصنعة للإشارة إلى أنه يمكن استخدام ما يصل إلى 25 مل دم، ولكن هذا قد تشبع النظام ومنع الحصول على تحضير لمفاويات نظيفة.
  4. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني بريشيليد إلى 4 درجة مئوية إلى PBL.
  5. تدور لمدة 20 دقيقة في 800 x ز في 4 درجات مئوية.
  6. تغسل مرتين بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني بريشيليد إلى 4 درجة مئوية إلى PBL متبوعاً الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز في 4 درجات مئوية.
  7. عزل الحمض النووي الريبي إجمالي استخدام عمود دوران على أساس النظام، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. مجانسة الخلايا التي فيرتيكسينج في المخزن المؤقت الملائم، وتطبيق نظام لتمزيق بيوبوليمير. استخدام عدد مناسب من ميني أو ماكسي-أعمدة تستند إلى خلية الإدخال.
  8. توليف كدنا استخدام المنتسخة العكسية عن طريق الجمع بين 10 ميكروغرام للجيش الملكي النيبالي مع مزيج من 0.1 ميكروغرام من اليغو (dT) 12-18 كبسولة تفجير.
  9. إنشاء مكتبة عاثية استخدام الأساليب المتبعة4. ويشمل هذا الاستنساخ مع إنزيمات التقييد في pMES4 ناقلات عرض بالعاثية متبوعاً بالتعبير عن إدراج تنصهر فيها الجينات الثالث بالعاثية الخيطية لإنتاج الحل بالعاثية.

