Summary
여기 선물이 통증 행동 분석 실험 설치류에 다음 intracranial 약리 실험을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜 pharmacologic 에이전트 통증의 치료에는 두뇌에 있는 분자와 세포질 목표를 제공 하는 연구를 수 있습니다.
Abstract
통증은 정서 및 인지 치수와 현저한 감각 경험. 그러나, 고통에 대 한 중앙 메커니즘 남아 불완전 하 게 이해 하 고, 효과적인 치료제의 개발을 방해. Intracranial 약리학 소설 치료 뿐만 아니라 뇌에는 통증의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하기 위한 중요 한 도구를 제공 합니다. 여기 선물이 통증 동작 테스트 intracranial 약리학을 통합 하는 프로토콜. 특히, 우리 통증 변조에 대 한 책임 수 있습니다 선택 뇌 영역으로 진통 약물 주입 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 중앙 신경 시스템에 후보 약물의 효과 확인 하려면 고통 분석 intracranial 처리 후 수행 됩니다. 우리의 결과 intracranial 관리 대상된 지역에서 진통 약물의 설치류에 통증의 완화를 제공할 수 있습니다 보여 줍니다. 따라서, 우리의 프로토콜 성공적으로 intracranial 약리학, 통증 동작 테스트와 함께 뇌에서 통증 메커니즘의 연구에 대 한 강력한 도구가 될 수 있습니다 보여 줍니다.
Introduction
중앙 신 경계 통증 조절에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 예를 들어 두뇌에 신호 하는 조미료 통1,2의 맥락에서 규제 역할을 하고있다. 따라서, 통증에 관하여 두뇌에 세포질이 고 분자 신호 경로 연구에 필요가 하다. 또한, 경우 특정 뇌 영역에 분자 대상을 수정할 수 있습니다 통증 치료를 이해할 필요가 있다. 뇌에는 통증의 현재 연구는 생체 외에서 연구 조합 전기 생리학 약리학 대리인의 조직 (복) 납품에 의존합니다. 생체 외에서 학문 vivo에서 통증 메커니즘 공개에 명백한 적자를 가진다. 한편, 조직 약물 전달 정확한 세포 목표를 나타냅니다 하지 않습니다. 화학 및 생물 학적 에이전트의 비보에 intracranial 주사는 두뇌에 있는 신경 및 분자 경로 연구 하는 강력한 도구 되고있다. 최근 몇 년 동안, 다른 분야 intracranial 주사 vivo에서 성공적으로 공부 중독 및 보상 동작 및 설치류3,4회로 경로를 이용 했다. 그러나, 통증의 맥락에서 vivo에서 intracranial 약리학의 사용은 부족 하 고.
Intracranial 주사는 뇌의 특정 영역에 약물의 정확한 주입 하실 수 있습니다. 또한, 특정 경로 수용 체 대상 수 있습니다 될 매우 선택적인 약물을 사용 하 여. 정밀 마약 intracranial 전달 시스템의 조합을 대상으로 통증에 대 한 분자 및 세포 목표 수 있습니다. 이러한 약물의 intracranial 배달 후 연구원 설치류의 행동에 즉각적인 효과 볼 수 있습니다. 잘 실시 실험에서 쥐의 행동 약리학과 연결할 수 있습니다.
이 프로토콜에 우리 고통 규제에서 신호는 대뇌 피 질의 조미료의 메커니즘을 설명 하는 전 두 엽 피 질 (PFC)에서 AMPAkine 주입의 예 사용. AMPAkines는 합성 화합물 allosteric 변조기를 알려져 있습니다. 그들은 해소 하는 능력을 급성 나타났습니다 그리고 동물에 만성 통증 모델5,6. 이전 연구 뇌5,6AMPAkines의 행동의 가능성이 사이트는 것이 좋습니다. PFC는 전시 하는 하향식 바꾸어 지역 분위기 및 동작을 제어 하는 뇌의 영역입니다. 이러한 출력 계획의 일부 고통 규정1,,27키로 표시 되었습니다. 좀 더 구체적으로, 조미료는 PFC에 신호 통증을 조절 하기 위해 표시 되었습니다. 따라서, PFC 고통 상태에 AMPAkines의 연구에 대 한 타겟된 두뇌 지역으로 선정 되었다.
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Protocol
이 연구에서 모든 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 건강의 국가 학회 (NIH) 가이드와 일치로 뉴욕 대학 대학원의 의학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었다.
1. stereotaxic 정 맥 주입
- 10-12 주 오래 된 남성 Sprague-Dawley 쥐를 사용 합니다.
- 앞에서 설명한 대로 1.5-2% isoflurane1,,35동물을 anesthetize. 동물 날카로운 집게와 강한 핀치에 반응이 일단 수술을 수행 합니다. 반드시 압력솥에 모든 악기, 무 균 수술 장갑을 사용 하 고 손상을 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 추가 합니다.
