Summary
Qui presentiamo un protocollo per eseguire esperimenti farmacologici intracranici seguiti da analisi del comportamento di dolore nei roditori. Questo protocollo permette ai ricercatori di fornire bersagli molecolari e cellulari del cervello, per gli agenti farmacologici nel trattamento del dolore.
Abstract
Il dolore è un'esperienza sensoriale saliente con dimensione affettiva e cognitive. Restano tuttavia capite male, ostacolando lo sviluppo di terapie efficaci meccanismi centrali per il dolore. Intracranica farmacologia presenta uno strumento importante per la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari del dolore nel cervello, così come per nuovi trattamenti. Qui presentiamo un protocollo che integra intracranica farmacologia con analisi del comportamento di dolore. In particolare, mostreremo come infondere farmaci analgesici in una regione del cervello select, che può essere responsabile di modulazione del dolore. Inoltre, per determinare l'effetto del farmaco candidato nel sistema nervoso centrale, saggi di dolore vengono eseguite dopo il trattamento intracranico. I nostri risultati dimostrano che la somministrazione intracranica di farmaci analgesici in una regione di destinazione può fornire sollievo del dolore nei roditori. Quindi, il nostro protocollo con successo dimostra che la farmacologia intracranica, combinato con analisi del comportamento di dolore, può essere un potente strumento per lo studio dei meccanismi del dolore nel cervello.
Introduction
Il sistema nervoso centrale è conosciuto per svolgere un ruolo chiave nella regolazione del dolore. Ad esempio, glutammato segnalazione nel cervello ha un ruolo regolatore nel contesto di dolore1,2. Quindi, c'è la necessità di studiare le vie di segnalazione cellulare e molecolare nel cervello rispetto al dolore. Inoltre, c'è una necessità di capire se i bersagli molecolari nelle regioni specifiche del cervello possono essere modificati per trattare il dolore. Gli studi correnti del dolore nel cervello si basano su studi in vitro di elettrofisiologia in combinazione con consegna sistemica (intraperitoneale) di agenti farmacologici. Studi in vitro hanno evidente deficit nel rivelare i meccanismi del dolore in vivo . Nel frattempo, somministrazione di farmaci sistemici non delineare i precisi obiettivi cellulari. In vivo le iniezioni intracraniche di agenti chimici e biologici sono diventati un potente strumento per studiare le vie neurologiche e molecolari nel cervello. Negli ultimi anni, altri campi sono usati in vivo intracraniche iniezioni per studiare con successo i comportamenti di dipendenza e ricompensa e vie di circuito in roditori3,4. Tuttavia, nel contesto del dolore, l'uso di in vivo intracranica farmacologia è carente.
Le iniezioni intracraniche consentono precisione del dosaggio di un farmaco in un'area specifica del cervello. Inoltre, i recettori e vie specifiche possono essere mirati utilizzando farmaci altamente selettivi. La combinazione di un sistema di consegna intracranico con le droghe di precisione permette di mirare a bersagli molecolari e cellulari per il dolore. Dopo la consegna intracranica di questi farmaci, i ricercatori possono osservare gli effetti immediati nel comportamento dei roditori. Da esperimenti ben condotti, i comportamenti dei roditori possono essere collegati con la farmacologia.
In questo protocollo, abbiamo utilizzato l'esempio di AMPAkine infusione nella corteccia prefrontale (PFC) per dimostrare il meccanismo di glutammato corticale segnalazione nel regolamento di dolore. AMPAkines sono composti sintetici che sono noti modulatori allosterici. Essi hanno dimostrato la capacità di alleviare acuto e dolore cronico in animale modelli5,6. Gli studi precedenti suggeriscono che i probabili siti di azione di AMPAkines sono in cervello5,6. Il PFC è una regione del cervello che presenta top-down controllo per aree subcorticali per regolare l'umore e il comportamento. Alcune di queste proiezioni di uscita sono stati indicati per essere chiave nel dolore regolamento1,2,7. Più specificamente, glutammato di segnalazione nel PFC è stato indicato per regolare il dolore. Così, il PFC è stato scelto come un'area del cervello mirati per lo studio di AMPAkines negli Stati di dolore.
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Protocol
Tutte le procedure in questo studio sono state approvate dalla New York University School di medicina istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) come coerente con la guida del National Institute of Health (NIH) per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. l'impianto di Cannula stereotassica
- Utilizzare ratti Sprague-Dawley maschi 10-12 settimana di vita.
- Come descritto in precedenza, anestetizzare gli animali con 1,5-2% isoflurane1,3,5. Una volta che l'animale non risponde a un forte pizzico con pinze taglienti, eseguire l'intervento. Assicuratevi di autoclave tutti gli strumenti, utilizzare guanti chirurgici sterili e aggiungere unguento oftalmico agli occhi dell'animale per evitare danni.
