Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utføre intrakranielt farmakologiske eksperimenter etterfulgt av smerte atferd analyser i gnagere. Denne protokollen tillater forskere å levere molekylære og mobilnettet mål i hjernen, for farmakologisk agenter i behandling av smerte.
Abstract
Smerte er en fremtredende sanseopplevelse med affektive og kognitive. Sentrale mekanismer for smerte beholdes imidlertid dårlig forstått, hindre utviklingen av effektive therapeutics. Intrakranielt farmakologi presenterer et viktig verktøy for å forstå de molekylære og cellulære mekanismene av smerte i hjernen og romanen behandlinger. Her presenterer vi en protokoll som integrerer intrakranielt farmakologi med smerte atferd testing. Spesielt vise vi hvordan du sette mot smertestillende midler i en velger hjernen regionen, som kan være ansvarlig for smerte modulering. Videre, for å fastslå effekten av stoffet kandidat i det sentrale nerve systemet, smerte analyser utføres etter intrakranielt behandling. Våre resultater viser at intrakranielt administrasjon av smertestillende medikamenter i en målrettingsområde kan gi lindring av smerter i gnagere. Dermed viser våre protokollen vellykket at intrakranielt farmakologi, kombinert med smerte atferd testing, kan være et kraftig verktøy for studier av smerte mekanismer i hjernen.
Introduction
Sentralnervesystemet er kjent for å spille en nøkkelrolle i smerte regulering. For eksempel har glutamat signalering i hjernen en regulerende rolle i forbindelse med smerte1,2. Derfor er det behov for å studere cellulære og molekylære signalveier i hjernen forhold til smerte. I tillegg er det behov for å forstå hvis molekylære mål i bestemte hjernen regioner kan endres til å behandle smerter. Aktuelle studier av smerte i hjernen er avhengige av i vitro studier av elektrofysiologi i kombinasjon med systemisk (intraperitoneal) levering av farmakologiske agenter. In vitro studier har tydelig underskudd i avslørende i vivo smerte mekanismer. I mellomtiden avgrense systemisk narkotika-leveranser ikke presis mobilnettet målene. I vivo intrakranielt injeksjoner av kjemiske og biologiske agenter har blitt et kraftig verktøy for å studere nevrologiske og molekylære stier i hjernen. De siste årene, har andre felt brukt i vivo intrakranielt injeksjoner kunne studere avhengighet og belønne atferd og krets trasé i gnagere3,4. Men i forbindelse med smerte mangler bruk av i vivo intrakranielt farmakologi.
Intrakranielt injeksjoner tillater presis injeksjon av et stoff i et bestemt område av hjernen. Videre kan bestemte stier og reseptorer være målrettet bruker svært selektive narkotika. Kombinasjonen av en intrakranielt leveringssystem med presisjon narkotika tillater oss å målrette molekylære og mobilnettet mål for smerte. Etter intrakranielt levering av disse stoffene, kan forskerne observere den umiddelbare effekten i atferden til gnagere. Fra godt utført eksperimenter, kan gnagere atferd kobles med farmakologi.
I denne protokollen brukte vi eksempel AMPAkine infusjon i prefrontal cortex (PFK) for å demonstrere mekanisme kortikale glutamat signalering i smerte regulering. AMPAkines er syntetiske stoffer som kalles allosteric modulatorer. De har vist evne til å avlaste akutte og kroniske smerter i dyr modeller5,6. Tidligere studier tyder på at sannsynlig områdene av AMPAkines er i hjernen5,6. PFC er en region i hjernen som viser toppen ned å subkortikal områder å regulere humøret og atferd. Noen av disse utgang anslagene har vist seg å være nøkkel i smerte regulering1,2,7. Mer spesifikt, har glutamat signalering i PFC vist å regulere smerte. Dermed ble PFC valgt som en målrettet brain området for å studere AMPAkines i smerte stater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer i denne studien ble godkjent av New York universitet skolen av medisin institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) som konsekvent med National Institute of Health (NIH) Guide og bruk av forsøksdyr.
1. stereotaxic kanyle implantasjon
- Bruke 10-12 uke gamle hannrotter Sprague-Dawley.
- Som beskrevet tidligere, bedøve dyr med 1,5-2% isoflurane1,3,5. Når Dyret svarer til en sterk klemme med skarpe tang, utføre kirurgi. Husk å autoklav alle instrumenter, bruke sterilt kirurgiske hansker og legge ophthalmica salve dyrets øynene å hindre skade.
