Summary
Здесь мы представляем протокол к внутричерепной фармакологические эксперименты, следуют боль поведение анализов в грызунов. Этот протокол позволяет исследователям доставить молекулярных и клеточных целей в головном мозге, для фармакологических агентов в лечении боли.
Abstract
Боль является характерной чувственный опыт с эмоциональные и когнитивные аспекты. Однако Центральный механизмы боли остаются плохо понимали, что препятствует развитию эффективной терапии. Внутричерепных фармакологии представляет важным инструментом для понимания молекулярных и клеточных механизмов, боли в мозг, а также Роман лечения. Здесь мы представляем протокол, который интегрирует внутричерепных фармакологии боли поведение тестирования. В частности мы покажем, как на настаиваться болеутоляющие препараты в регион выберите мозга, которые могут быть ответственны за боль модуляции. Кроме того чтобы определить эффект препарата кандидат в центральной нервной системе, боль анализы выполняются после внутричерепного лечения. Наши результаты показывают, что внутричерепных отправления болеутоляющие препараты в целевом регионе могут обеспечить облегчение боли в грызунов. Таким образом наш протокол успешно демонстрирует, что внутричерепных фармакологии, в сочетании с болью поведение тестирования, может быть мощным инструментом для изучения механизмов боли в мозг.
Introduction
Известно, что центральной нервной системы играют ключевую роль в регуляции боли. Например глютамат сигналов в мозг имеет регулирующей роли в контексте боли1,2. Следовательно существует необходимость изучения клеточном и молекулярном сигнальных путей в головном мозге в отношении боли. Кроме того необходимо понять, если молекулярных целей в конкретных мозга могут быть изменены для лечения боли. Текущие исследования боли в мозг положиться в vitro исследования электрофизиологии в сочетании с системными (внутрибрюшной) доставки фармакологических агентов. В vitro исследования имеют очевидный дефицит в раскрытии в естественных условиях механизмы боли. Тем временем системных лекарств не разграничить точные клеточных мишеней. В естественных условиях внутричерепных инъекции химических и биологических агентов стали мощным инструментом для изучения неврологические и молекулярные пути в головном мозге. В последние годы другие поля использовали в vivo внутричерепных инъекции успешно изучать поведение наркомании и вознаграждение и замыкания путей в грызунов3,4. Однако в контексте боли, использование в vivo внутричерепных фармакологии отсутствует.
Внутричерепных инъекции позволяют точно инъекций препарата в конкретной области мозга. Кроме того конкретные пути и рецепторы могут быть направлены с использованием высокоселективных наркотиков. Сочетание внутричерепных системы доставки с точностью препаратами позволяет нам ориентироваться на молекулярном и клеточном цели для боли. После внутричерепных доставки этих лекарств исследователи могут наблюдать непосредственных последствий в поведении грызунов. От хорошо проведенных экспериментов грызунов поведения могут быть связаны с фармакологии.
В этом протоколе мы использовали пример ампакины вливания в префронтальной коре (PFC) продемонстрировать механизм корковых глутамата сигнализации в регуляции боли. AMPAkines являются синтетическими соединениями, которые известны аллостерический модуляторы. Они показали способность облегчить острые и хронические боли в животных моделей5,6. Предыдущие исследования показывают, что вероятность сайты действий AMPAkines в мозг5,6. PFC — это область в мозге, что экспонаты сверху вниз управления подкорковых областей регулировать настроение и поведение. Некоторые из этих прогнозов вывода было показано, чтобы быть ключом в боль правилам1,2,7. Говоря более конкретно глютамат сигнализации в ПФУ было показано регулируют боли. Таким образом ПФК был выбран как мозг целевой области для изучения AMPAkines в государствах боль.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры в этом исследовании были утверждены Нью-Йорка университета Школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) в соответствии с руководством Национального института здравоохранения (НИЗ) для ухода и использования лабораторных животных.
1. Стереотаксическая канюля имплантации
- Используйте 10-12 неделя старый крысах Sprague-Dawley.
- Как описывалось ранее анестезировать животных с 1,5-2% изофлюрановая1,3,5. Как только животное становится не реагирует на щепотку сильным с острыми щипцами, выполните операцию. Быть уверены в автоклаве всех инструментов, используйте стерильные хирургические перчатки и добавить глазной мази в глаза животного для предотвращения повреждения.