- Stereotassicamente impiantare cannule bilaterale 26-gauge guida nel PFC a 12,5 gradi con coordinate AP: +2,9 mm; ML: + −1.6 mm; DV: −2.1 mm. Al fine di inserire le cannule, forare il cranio in corrispondenza delle coordinate desiderato, con diametro del foro in base alle dimensioni delle cannule utilizzate.
Nota: Qui, il PFC è stato studiato come potenziale bersaglio per gli impianti intracranici a causa del relativo ruolo importante nell'elaborazione del dolore, che è stata dimostrata in un numero di precedenti studi1,2,7. Per studiare la funzione di altre aree specifiche del cervello, i ricercatori possono utilizzare coordinate diverse secondo l'Atlante del cervello. Per maggiori dettagli su come eseguire chirurgia intracranica vedere Goffer et al (2013)3, Lee et al (2015)1e Sun et al (2017)10. - Consentire ratti recuperare da un intervento chirurgico per almeno 1 settimana. A seguito della chirurgia, iniettare fluidi per via sottocutanea prima del recupero per contribuire a sostenere le richieste metaboliche e applicare topica bupivacaine nell'incisione appena chiuso. Metti l'animale su un pad caldo fino a quando si svegliano e monitorarne l'operazione post animale per 3 giorni per assicurare la buona salute e un corretto recupero.
- Una volta che gli animali hanno pienamente recuperato da un intervento chirurgico, iniziare le iniezioni (passo successivo).
2. intracraniche iniezioni intraperitoneali
- Per iniezioni intracraniche, utilizzare PE-50 tubo collegato ad una estremità a 10 μL Hamilton siringhe con cannula di calibro 33 iniettore che estendono 1,0 mm oltre le guide impiantate.
- Iniettare 0,5 μL (o meno se lo si desidera) del farmaco in studio o soluzione salina in PFC di questi ratti. Poiché il PFC è una grande regione in ratti, tale importo non sarà diffuso ad altre regioni. Tuttavia, per le più piccole regioni del cervello o per topi, utilizzare un volume più piccolo. La quantità iniettata dipenderà la regione del cervello e specie dell'animale.
: Nota che tale soluzione salina deve essere utilizzato come un controllo invece di DMSO perché DMSO è neurotossico. Tuttavia, una piccola quantità di DMSO può essere sicura per infusione, come gli studi hanno dimostrato che meno del 50% DMSO (cioè, meno di un volume totale di 0,3 µ l, come in questo caso) non deve interferire con il comportamento studi8,9. - Iniettare il volume bilateralmente in un periodo di 100 cannule di iniettore di s e tenere in luogo per un ulteriore 60 s prima rimozione permettere la lenta diffusione di questa soluzione.
- Per gli studi di effetti farmacologici sinergici, co-somministrare un'altra droga attraverso metodi sistematici. In questo caso, iniettare il farmaco desiderato o il controllo intracranially e amministrare un farmaco aggiuntivo intraperitonealmente subito dopo. Ad esempio, in questo studio abbiamo studiato gli effetti sinergici di analgesici di morfina e Ampakines alla prova per un effetto additivo. Abbiamo infuso un AMPAkine intracranially, in combinazione con consegna intraperitoneale di 1 mg/kg di morfina (una dose sicura sistemica)10.
Nota: È consigliabile che iniezioni intracraniche sono fatte in primo luogo, in quanto sono più difficili da eseguire rispetto le iniezioni intraperitoneali.
3. valutazione e analisi di analgesia
- Per studiare l'effetto delle iniezioni intracraniche su comportamento di dolore acuto in ratti, è possibile utilizzare il plantare test (test di Hargreaves) per calcolare la latenza di ritiro in risposta a stimoli termici. Apparecchio la Hargreaves si concentra un raggio infrarosso attraverso un piano di vetro sul piede del ratto; il topo è in piedi e muoversi liberamente sopra il piano di vetro. Quando si esegue il test di Hargreaves, concentrare il raggio a infrarossi sotto la zona plantare del piede del ratto.
- Iniziare eseguendo il test di Hargreaves basale prima di iniezioni, di stabilire un valore di base per il confronto.
- Non iniettare qualsiasi farmaco di qualsiasi tipo prima di stabilire un valore basale. Svolgimento di 5 studi buone, 5 min apart. Una buona prova è indicata da un ritiro chiaro, vale a dire, quando il ratto si piega al suo ginocchio e solleva il piede verso l'alto e nel corpo.