- Stereotaxically implantatet bilaterale 26-gauge guide cannulas i PFC i 12.5 graders vinkel med koordinater AP: +2.9 mm; ML: / −1.6 mm; DV: −2.1 mm. For å sette inn i cannulas, kan du bore hull i skallen på ønsket koordinatene, med hull diameter avhengig av cannulas brukes.
Merk: Her PFC ble studert som potensielle mål for intrakranielt implantater på grunn av sin viktige rolle i smerte behandling, som har vært vist i en rekke tidligere studier1,2,7. For å studere funksjonen til andre bestemte hjernen områder, kan forskere bruke forskjellige koordinater ifølge hjernen atlas. Mer om utføre intrakranielt kirurgi se Goffer et al (2013)3, Lee et al (2015)1og Sun et al (2017)10. - Tillat rotter å gjenopprette fra kirurgi i minst 1 uke. Etter operasjonen, injisere subkutan væsker før gjenoppretting til å støtte kravene metabolske, og bruk aktuelle bupivacaine i den nylig lukkede snittet. Plasser dyrene på en varm pute til de våkner opp og overvåke dyr post-operasjonen for 3 dager for å sikre god helse og en riktig.
- Når dyrene har helt frisk fra kirurgi, begynne injeksjoner (neste trinn).
2. intrakranielt og Intraperitoneal injeksjoner
- Bruk PE-50 slangen festet for intrakranielt injeksjoner, i den ene enden til 10-μL Hamilton sprøyter med 33-gauge injektor kanyle som utvider 1.0 mm utover implantert guider.
- Injisere 0,5 μL (eller mindre hvis ønskelig) enten studie stoffet eller saltvann i PFC disse rotter. PFC er en større region i rotter, vil beløpet ikke spres til andre regioner. Men for mindre områder av hjernen eller mus, bruk et mindre volum. Hvor injisert avhengig av regionen av hjernen og dyrearter.
Merk: Vær oppmerksom på at saltvann skal brukes som en kontroll i stedet for DMSO fordi DMSO nevrotoksiske. En svært liten mengde DMSO kan imidlertid være trygt for infusjon, som studier har vist at mindre enn 50% DMSO (dvs . mindre enn et totalt volum på 0,3 μL, som i dette tilfellet) ikke kan påvirke atferden studier8,9. - Injisere volum bilateralt over en periode på 100 s og holde injektor cannulas i stedet for en ekstra 60 s før fjerning tillate langsom spredningen av denne løsningen.
- For studier av farmakologiske synergieffekter, co administrere et medikament gjennom systemisk metoder. I dette tilfellet injisere den ønskede narkotika eller kontrollen intracranially og administrere en ekstra stoff intraperitoneally umiddelbart etterpå. Som et eksempel i denne studien studerte vi synergistisk smertestillende effekter av morfin og Ampakines å teste for en additiv effekt. Vi tilført en AMPAkine intracranially, i kombinasjon med intraperitoneal levering av 1 mg/kg morfin (en sikker systemisk dose)10.
Merk: Det anbefales at intrakranielt injeksjoner er gjort først som de er vanskeligere å utføre enn intraperitoneal injeksjoner.
3. analgesi analyser og vurdering
- For å studere effekten av intrakranielt injeksjoner på akutte smerter atferd i rotter, bruk plantar testen (Hargreaves' tester) til å beregne uttak ventetid svar på termisk stimuli. Hargreaves' apparat fokuserer en infrarøde strålen gjennom et glass fly på rat's fot; rotta er stående og fritt flytte over glass flyet. Når du utfører Hargreaves' test, Fokuser den infrarøde strålen under plantar område av rottes foten.
- Begynn med å utføre planlagt Hargreaves' tester før injeksjoner, å etablere en grunnverdi for sammenligning.
- Injisere ikke noen narkotika av noe slag før etablering en grunnverdi. Gjennomføre 5 gode forsøk, 5 minutter fra hverandre. En god prøve angis med et klart uttak, dvs. når rotta bøyer sine kne og løfter foten oppover og inn i kroppen.