3-واحد المجال جسم الغسل

  1. إنتاج لوحات تقارب مستضد استخدام لوحات 96-كذلك المعالجة السطحية. تمييع 0.25 ميكروغرام من المستضد في المخزن المؤقت لكربونات الصوديوم 100 مم، الرقم الهيدروجيني 9.0. إضافة 100 ميليلتر لهذا الحل لكل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. معطف بئرين لكل مستضد. إعداد عنصر تحكم فارغ تماما التي هي مغلفة بكربونات المخزن المؤقت فقط.
    ملاحظة: يمكن أن تنتج لوحات وتخزينها لفترة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية إذا كان سيتم إجراء جولات متعددة من التحديد. أيضا، وهذا الأسلوب يستخدم الاستيعاب المباشر الذي لا يتطلب وضع العلامات في حين تستخدم أساليب أخرى بيوتينيليشن أو أنواع أخرى من العلامات استراتيجيات.
  2. احتضان اللوحة بين عشية وضحاها. عكس إلى إزالة محتويات الآبار وتغسل ثلاث مرات مع 0.1 مل من برنامج تلفزيوني-ت.
  3. كتلة الآبار عن طريق إضافة 0.1 مل من جيش صرب البوسنة (20 ملغ/مل) في برنامج تلفزيوني وتفرخ لوحة ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  4. أغسل اللوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-T تليها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. المستضدات يمكن أيضا تساهمي المسمى واستخدامها في أنظمة التقاط مثل، على سبيل المثال، streptavidin/البيوتين النظم.
  5. قبل علاج بالعاثية الحل (100 ميليلتر) مع 100 ميليلتر من 40 مغ/مل جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني على منصة الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة حل بالعاثية antigen مغلفة بالآبار واحتضان مع الانفعالات لطيف ح 2 في درجة حرارة الغرفة. استخدام الآبار متعددة ضمانا لما مجموعة 10 بالعاثية11 لكل مستضد.
  7. تجاهل بالعاثية غير منضم بواسطة انعكاس ويغسل الآبار خمس مرات مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-T متبوعاً خمس مرات مع برنامج تلفزيوني.
  8. الوتي بالعاثية ملزمة بإضافة 0.1 مل من 0.25 مغ/مل التربسين في برنامج تلفزيوني وحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة الاهتزاز 700 لفة في الدقيقة.
  9. نقل الحل إلى قنينة تحتوي على 5 ميليلتر 4-بينزينيسولفونيل 4 مغ/مل فلوريد hydrochloride(AEBSF) إلى حل لإخماد النشاط التربسين.
  10. تنمو TG1 بالعاثية عرض الخلايا المختصة عند 37 درجة مئوية مع الهز حتى OD600 = 0.5.
  11. إضافة 50 ميليلتر من بالعاثية التيد إلى 3 مل الخلايا TG1.
  12. احتضان عند 37 درجة مئوية دون المصافحة لمدة 30 دقيقة.
  13. إضافة مل 7 رطل وسائط الإعلام وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، الجلوكوز 2%.
  14. اهتزاز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على مجال واحد الأجسام المضادة الأكثر تنوعاً، استنساخ يمكن متسلسلة، واختبار للخصائص المطلوبة، وتستخدم بعد جولة واحدة من الغسل. للحصول على تقارب أعلى مجال مفرد الأجسام المضادة، ينبغي أن تستخدم جولتين من الغسل.
  15. لوحة البكتيريا بعد استكمال النمو بين عشية وضحاها في لوحات أجار رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، الجلوكوز 2%. تخفيف المسلسل عدة سوف تحتاج إلى اختبار، بدءاً بتخفيف اثنين، وتصفيح 100 ميليلتر من 000 1/10 و 1/100,000 تخفيف.
  16. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  17. اختيار المستعمرات وتطعيم آبار صفيحة 96-جيدا العقيمة التي تحتوي على 100 ميليلتر من 2XYT مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، الجلوكوز 2%، 10% v/v والغليسيرول كل بئر.
  18. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المصافحة.
  19. وفي اليوم التالي يهز 170 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  20. إزالة 2 ميليلتر لوسائل الإعلام في أنابيب PCR. الحل المتبقي يمكن اليسار في اللوحة وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 يوما أو المجمدة والمخزنة في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
  21. إجراء تفاعل PCR باستخدام أجهزة الإشعال المناسبة لمتجه المستخدمة. ل pMES4، يتم فحص PCR كبسولة تفجير استخدامات استنساخ الإيجابية أن الجناح في موقع الاستنساخ متعددة ككتاتجككتاكجكاجككجكتجاتجتاتاك وجتجتجتجاجاجاكجتجاككتج. استخدام الدراجات الشروط المناسبة بوليميريز المستخدمة، درجة حرارة انلينغ 57 درجة مئوية، ودورات 30.
  22. تحليل تفاعل PCR بتشغيل % 1 (w/v) [اغروس] هلام. المستعمرات التي إيجابية لها مجال مفرد إدراج الجينات جسم ~ 500 هناك ضمان أن استنساخ إيجابية 20-50% من أفراد العينة.
    ملاحظة: يوفر هذا الأسلوب وسيلة لاستنساخ التحديد والتحليل التي يمكن تنفيذها في معظم المختبرات البحثية. بدلاً من ذلك، الجيل التالي تسلسل يمكن تطبيقها وتوفر مجموعات البيانات الكبيرة التي تسمح للتحليل الإحصائي ومقارنة16.
  23. تلقيح الحيوانات المستنسخة إيجابية من اللوحة إلى أنابيب جديدة تحتوي على 7 مل رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
  24. تنمو مع الهز للمبيت في 37 درجة مئوية.
  25. أداء مينيبريب على الثقافة للحصول على الحمض النووي بلازميد.
  26. التسلسل استنساخ إيجابية باستخدام معيار التسلسل التمهيدي بورصة فلسطين-القس (كاجكتتاكاكتتاتجكتككجك).
  27. إجراء تحليل الحسابية على تسلسلات جسم مجال مفرد الناتجة عن ذلك. التأكد من أن هناك لا stop codons أو يغير الإطار.
  28. تصنيف في تسلسل الناتجة عن التشابه والتنوع. تسلسلات التي حددت مرارا وتكرارا الأكثر احتمالاً أن يكون تسلسل ملزمة تقارب عالية، لا سيما بعد جولتين من التحديد.
  29. التعبير عن جسم مجال مفرد باستخدام سلالة تعبير المستمدة من BL21 من لفائف هاء-- الحث على التعبير عن طريق إضافة إيبتج، تنمو بين عشية وضحاها في 22 درجة مئوية.
  30. تنقية جسم واحد المجال اللوني المعطل تداولها تقارب معدنية (ايماك) باستخدام.
  31. التحقق من صحة مجال مفرد مستضد الضد/الربط باستخدام مقايسة تفاعل مباشر مثل التفريد جل الأصلية وسحب لأسفل، أو أليسا.
  32. تحقق من مجال تطبيق محدد واحد جسم الأداء، كما هو مطلوب لتجربة محددة.

