Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar experimentos farmacológicos intracranianas, seguidos de ensaios de comportamento de dor em roedores. Este protocolo permite que os pesquisadores entregar alvos moleculares e celulares no cérebro, por agentes farmacológicos no tratamento da dor.
Abstract
A dor é uma experiência sensorial mais saliente com dimensões afetivas e cognitivas. No entanto, mecanismos centrais para dor permanecem mal compreendidos, dificultando o desenvolvimento da terapêutica eficaz. Farmacologia intracraniana apresenta uma ferramenta importante para compreender os mecanismos moleculares e celulares da dor no cérebro, bem como para novos tratamentos. Aqui nós apresentamos um protocolo que integra o intracraniana farmacologia com teste de comportamento de dor. Especificamente, mostramos como infundir drogas analgésicas em uma região do cérebro selecionar, que pode ser responsável pela modulação da dor. Além disso, para determinar o efeito da droga candidato no sistema nervoso central, dor ensaios são realizados após o tratamento intracraniano. Nossos resultados demonstram que o intracraniana administração de drogas analgésicas em uma região de destino pode proporcionar alívio da dor em roedores. Assim, nosso protocolo com sucesso demonstra que a farmacologia intracraniana, combinada com o teste do comportamento de dor, pode ser uma poderosa ferramenta para o estudo dos mecanismos de dor no cérebro.
Introduction
O sistema nervoso central é conhecido por desempenhar um papel fundamental no Regulamento de dor. Por exemplo, o glutamato de sinalização no cérebro tem um papel regulador no contexto da dor1,2. Portanto, há uma necessidade de estudar as vias de sinalização celulares e moleculares no cérebro em relação a dor. Além disso, há uma necessidade de compreender se os alvos moleculares em regiões específicas do cérebro podem ser modificados para tratar a dor. Estudos atuais da dor no cérebro confiam em estudos em vitro de eletrofisiologia em combinação com a entrega (intraperitoneal) sistêmica de agentes farmacológicos. Estudos in vitro têm déficits óbvios em revelar os mecanismos de dor na vivo . Enquanto isso, entrega da droga sistêmica não delinear os objectivos precisos e celulares. Na vivo intracranianas injeções de agentes químicos e biológicos tornaram-se uma poderosa ferramenta para estudar caminhos neurológicos e moleculares no cérebro. Nos últimos anos, outros campos têm usado na vivo intracraniana injeções para estudar com sucesso a comportamentos de dependência e recompensa e vias de circuito em roedores3,4. No entanto, no contexto da dor, o uso de na vivo intracraniana farmacologia está faltando.
Intracranianas injeções permitem injeção precisa de uma droga em uma área específica do cérebro. Além disso, receptores e percursos específicos podem ser direcionados usando drogas altamente seletivas. A combinação de um sistema de entrega intracraniana com drogas de precisão nos permite atingir alvos moleculares e celulares para a dor. Após a entrega intracraniana destas drogas, pesquisadores observam-se os efeitos imediatos no comportamento dos roedores. De experiências bem conduzidas, comportamentos dos roedores podem ser vinculados com a farmacologia.
Neste protocolo, usamos o exemplo da infusão de AMPAkine no córtex pré-frontal (PFC) para demonstrar o mecanismo de glutamato cortical sinalização no Regulamento de dor. AMPAkines são compostos sintéticos que são conhecidos moduladores alostéricos. Eles têm demonstrado a capacidade de aliviar aguda e dor crônica no animal modelos5,6. Estudos anteriores sugerem que os locais prováveis de ação de AMPAkines são no cérebro5,6. O PFC é uma região no cérebro que exibe de cima para baixo de controle para áreas subcorticais para regular o humor e comportamento. Algumas dessas projeções de saída foram mostradas para ser chave na dor Regulamento1,2,7. Mais especificamente, glutamato sinalização no PFC foi mostrado para regular a dor. Assim, o PFC foi escolhido como uma área específica do cérebro para o estudo de AMPAkines nos Estados de dor.
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Protocol
Todos os procedimentos neste estudo foram aprovados pela New York University School de medicina institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) como consistente com o National Institute of Health (NIH) guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. estereotáxica cânula implantação
- Use ratos Sprague-Dawley machos de 10-12 semanas.
- Como descrito anteriormente, anestesia animais com53,1,do isoflurano 1,5 a 2%. Uma vez que o animal se torna não respondem a uma picada forte com Pinças afiadas, realizar a cirurgia. Seja certo autoclave todos os instrumentos, use luvas cirúrgicas estéreis e adicionar pomada oftálmica aos olhos do animal, para evitar danos.