- Stereotaxically 양자 26 게이지 가이드 뉼 좌표 AP 12.5도 각도로 PFC에 이식: +2.9 mm; ML: + −1.6 밀리미터; DV: −2.1 m m입니다. 뉼을 삽입 하려면 원하는 좌표 사용 뉼의 크기에 따라 구멍 직경에서 두개골에 구멍을 드릴.
참고: 여기, PFC 연구 했다 intracranial 임 플 란 트에 대 한 잠재적인 대상으로 고통 처리, 이전 연구1,,27의 숫자에서 설명 되는 그것의 중요 한 역할 때문에. 공부 하 고 다른 특정 뇌 영역의 기능, 연구자는 뇌 아틀라스에 따르면 다른 좌표를 사용할 수 있습니다. 에 대 한 자세한 내용은 수행 Intracranial 수술 주름 외 (2013)3, 리 외 (2015)1및 태양 외 (2017)10을 참조 하십시오. - 적어도 1 주 동안 수술에서 회복 하기 위해 쥐를 수 있습니다. 수술에 따라 신진 대사 요구 사항을 지원할 수 있도록 복구 전에 피하 체액 주사 하 고 갓 닫힌된 절 개에 국 소 bupivacaine를 적용 합니다. 그들은, 그리고 건강 하 고 적절 한 복구를 보장 하기 위해 3 일 동안 동물 post 작업을 모니터링할 때까지 따뜻한 패드에 동물을 놓습니다.
- 일단 동물 수술에서 완전히 회복, 주사를 시작 (다음 단계).
2. intracranial 복 주사
- Intracranial 주사에 대 한 연결 된 PE-50 튜브를 사용 하 여 10 μ에 한쪽 끝에 33-게이지 인젝터 정 이식된 가이드 넘어 1.0 m m를 확장 하는와 해밀턴 주사기.
- 0.5 μ 주사 (또는 원하는 경우이 하) 연구 약물 또는 이러한 쥐의 PFC에 염 분의. PFC 쥐에서 큰 지역 이므로이 다른 지역에 확산 되지 않을 것입니다. 그러나, 작은 뇌 영역 또는 마우스를 사용 하 여 작은 볼륨. 주입 양은 동물의 종과 두뇌의 지역에 따라 달라 집니다.
참고: 제발 참고 그 염 분 한다 사용 DMSO 대신 컨트롤로 DMSO는 신경 때문에. 그러나, 아주 소량 DMSO 연구 50 %DMSO (즉, 보다 작음이 경우 0.3 μ의 총 볼륨) 동작을 방해 하지 않을 수 있습니다8,9연구로 주입, 대 한 안전 있을 수 있습니다. - 양자는 추가 60 s 제거 하기 전에이 솔루션의 느린 유포를 허용에 대 한 장소에서 100 s와 계속 인젝터 뉼의 기간 동안 볼륨을 주입.
- 시너지 약리 효과의 연구에 대 한 체계적 방법을 통해 다른 마약 관리 공동. 이 경우에, intracranially 원하는 약물 또는 컨트롤을 삽입 하 고 intraperitoneally 즉시 이후에 추가 마약을 관리. 예를 들어,이 연구에서 우리가 공부 모 르 핀과 첨가제 효과 대 한 테스트를 Ampakines의 시너지 진통 효과. 우리 intracranially, 1 mg/kg 모 르 핀 (안전 조직의 복용량)10의 복 납품과 함께 한 AMPAkine 주입.
참고: 그들은 더 복 주사 보다 수행 하기 어려운 intracranial 주사 먼저 수행 하는 것이 좋습니다.
3. 진통 분석 및 평가
- 쥐의 급성 통증 행동에 intracranial 주사의 효과 연구, 열 자극에 대 한 응답에서 철수 대기 시간을 계산 하 발바닥 테스트 (하 그 리브스 테스트)을 사용 합니다. 하 그 리브스 기구 쥐의 발;에 유리 면을 통해 서 적외선 광선을 초점을 맞추고합니다 쥐 서 이며 유리 평면 위에 자유롭게 이동 합니다. 하 그 리브스의 테스트를 수행할 때 쥐의 발을 발바닥의 영역에서 적외선 빔 초점.
- 주사, 비교에 대 한 초기 값을 설정 하기 전에 기준선 하 그 리브스 테스트를 수행 하 여 시작 합니다.
- 초기 값을 설정 하기 전에 어떤 종류의 어떤 약물을 주사 하지 마십시오. 5 좋은 시험, 5 분 간격을 수행 합니다. 좋은 시도 분명 철수, 즉, 쥐의 무릎을 굴곡 하 고 위쪽으로 그리고 몸으로 그것의 발을 리프트로 표시 됩니다.
참고: 재판은 5 분 쥐의 민감 화를 방지 하기 위해 떨어져 다는 것을 확인 하십시오. 하 그 리브스 장치는 자동으로 적외선 빔 깨졌습니다 일단 철수의 시간을 기록 합니다. 그 결과, 운동에서 재판 할인, 무게, 등 을 이동 하는 경우 할인 된 재판 발생, 5 분 대기 하 고 재판을 반복 해야 합니다. - 5 재판의 평균을 취하여 철수 임계값을 계산 합니다.