- Stereotaxically имплантата двусторонних 26-калибруйте руководство канюли в ПФУ на 12,5 градусов с координатами AP: +2.9 мм; МЛ: +/ −1.6 мм; DV: −2.1 мм. Чтобы вставить канюли, сверлить отверстия в черепе координатами желаемого, с диаметром отверстия в зависимости от размера используемых канюли.
Примечание: Здесь, ПФК был изучен как потенциальной мишенью для внутричерепных имплантатов из-за его важную роль в обработке боль, которая была продемонстрирована в ряде предыдущих исследований1,2,7. Для изучения функции других областях конкретных мозга, исследователи могут использовать различные координаты согласно Атлас мозга. Для более подробной информации о выполнении внутричерепных хирургии смотрите Гоффер et al (2013)3, Lee et al (2015)1и Sun et al (2017)10. - Разрешить крысы, чтобы оправиться от операции по крайней мере за 1 неделю. После операции придать подкожной жидкости до восстановления, чтобы помочь поддержать метаболические требования и применять актуальные бупивакаин в свеже закрытой разрез. Поместите животное на площадку теплой до тех пор, пока они просыпаются и контролировать операции животных post для 3 дней, чтобы обеспечить хорошее здоровье и правильное восстановление.
- Когда животные полностью оправиться от операции, начать инъекции (следующий шаг).
2. внутричерепное и внутрибрюшной инъекции
- Для внутричерепных инъекции, использование труб PE-50 придает на одном конце для 10-мкл Гамильтон шприцы с 33-го калибра инжектор канюля, которые расширяют 1,0 мм за пределы имплантированных гидов.
- Придать 0.5 мкл (или меньше при желании) исследования наркотиков или физиологического раствора в ПФК этих крыс. Потому что ПФУ большого региона в крыс, эта сумма не будет распространяться на другие регионы. Однако для небольших регионов мозга или для мышей, используйте меньший объем. Вводится сумма будет зависеть от региона мозга и видов животных.
Примечание: Обратите внимание, что солевой раствор следует использовать в качестве элемента управления вместо ДМСО потому что ДМСО нейротоксическое. Однако очень небольшое количество ДМСО может быть безопасным для инфузии, поскольку исследования показали, что меньше чем на 50% ДМСО (то есть, меньше, чем общий объем 0,3 мкл, как в данном случае) не могут вмешиваться с поведением исследования8,9. - Придать объем на двусторонней основе в течение 100 s и держать инжектор канюли в место для дополнительных 60 s перед удаления разрешить медленного распространения этого решения.
- Для исследования синергетических фармакологических эффектов, совместно управлять другой препарат через системные методы. В этом случае придать желаемый наркотиков или управления интракраниально и администрировать дополнительные наркотиков внутрибрюшинно сразу же после этого. Например в этом исследовании мы изучали синергических обезболивающий эффекты морфина и Ampakines для проверки аддитивный эффект. Мы проникнуты ампакины интракраниально, в сочетании с внутрибрюшинного доставки 1 мг/кг морфина (безопасного системного доза)10.
Примечание: Рекомендуется, что внутричерепных инъекции делаются во-первых, как они более сложны, чем внутрибрюшинной инъекции.
3. Обезболивание анализы и оценки
- Для изучения влияния внутричерепных инъекции на острой боли поведение крыс, используйте подошвенной теста (Hargreaves тесты) вычислить задержку вывода в ответ на тепловых раздражителей. Харгривз аппарат фокусируется инфракрасный луч через плоскость стекла на ноги крыса; Крыса стоит и свободно движущихся выше плоскости стекла. При выполнении теста Харгривз, фокус инфракрасный луч в подошвенной области стопы крыса.
- Начните с выполнения тестов базовой Харгривз до инъекции, чтобы создать базовое значение для сравнения.
- Не вводить каких-либо наркотиков любого рода до создания базового значения. Проведение 5 хороших испытаний, 5 минут друг от друга. Пробу хороший обозначается четкий вывод, т.е., когда крысы изгибов ее колена и поднимает его ноги вверх и в тело.