- Stereotaxically implante cânulas bilateral calibre 26 guia no PFC em um ângulo de 12,5 graus com coordenadas AP: +2,9 mm; ML: + / −1.6 mm; DV: −2.1 mm. Para inserir as cânulas, furos no crânio nas coordenadas desejadas, com diâmetro de furo de acordo com o tamanho das cânulas utilizadas.
Nota: Aqui, o PFC foi estudada como destino potencial para implantes intracranianas devido ao seu importante papel no processamento da dor, que tem sido demonstrado em vários estudos anteriores1,2,7. Para estudar a função de outras áreas específicas do cérebro, os pesquisadores podem usar diferentes coordenadas de acordo com o atlas do cérebro. Para obter mais detalhes sobre como realizar a cirurgia intracraniana, consulte gofrada et al (2013)3, Lee et al (2015)1e Sun et al (2017)10. - Permitem que ratos para se recuperar de uma cirurgia pelo menos 1 semana. Após a cirurgia, injetar fluidos subcutâneos antes da recuperação para ajudar a suportar as exigências metabólicas e aplicar tópica bupivacaína na incisão recém fechada. Coloque o animal em uma almofada quente até que acordem e monitorar a operação post animal por 3 dias para garantir a boa saúde e uma recuperação adequada.
- Uma vez que os animais se recuperaram totalmente da cirurgia, começar as injeções (próximo passo).
2. intracranianas e Intraperitoneal injeções
- Para injecções intracranianas, usar tubos de PE-50 ligados em uma extremidade para 10 μL Hamilton seringas com cânula de calibre 33 injector que estendem 1,0 mm além os guias implantados.
- Injetar 0,5 μL (ou menos se desejado) da droga do estudo ou solução salina no PFC desses ratos. Porque o PFC é uma região maior de ratos, este montante não será espalhado para outras regiões. No entanto, para pequenas regiões do cérebro ou ratos, use um volume menor. A quantidade injetada dependerá da região do cérebro e espécies animais.
Nota: Por favor, note que o soro deve ser usado como um controle em vez de DMSO porque DMSO é neurotóxico. No entanto, uma quantidade muito pequena de DMSO pode ser segura para a infusão, como os estudos mostraram que menos de 50% DMSO (ou seja, menos do que um volume total de 0.3 μL, como neste caso) não pode interferir com o comportamento estuda8,9. - Injete o volume bilateralmente durante um período de 100 s e mantenha cânulas injector no lugar para um adicional 60 s antes da remoção permitir a difusão lenta desta solução.
- Para estudos de efeitos farmacológicos sinérgicos, co administre outra droga através de métodos sistêmicos. Neste caso, injetar o medicamento desejado ou controle intracraniano e administrar um medicamento adicional intraperitonealmente imediatamente a seguir. Como exemplo, neste estudo, estudamos os efeitos sinérgicos analgésicos da morfina e Ampakines para testar um efeito aditivo. Infundirmos um AMPAkine intracraniano, em combinação com entrega intraperitoneal de 1 mg/kg de morfina (uma dose segura sistêmica)10.
Nota: É recomendável que injeções intracranianas são feitas em primeiro lugar, como eles são mais difíceis de realizar do que injeções intraperitoneal.
3. avaliação e ensaios de analgesia
- Para estudar o efeito de injeções intracranianas sobre o comportamento de dor aguda em ratos, use o teste plantar (de Hargreaves testes) para calcular a latência de retirada em resposta a um estímulo térmico. Aparelhos do Hargreaves concentra-se um feixe de infravermelho através de um plano de vidro no pé do rato; o rato é permanente e movimentando-se livremente acima do vidro plano. Ao executar o teste de Hargreaves, focar o feixe infravermelho na área plantar do pé do rato.
- Comece realizando testes de linha de base Hargreaves antes de injeções, para estabelecer um valor de base para comparação.
- Não Injecte qualquer droga de qualquer espécie, antes de estabelecer um valor de linha de base. Realizar 5 ensaios boas, separados de 5 min. Um bom julgamento é indicado por uma retirada clara, ou seja, quando o rato se dobra seu joelho e levanta seu pé para cima e para o corpo.