Nota: Assicurarsi che le prove sono 5 min a parte per evitare la sensibilizzazione del ratto. Apparecchio la Hargreaves registra automaticamente il tempo di recesso, una volta rotto il fascio infrarosso. Di conseguenza, essere sicuri di sconto prove dalla locomozione, spostando il peso, ecc se si verifica un processo scontato, attendere 5 minuti e ripetere la prova. - Calcolare le soglie ritiro considerando la media delle 5 prove.
- Dopo aver ottenuto una media della linea di base, iniziare l'esperimento per ottenere tempi di ritiro dopo l'infusione di farmaci. Test di Hargreaves può essere eseguita 20-30 min dopo iniezioni intracraniche, anche se la tempistica precisa può dipendere la farmacocinetica degli agenti specifici. Questo è per garantire che il ratto ha assorbito la droga e sta vivendo i suoi effetti. Condurre questo esperimento nello stesso modo come passaggio 3.1.
- Calcolare le soglie di ritiro come indicato al punto 3.2.
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Representative Results
Ad esempio, abbiamo infuso un AMPAkine in PFC tramite cannule (Figura 1). Abbiamo anche infuso morfina sistemica per valutare gli effetti analgesici sinergici tra AMPAkines e morfina. Questi risultati indicano che AMPAkines e morfina hanno un effetto analgesico additivo. Viene inoltre illustrato che iniezioni intracraniche hanno il potere di scoprire, almeno in parte, un meccanismo per l'attivazione di droga nell'ambito del dolore.
Figura 1. L'iniezione intracranica di AMPAkines e iniezione sistemica di morfina fornire l'analgesia complementare. Un grafico di confronto delle latenze ritiro dal test di Hargreaves dopo iniezioni intracraniche di entrambi salino, AMPAkines o AMPAkines con iniezione sistemica di morfina. Barre di errore rappresentano la media con SEM. n = 8; p < 0,0001, * *p = 0,0099, *p = 0.0124, spaiati di Student t-test. Questa figura è stata adattata da sole et al. (2017) 10, con il permesso di Elsevier. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato che farmacologia intracranica è un potente strumento per lo studio dei meccanismi di dolore ed ha potenziale come un sistema terapeutico di consegna. Nel nostro protocollo, abbiamo consegnato AMPAkines direttamente nel PFC e trovato che migliorando glutammato segnalazione in PFC, AMPAkines fornito sollievo dal dolore. Siamo stati in grado di dimostrarlo attraverso l'uso di iniezioni intracraniche combinate con le iniezioni intraperitoneali, con conseguente dolore dosaggi. Basato sull'evidenza di effetti antidolorifici, quando AMPAkines vengono consegnati per il PFC, lo studio attuale suggerisce che il PFC può essere coinvolto come bersaglio di AMPAkines. Questo è un vantaggio importante dell'approccio farmacologico intracranica, quando combinato con test di comportamento. Inoltre, la capacità di combinare intracranica con consegna sistemica di farmaci permette di comprendere la relazione terapeutica tra due diversi farmaci e le potenziali interazioni farmacologiche. Nell'esempio riportato in questo studio, somministrazione un AMPAkine nel PFC in combinazione con morfina Mostra un effetto additivo previsto, che indica che AMPAkines e morfina operano attraverso differenti meccanismi molecolari.
Anche se in vivo farmacologia è un potente strumento per lo studio di dolore, ha i limiti. In primo luogo, è possibile che, in mani inesperte, il farmaco infuso può diffondere alle vicine regioni del cervello. Si tratta di un problema particolare con i topi. Questo potrebbe essere superato con l'uso di droghe-attivati e l'impianto di fibre ottiche, attraverso la misurazione dei livelli della droga a distanze diverse dal sito di iniezione, o mediante iniezione di droga a chiudere sedi anatomiche. In secondo luogo, intracraniche iniezioni possono essere di breve durata, ma il periodo di tempo di effetto non è completamente noto dovuto la farmacocinetica del farmaco. Altre tecniche, come optogenetica, consentono l'attivazione istantanea o inattivazione di una regione desiderata del cervello; Questa tecnica è più diretta e ha un tempo noto effetto. D'altra parte, farmacologia in vivo può target specifici recettori o vie di segnalazione e quindi fornire un ulteriore livello di specificità molecolare. Così, in futuro, sarà necessario esplorare combinando farmacologia in vivo con tecniche aggiuntive, ad esempio in vivo fisiologia e optogenetica. Con la combinazione di questi strumenti, vie nuove e specifiche del ricevitore può essere scoperto e usato per trattare il dolore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences (GM102691, GM115384), Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (NS100065), (Bethesda, MD, USA) e l'anestesia ricerca fondo del New York University Dipartimento di Anestesiologia (New York, NY, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