- 기준 평균 후, 실험 약물의 주입 후 철수 시간을 시작 합니다. 정확한 타이밍 특정 에이전트의 약 동학에 종속 될 수 있지만 하 그 리브스 테스트 intracranial 주사 후 수행된 20-30 분을 될 수 있습니다. 이것은 쥐 약물 흡수 하 고 그것의 효과 발생 하는 것입니다. 이 실험 단계 3.1과 같은 방식으로 수행 합니다.
- 3.2 단계에서 언급 한 대로 철수 임계값을 계산 합니다.
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Representative Results
예를 들어, 우리는 (그림 1) 뉼 통해 PFC로는 AMPAkine 생긴. 우리는 또한 AMPAkines와 핀 사이의 시너지 진통 효과 평가 하기 위해 체계적으로 모 르 핀 주입. 이러한 결과 AMPAkines과 모 르 핀 첨가제 진통 효과 보여 줍니다. 그것은 또한 intracranial 주사 힘 발견, 적어도 부분에서 통증의 맥락에서 마약 활성화에 대 한 메커니즘을 보여줍니다.
그림 1입니다. AMPAkines의 intracranial 주입 및 모 르 핀의 조직의 주입 제공 보완 진통. 모 르 핀의 조직의 주입 중 염 분, AMPAkines, 또는 AMPAkines의 intracranial 주사 후 철수 하 그 리브스 테스트에서 대기 시간을 비교 하는 그래프입니다. 오차 막대를 나타내는 평균 SEM. n = 8; p < 0.0001, * *p 0.0099, = *p = 0.0124, 홀 학생의 t-테스트. 이 그림은 태양 외. 에서 적응 되었습니다. (2017) 10, Elsevier에서 허가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리가 intracranial 약리학 통증 메커니즘을 연구 하는 강력한 도구 이며, 치료 전달 시스템으로 서 잠재력을가지고 증명 하고있다. 우리의 프로토콜에서 우리 PFC에 직접 AMPAkines를 전달 하 고 조미료는 PFC에 통증 완화를 제공 하는 AMPAkines 신호를 강화 하 여 발견. 우리 복 주사, 이후의 통증 분석 실험 결합 intracranial 주사를 사용 하 여이 보여줄 수 있었다. AMPAkines는 PFC로 배달 통증 완화 효과의 증거에 따라, 현재 연구는 PFC AMPAkines의 대상으로 포함 될 수 있습니다 제안 합니다. 이 때 intracranial 약리학 접근의 중요 한 장점은 동작 테스트와 함께. 또한, 약물의 조직 배달 intracranial 결합 수 두 다른 약물과 잠재적인 약리학 적인 상호 작용 사이의 치료 적 관계를 이해 하도록 해줍니다. 이 연구의 예에서는 모 르 핀과 함께에서 PFC에 있는 AMPAkine 관리 예상된 첨가제 효과, AMPAkines과 모 르 핀 분자 다른 메커니즘을 통해 작동 하는 것을 나타내는 표시 됩니다.
Vivo에서 약리학 통증을 공부 하는 강력한 도구 이지만, 그것은 한계는. 먼저, 경험이 손에 생긴된 약물 인접 한 뇌 영역을 확산 수 가능 하다. 이것은 마우스와 함께 특정 문제입니다. 와이 빛 약물의 사용으로 극복할 수 수의 광학 섬유, 사출 사이트에서 다른 거리에서 마약 레벨의 측정에 의해 또는에 약물을 주입 하 여 주입 해 부 사이트를 닫습니다. 두 번째, intracranial 주사 짧은 지속, 수 있지만 효과의 기간 때문에 약물의 약 동학 전적으로 알려져 되지 않습니다. 다른 기술, optogenetics, 등 즉각적인 활성화 또는 비활성화; 뇌의 원하는 영역에 대 한 허용 이 기술은 더 직접적이 고 효과의 알려진된 기간 있다. 다른 한편으로, vivo에서 약리학 특정 수용 체 또는 신호 경로 대상 하 고 따라서 분자 특이성의 추가 수준을 제공할 수 있습니다. 따라서, 미래에, 그것은 필요가 있을 것입니다 탐험 vivo에서 생리학 및 optogenetics 같은 추가 기술을 vivo에서 약리학을 결합. 이러한 도구의 조합으로 새로운 경로 수용 체 특정 경로 수 있습니다 수 발견 하 고 통증을 치료 하는 데 사용.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 연구소의 종합 의료 과학 (GM102691, GM115384), 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 (NS100065), (베 데스 다, 메릴랜드, 미국)에 의해 지원 되었다와 마 취 연구 기금의 뉴욕 대학 학과 마 취학 (뉴욕, 뉴욕, 미국).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
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