Nota: Certifique-se de que os julgamentos são separados para evitar a sensibilização do rato 5 min. Aparelhos de o Hargreaves automaticamente registra o tempo de retirada, uma vez que o feixe infravermelho está quebrado. Como resultado, certifique-se de desconto ensaios de locomoção, deslocamento de peso, etc. se ocorrer um julgamento com desconto, espere 5 min e repita o julgamento. - Cálculo dos limiares de retirada, tomando a média dos 5 ensaios.
- Depois de obter uma média de linha de base, começa o experimento para obter tempos de retirada após a infusão de drogas. Testes de Hargreaves podem ser realizada 20-30 min após injeções intracranianas, embora o momento exato pode ser dependente da farmacocinética dos agentes específicos. Isso é para garantir que o rato tem absorvido a droga e está experimentando seus efeitos. Fazer esta experiência da mesma maneira como passo 3.1.
- Cálculo dos limiares de retirada como mencionado na etapa 3.2.
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Representative Results
Por exemplo, infundirmos um AMPAkine no PFC através de cânulas (Figura 1). Nós também infundido morfina sistemicamente para avaliar o efeito analgésico sinérgico entre AMPAkines e morfina. Estes resultados mostram que AMPAkines e morfina têm um efeito analgésico aditivo. Ele também mostra que as injeções intracranianas têm o poder de descobrir, pelo menos em parte, um mecanismo para a ativação de drogas no contexto da dor.
Figura 1. Intracraniana injeção de AMPAkines e injeção sistêmica de morfina fornecer analgesia complementar. Um gráfico comparando as latências de retirada de teste de Hargreaves após injeções intracranianas de qualquer solução salina, AMPAkines, ou AMPAkines com injeção sistêmica de morfina. Barras de erro representam média com SEM. n = 8; p < 0,0001, * *p = 0.0099, *p = 0.0124, pareado de Student t-teste. Esta figura foi adaptada da Sun et al . (2017) 10, com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, Nós demonstramos que farmacologia intracraniana é uma poderosa ferramenta para estudar os mecanismos de dor e tem potencial como um sistema de entrega a terapêutico. Em nosso protocolo, nós entregue AMPAkines diretamente no PFC e constatou que, aumentando o glutamato sinalização no PFC, AMPAkines fornecido alívio da dor. Fomos capazes de demonstrar isto através do uso de injeções intracranianas combinadas com injeções intraperitoneal, com ensaios de dor subsequente. Baseado na evidência dos efeitos de alívio da dor, quando AMPAkines são entregues para o PFC, o estudo atual sugere que o PFC pode estar envolvido como um destino de AMPAkines. Esta é uma vantagem importante da abordagem farmacológica intracraniana, quando combinado com o teste de comportamento. Além disso, a capacidade de combinar intracraniana com entrega sistêmica de drogas nos permite entender a relação terapêutica entre duas drogas diferentes e as potenciais interações farmacológicas. No exemplo mostrado neste estudo, administrar um AMPAkine no PFC em combinação com morfina mostra um efeito aditivo esperado, o que indica que AMPAkines e morfina operam através de diferentes mecanismos moleculares.
Embora na vivo farmacologia é uma poderosa ferramenta para estudar a dor, ele tem limitações. Em primeiro lugar, é possível que, em mãos inexperientes, a droga infundida pode difundir para vizinhas regiões do cérebro. Este é um problema particular com ratos. Isto poderia ser superado com o uso de drogas de luz ativado e implantação de fibras ópticas, pela medição dos níveis de droga a diferentes distâncias do local da injeção, ou por injetar a droga em fechar sítios anatômicos. Segunda, intracranianas injeções podem ser de curta duração, mas o período de tempo do efeito não é totalmente conhecido devido a farmacocinética da droga. Outras técnicas, tais como optogenetics, permitam a ativação instantânea ou inativação de uma região desejada do cérebro; Esta técnica é mais direta e tem um período conhecido de efeito. Por outro lado, na vivo farmacologia pode alvo receptores específicos ou vias de sinalização e assim, fornecer um nível adicional de especificidade molecular. Assim, no futuro, será necessário explorar combinando farmacologia na vivo com técnicas adicionais, tais como a fisiologia na vivo e optogenetics. Com a combinação dessas ferramentas, novos caminhos e percursos específicos do receptor podem ser descobertos e usados para tratar a dor.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências (GM102691, GM115384), Instituto Nacional de Disorders Neurological e Stroke (NS100065), (Bethesda, MD, EUA) e o anestesia fundo de Nova York University departamento de pesquisa de Anestesiologia (Nova York, NY, EUA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