Merk: Kontroller at forsøkene er 5 min fra hverandre for å hindre sensibilisering av rotte. Hargreaves' apparat registrerer automatisk tidspunktet for uttak, når den infrarøde strålen er brutt. Derfor må du rabatt forsøk fra bevegelse, skifter vekt, etc. hvis det oppstår en rabattert rettssak, vent 5 min og gjenta rettssaken. - Beregne uttak terskler ved å ta gjennomsnittet av 5.
- Etter få en baseline gjennomsnitt, starte eksperimentet å få uttak ganger etter infusjon av narkotika. Hargreaves' tester kan utføres 20-30 minutter etter intrakranielt injeksjoner, selv om nøyaktige tidspunktet kan være avhengig av farmakokinetikken av bestemte agenter. Dette er å sikre at rottene har absorbert stoffet og opplever sine effekter. Gjennomføre dette eksperimentet på samme måte som skritt 3.1.
- Beregne uttak terskler som nevnt i trinn 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel infundert vi en AMPAkine i PFC via cannulas (figur 1). Vi har også fylt morfin systematisk for å vurdere de smertestillende synergieffekter mellom AMPAkines og morfin. Disse resultatene viser at AMPAkines og morfin har en additiv analgetisk effekt. Det viser også at intrakranielt injeksjoner har makt til å oppdage, minst delvis en mekanisme for narkotika aktivisering i konteksten av smerte.
Figur 1. Intrakranielt injeksjon av AMPAkines og systemisk injeksjon av morfin gir utfyllende analgesi. Et diagram sammenligne uttak latencies fra Hargreaves' test etter intrakranielt injeksjoner enten saltoppløsning, AMPAkines eller AMPAkines med systemisk injeksjon av morfin. Feilfelt representerer gjennomsnittet med SEM. n = 8; p < 0,0001, **p = 0.0099, *p = 0.0124, unpaired Student t-test. Dette tallet er tilpasset fra Sun et al. (2017) 10, med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi vist at intrakranielt farmakologi er et kraftig verktøy for å studere mekanismer for smerte og har potensial som et terapeutisk leveringssystem. I vår protokollen, vi leverte AMPAkines direkte inn i PFK og funnet ut at ved å styrke glutamat signalering i PFC, AMPAkines gitt smertelindring. Vi klarte å demonstrere dette ved hjelp av intrakranielt injeksjoner kombinert med intraperitoneal injeksjoner, med påfølgende smerte analyser. Basert på bevis på smertestillende effekter, når AMPAkines leveres til PFC, tyder denne studien på at PFC kan være involvert som et mål for AMPAkines. Dette er en viktig fordel med intrakranielt farmakologiske tilnærming, kombinert med atferd testing. I tillegg tillater muligheten til å kombinere intrakranielt med systemisk levering av narkotika oss å forstå terapeutiske relasjonen mellom to ulike legemidler og potensielle pharmacologic interaksjoner. I eksemplet som vises i denne studien, viser administrere en AMPAkine i PFC i kombinasjon med morfin en forventet additiv effekt, som indikerer at AMPAkines og morfin opererer gjennom ulike molekylære mekanismer.
Selv om i vivo farmakologi er et kraftig verktøy for å studere smerte, har begrensninger. Først er det mulig at i uerfarne hender, infundert stoffet kan spre til nærliggende områder av hjernen. Dette er et problem med mus. Dette kan overvinnes med bruk av lys-aktivert narkotika og implantering av optisk fiber, ved måling av narkotika nivåer på ulike avstander fra injeksjonsstedet eller sprøytebrukere på Lukk anatomiske nettsteder. Andre, intrakranielt injeksjoner kan være kort levetid, men for effekt er ikke helt kjent på grunn av farmakokinetikken av stoffet. Andre teknikker, for eksempel optogenetics, tillater for umiddelbar aktivisering eller inaktivering av et ønsket område av hjernen; Denne teknikken er mer direkte og har en kjent periode effekt. På den annen side, kan i vivo farmakologi målrette bestemte reseptorer eller signalveier, og dermed gir et ekstra nivå av molekylære spesifisitet. Således, i fremtiden, må utforske kombinere i vivo farmakologi med flere teknikker, som i vivo fysiologi og optogenetics. Med en kombinasjon av disse verktøyene, kan nye veier og reseptor bestemte stier oppdaget og brukes til å behandle smerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences (GM102691, GM115384), National Institute av nevrologiske lidelser og strek (NS100065), (Bethesda, MD, USA) og anestesi fondet til New York University Forskningsavdelingen til Anesthesiology (New York, NY, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