Representative Results

واستخدم البروتوكول المعروضة هنا لتوليد مجال مفرد الأجسام المضادة ضد مجموعة من مولدات المضادات البروتين. وقد استخدمت خمسة مولدات المضادات الواحدة الألبكة. مراقبة محصنة أشارت إلى أن غالبية المستضدات أظهر بداية استجابة قوية في ثلاثة أسابيع (الشكل 1). وقد ينزف الإنتاج وبناء المكتبة بعد ستة أسابيع تقريبا يعطي أفضل توازن للحيوانات التي متعددة المستضدات حقن. جولتين من الغسل لكل مستضد، وعزل المستعمرات فرزهم (الشكل 2). تسلسل مستعمرات الإيجابية تحديد تسلسلات جسم مجال مفرد متنوعة لمولدات مختلفة. للحصول على أمثلة، استنساخ ثلاثة فريدة من نوعها كانت معزولة لمرجع مستضد مالتوس ملزمة البروتين (MBP) (الشكل 3A). كما كثيرا ما لوحظ، تحتوي على الأجسام المضادة مجال مفرد تسلسل كبيرة التنوع وطول CDR3 متغير عالية (الشكل 3). هذه الميزات ذات أهمية خاصة في مجال مفرد مستضد الضد/التفاعلات كما رأينا في مرجع مجال مفرد جسم/CX3CL1 المعقدة17 (الشكل 3B).

يمكن أعرب غالبية مجال مفرد كامل طول جسم متواليات وتنقيته في 1-10 مغ/لتر ثقافة (الشكل 4 أ). بسبب التنوع في طول CDR3، تظهر الأجسام المضادة لمجال واحد مختلف اختلاف طفيف في الوزن الجزيئي. تأكيد الربط المباشر والأداء الخاصة بتطبيق أمر بالغ الأهمية. على سبيل المثال، حدد فريق مجال واحد من الأجسام المضادة بعد جولتين من التحديد ضد "مستضد ب"، (الشكل 2). وحددت عدة سلاسل متطابقة، وأنتج جسم مجال مفرد وتنقيته. وكان ثم اختباره عن طريق سحب مباشرة أسفل مع الراتنج تقارب مستضد وأظهر قوية تعتمد على الجرعة الملزمة (الشكل 4 باء). الأهم من ذلك، أظهرت جسم مجال مفرد لا ملزم لمراقبة الراتنج. تثبت هذه البيانات هو تفاعل ربط مباشر، وواحدة التي مناسبة تماما لالتقاط تقارب في تنسيقات المنسدلة والمستندة إلى أليسا.

Figure 1
الشكل 1 : الممثل رصد المناعية المستضدات مميزة اثنين عرض الاستجابة المناعية محددة هامة لمولدات المضادات متميزة في الحيوان نفسه. وتظهر العديد من مولدات المضادات ردا قويا من أقرب ثلاثة أسابيع بعد بدء التحصين، مع غالبية عرض الاستجابة القصوى بعد ستة أسابيع. ستة أسابيع كما يسمح لتقارب النضج والوقت الموصى به لإنتاج التسييل والعزلة ب-الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : القائم على بكر تأكيدا لاستنساخ إيجابية. كبسولة تفجير تمتد MCS ناقل pMES4، وتنتج استنساخ نانوبودي إيجابية أمبليكون ~ 500 bp (علامة *). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : متواليات محددة مستضد تسليط الضوء على التنوع جسم مجال مفرد الألبكة. (أ) محاذاة تسلسلات جسم حدد مجال مفرد معزولة إلى MBP 4XT1 جسم مجال واحد مرجع، مع إطار والتكامل-تحديد المناطق (كابات) المبينة أدناه. (ب) هيكل الألبكة مجال مفرد جسم 4XT1 منضمة إلى CX3CL1 (PDB 4XT1)، وإذ تشدد على الدور الحاسم لمجلس الإنماء والإعمار المتغير الحلقات في مستضد محدد ملزم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تنقية والتحقق من صحة مجال مفرد الأجسام المضادة. (أ) الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ايماك تنقية مجال مفرد الأجسام المضادة، مقارنة أجسام متنوعة في مجال واحد. أوزان مختلفة أساسا بسبب طول متفاوتة من حلقة CDR3. أيضا مراعاة المستويات المختلفة للتعبير، مع أقلية من الأجسام المضادة مجال مفرد يظهر ضعف غلة من البروتين المنقي. (ب) التحقق من الربط المباشر باستخدام تقارب مستضد المنسدلة. ويلاحظ ربط جسم قوية تعتمد على جرعة واحدة المجال مع الراتنج إلى جانب مستضد ولكن ليس مع الراتنج التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

كما لوحظ، تقارب عالية وخصوصية من الأجسام المضادة في مجال واحد، جنبا إلى جنب مع التعبير السطحية والاستقرار، الكواشف مثالية للتطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية، ما يجعلها الكواشف الكيميائية الحيوية الحرجة، أدوات التشخيص، أو 18من العوامل العلاجية. للتطبيقات التجارية، وهناك بعض القضايا ذات الصلة بالفكرية الملكية التي يجب النظر فيها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء هندسة عكسية الأجسام المضادة لمجال واحد تحتوي على علامات محددة أو العلامات التي يمكن استخدامها كالصحفيين في فحوصات الخلوية أو في التشخيص. المفتاح لهذه الاستخدامات هو القدرة على إنتاج أجسام مضادة في مجال واحد محدد ضد المستضدات للفائدة. أسلوب يتم وصف هنا إنتاج أجسام مضادة مجال مفرد باستخدام الألبكة، التي تنتج من استجابة مناعية قوية ضد طائفة واسعة من المستضدات البروتين. ويرد وصف الاعتبارات المتعلقة بالتعامل مع الحيوان، والامتثال للوائح التنظيمية. هذه هي المفتاح للنجاح في هذا الجزء من العملية.