Примечание: Убедитесь, что судебные процессы являются 5 минут друг от друга для предотвращения сенсибилизации крысы. Харгривз аппарат автоматически записывает время вывода, когда нарушается инфракрасный луч. В результате не забудьте скидка испытания от локомоции, смещение веса и т.д. , если пробу со скидкой происходит, подождать 5 минут и повторить процесс. - Вычислить вывода порогов, принимая в среднем 5 испытаний.
- После получения базового среднего, начните эксперимент, чтобы получить вывод раз после вливания лекарственных препаратов. Харгривз тесты могут быть осуществляется 20-30 мин после инъекции внутричерепной, хотя точные сроки могут быть зависимыми от фармакокинетики конкретных агентов. Это необходимо для того, что крысы впитала препарата и переживает его последствия. Провести этот эксперимент в так же, как шаг 3.1.
- Вычислить вывода пороговые значения, как указано в шаге 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве примера мы проникнуты ампакины в ПФК через канюли (рис. 1). Мы также проникнуты морфина системно оценить синергических обезболивающий эффекты между AMPAkines и морфин. Эти результаты показывают, что AMPAkines и морфина имеют добавки обезболивающий эффект. Он также показывает, что внутричерепных инъекции имеют право открыть, по крайней мере в части, механизм для активации наркотиков в контексте боли.
Рисунок 1. Внутричерепных инъекции AMPAkines и системных инъекции морфина предоставляют дополнительные анальгезии. Граф, сравнение задержки вывода из Харгривз тест после внутричерепных инъекции либо физиологического раствора, AMPAkines, или AMPAkines с системными инъекции морфина. Планки погрешностей представляют собой среднее с SEM. n = 8; p < 0,0001, **p = 0.0099, *p = 0.0124, непарные студента t-теста. Этот показатель был адаптирован от солнца и др. (2017) 10, с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали, что внутричерепных фармакологии является мощным инструментом для изучения боли механизмов и имеет потенциал как терапевтические системы доставки. В нашем протокол Мы доставлено AMPAkines непосредственно в ПФУ и обнаружили, что путем повышения глутамата сигнализации в ПФУ, AMPAkines условии боли. Мы смогли доказать это с помощью внутричерепных инъекции, в сочетании с внутрибрюшинной инъекции, с последующей боли анализов. Основываясь на доказательствах обезболивающее воздействие, когда AMPAkines доставляются в ПФУ, настоящее исследование свидетельствует о том, что ПФУ может привлекаться в качестве целевого AMPAkines. Это является важным преимуществом внутричерепных фармакологического подхода, когда в сочетании с поведением тестирования. Кроме того возможность комбинировать внутричерепных поставки системных препаратов позволяет понять терапевтические отношения между двух различных наркотиков и потенциального фармакологических взаимодействий. В примере, показанном в этом исследовании управляющей ампакины в ПФУ в сочетании с морфином показывает ожидаемое аддитивный эффект, который указывает, что AMPAkines и морфина работают через различных молекулярных механизмов.
Хотя в vivo фармакологии является мощным инструментом для изучения боли, он имеет ограничения. Во-первых вполне возможно, что в неопытных руках, проникнуты наркотиков можно диффузного в соседних регионах мозга. Это особая проблема с мышами. Это могут быть преодолены с помощью активированных светом наркотиков и имплантации оптических волокон, измерение уровней наркотиков на различных расстояниях от укола, или потребителей инъекционных наркотиков в тесном анатомические сайтов. Во-вторых, внутричерепной инъекции могут быть короткие прочного, но периода времени эффекта не полностью известны благодаря фармакокинетики препарата. Другие методы, например Оптогенетика, позволяют для мгновенной активации или инактивации желаемый регион головного мозга; Этот метод является более прямой и имеет известный период эффекта. С другой стороны в естественных условиях фармакологии можно специфические рецепторы или сигнальных путей и таким образом обеспечивают дополнительный уровень молекулярной специфичности. Таким образом, в будущем, это будет необходимо изучить сочетания в vivo фармакологии с дополнительных методов, таких как в естественных условиях физиологии и Оптогенетика. С сочетанием этих средств новые пути и конкретные пути рецептор может обнаружил и используется для лечения боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национального института Генеральной медицинских наук (GM102691, GM115384), Национальный институт неврологических нарушений и инсульта (NS100065), (Бетесда, MD, США) и анестезии исследований фонда из Нью-Йорка факультет университета Анестезиологии (Нью-Йорк, Нью -Йорк, США).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