وهناك استراتيجيات أخرى لإنتاج أجسام مضادة مجال واحد التي لا تتطلب خدمات التطعيم، ولكن بدلاً من ذلك استخدام مكتبات سيميسينثيتيك مع أنظمة مختلفة لاختيار والتحسين متكررة من الانتماءات19،20 . ومع ذلك، ميزة استخدام مكتبات المستمدة من الحيوانات المحصنين هو القدرة على موثوق عزل الأجسام المضادة عالية التخصيب المتنوعة والنسب العالية من مجال واحد. بالإضافة إلى ذلك، ليس فقط مراعاة الاختلافات تسلسل كبيرة، ولكن أغلبية كبيرة من الأجسام المضادة المجال واحدة محددة معزولة كان فريد عمليات الإدراج وعمليات الحذف، لا سيما في CDR3.

المجال علاوة على ذلك، واحد يمكن أن تنتج الأجسام المضادة عن طريق عملية مباشرة فقط ويتطلب الحقن الصغيرة للمستضد، وبعد هذه العملية، يمكن إرجاع الحيوانات إلى القطيع. ملاحظة، الحيوان يمكن استخدامها بحرية لإنتاج الألياف، ولكن يجب أن تستبعد من الاستخدام كاللحوم (السلسلة الغذائية البشرية) نظراً لاستخدام اختبار مولدات المضادات و adjuvant غير إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة لإنتاج الأجسام المضادة في مجال واحد. عند الانتهاء من الإجراء، الحيوانات ينبغي أن يرصد لمدة أسبوع واحد، نظراً لامتحان نهائي بيطرية، وثم يمكن أما عادوا إلى مزارعهم الرئيسية أو على راحة لمدة ستة أشهر قبل إجراء جولة أخرى من مجال واحد جسم إنتاج.

Disclosures

Whiteheart الدكتور هيرش في جامعة كنتاكي وتعمل مجموعة أساسية في المركز "الطب الجزيئي" التي تنتج الأجسام المضادة مجال مفرد في الألبكة كرسوم لخدمة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (P30GM103486).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GERBU FAMA adjuvant Biotechnik, Heidelberg, Germany  3003,6001
Serum collection tube Becton Dickinson 367983
Blood collection tube Becton Dickinson 366643
Vacutainer blood collection set Becton Dickinson 368652
Maxisorp Immuno plates Nunc 439454
BSA Sigma-Aldrich A7906
HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody  Bethyl Labs A160-100P
TMB reagent chromogenic peroxidase substrate  KPL 50-76-03
Plate Reader Spectramax M5 Any UV/VIS capable reader is acceptable
Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube Novamed U-17
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
QIAshredder column Qiagen 79654
Superscript IV reverse transcriptase   Invitrogen 18064014
AEBSF solution Biosynth A-5440
TG1 phage display competent cells Lucigen 60502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krah, S., et al. Single-domain antibodies for biomedical applications. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).
  2. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  3. Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).
  4. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  5. Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).
  6. Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits. Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).
  7. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  8. Muyldermans, S., et al. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).
  9. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).
  10. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
  11. Wang, Y., et al. Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications. International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).
  12. Van Saun, R. J. Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).
  13. Jones, M., Boileau, M. Camelid herd health. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).
  14. Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).
  15. Romao, E., et al. Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies. Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).
  16. Henry, K. A., et al. Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing. Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).
  17. Burg, J. S., et al. Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor. Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).
  18. Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).
  19. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).
  20. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، 143 قضية، الكامليد، مستضد، والتحصين، وجمع الدم، عرض بالعاثية، الفرز، التعبير المؤتلف، تنقية
تحصين الألبكة (<em>باكوس لاما</em>) مع المستضدات البروتين وإنتاج محددة مستضد "واحد المجال الأجسام المضادة"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chow, K. M., Whiteheart, S. W.,… More

Chow, K. M., Whiteheart, S. W., Smiley, J. R., Sharma, S., Boaz, K., Coleman, M. J., Maynard, A., Hersh, L. B., Vander Kooi, C. W. Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies. J. Vis. Exp. (143), e58471, doi:10.3791/58471 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter