Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול ביצוע ניסויים תרופתי תוך-גולגולתי ואחריו כאב מבחני התנהגות בחולדות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לספק מטרות מולקולרית, תאית במוח, עבור סוכנים תרופתי לטיפול בכאב.
Abstract
הכאב הוא חוויה חושית הבולטות עם ממדים רגשית, קוגניטיבית. עם זאת, מרכזי מנגנוני הכאב נשארים ממעטים להבין, הפרעה להתפתחות הרפוי יעיל. פרמקולוגיה תוך-גולגולתי מציג כלי חשוב להבנת המנגנונים המולקולריים הסלולר של כאב במוח, כמו גם עבור טיפולים חדשניים. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלבת פרמקולוגיה תוך-גולגולתי עם בדיקת התנהגות הכאב. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד להחדיר ובתרופה לתוך אזור בחירה במוח, אשר עשוי להיות אחראי על כאב אפנון. יתר על כן, כדי לקבוע את ההשפעה של הסם המועמד במערכת העצבים המרכזית, לכאב מבחני מבוצעות לאחר טיפול תוך גולגולתי. התוצאות שלנו להפגין כי תוך-גולגולתי מינהל ובתרופה באזור ממוקד יכול לספק הקלה של כאב אצל מכרסמים. כך, הפרוטוקול שלנו בהצלחה מדגים כי פרמקולוגיה תוך גולגולתי, בשילוב עם כאב התנהגות בדיקות, יכול להיות כלי רב עוצמה עבור חקר מנגנוני הכאב במוח.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית ידוע לשחק תפקיד מרכזי בוויסות כאב. לדוגמה, גלוטמט איתות במוח יש תפקיד רגולטורי בהקשר של כאב1,2. לפיכך, יש צורך ללמוד תאית ומולקולרית איתות המסלולים במוח בנוגע לכאב. בנוסף, יש צורך להבין אם מטרות מולקולריות באזורים מסוימים במוח יכול להיות שונה לטיפול בכאב. מחקרים נוכחיים של כאב במוח להסתמך על במבחנה מחקרים של אלקטרופיזיולוגיה בשילוב עם מסירת סוכנים תרופתי מערכתית (בקרום הבטן). מחקרים במבחנה שיש חסרונות ברורים חושפים ויוו מנגנוני הכאב. בינתיים, משלוח סמים מערכתית לא ניסחו את מטרות תאיות מדויק. In vivo זריקות תוך-גולגולתי של סוכנים כימי, ביולוגי הפכו להיות כלי רב עוצמה כדי ללמוד מסלולים מולקולרית, נוירולוגי במוח. בשנים האחרונות, שדות אחרים השתמשו ויוו זריקות תוך-גולגולתי ללמוד בהצלחה התמכרות ותגמול התנהגויות מסלולים מעגל מכרסמים3,4. עם זאת, בהקשר של כאב, חסר השימוש ויוו פרמקולוגיה תוך-גולגולתי.
זריקות תוך-גולגולתי מאפשרים הזרקה מדויקת של תרופה לתוך אזור ספציפי במוח. יתר על כן, משעולים ספציפיים, קולטנים ניתן לפלח משתמש בסמים סלקטיבי מאוד. השילוב של מערכת משלוח תוך-גולגולתי עם דיוק סמים מאפשר לנו למקד מטרות מולקולריות וסלולריות לכאב. לאחר הלידה תוך-גולגולתי של תרופות אלו, חוקרים ניתן להבחין ההשפעות בהתנהגות של מכרסמים. מן הניסויים מתנהל טוב, ההתנהגויות של מכרסמים יכולים להיות מקושרים עם פרמקולוגיה.
ב פרוטוקול זה, השתמשנו הדוגמה של AMPAkine אינפוזיה של קליפת המוח הקדם חזיתית (PFC) כדי להדגים את המנגנון של גלוטמט קורטיקלית איתות בתקנה כאב. AMPAkines הם תרכובות סינתטי, הידועות מאפננים allosteric. הם הראו את היכולת להקל אקוטית, כאב כרוני של בעל חיים מודלים5,6. מחקרים קודמים מצביעים כי האתרים סביר הפעולה של AMPAkines הם המוח5,6. טוראי ראשון הוא אזור במוח תערוכות מלמעלה למטה בקרה לאזורים subcortical להסדיר מצב רוח והתנהגות. חלק תחזיות פלט אלה הוכחו להיות מפתח הכאב בתקנה1,2,7. ליתר דיוק, גלוטמט איתות ב PFC הוכח כדי לווסת את הכאב. לפיכך, טוראי ראשון נבחר אזור מוחי ממוקד לחקר AMPAkines במצבי כאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים במחקר זה אושר על ידי ניו יורק אוניברסיטת בית הספר של רפואה מוסדיים חיה טיפול ועל שימוש הוועדה (IACUC) כפי בקנה אחד עם המדריך המכון הלאומי לבריאות (NIH) על טיפול ועל שימוש של חיות מעבדה.
1. בצינורית stereotaxic-השרשה
- השתמש בשבוע 10-12 בן זכר ספראג-Dawley חולדות.
- כפי שתואר קודם לכן, עזים ומתנגד חיות עם3,1,איזופלוריין-1.5-2%5. ברגע שבעל החיים הופך להגיב צביטה חזקה עם מלקחיים חדה, לבצע את הניתוח. להיות בטוח כדי אוטוקלב כל הכלים, להשתמש בכפפות סטריליות כירורגי ולהוסיף המשחה אופטלמולוגיות לעיניים של החיה כדי למנוע נזק.
- Stereotaxically שתל קנולות מדריך 26-מד דו צדדיים לתוך טוראי בזווית של 12.5 מעלות עם קואורדינטות AP: +2.9 מ מ; ML: / −1.6 מ מ; DV: −2.1 מ מ. כדי להוסיף את קנולות, קודחים חורים בגולגולת בקואורדינטות הרצוי, עם קוטר חור בהתאם לגודל קנולות בשימוש.
הערה: כאן, טוראי ראשון היה למד היעד הפוטנציאלי עבור שתלים תוך-גולגולתי עקב תפקידו חשוב בעיבוד כאב, אשר הוכח במספר מחקרים קודמים1,2,7. ללמוד את הפונקציה של אזורים ספציפיים במוח אחרים, חוקרים יכולים להשתמש קואורדינטות שונים על פי האטלס המוח. לפרטים נוספים על ביצוע ניתוח תוך-גולגולתי עיין גופר ואח (2013)3, Lee ואח (2015)1ו שמש ואח (2017)10. - לאפשר חולדות להתאושש מהניתוח במשך לפחות שבוע אחד. בעקבות הניתוח, להזריק נוזלים תת-עורי לפני השחזור כדי לעזור לתמוך בדרישות מטבולי, ויש להחיל נמשך אקטואלי של החתך סגור טרי. מקם את החיה על משטח חם עד שהם מתעוררים, לפקח על פעולת post חיה במשך 3 ימים להבטיח החלמה תקין ובריאות טובה.
- לאחר החיות יש החלימו לחלוטין מהניתוח, להתחיל זריקות (השלב הבא).
2. תוך-גולגולתי, בקרום הבטן זריקות
- לשימוש תוך-גולגולתי זריקות, צינורות PE-50 המחוברים בקצה אחד ל 10-μL המילטון מזרקים עם מזרק 33-מד בצינורית המרחיבים 1.0 מ מ מעבר המדריכים מושתל.
- מזריקים 0.5 μL (או פחות אם תרצה) של מחקר סמים או תמיסת מלח ב PFC העכברים הללו. כי טוראי ראשון הוא אזור גדול יותר אצל חולדות, סכום זה לא יתפרש לאזורים אחרים. עם זאת, עבור אזורים במוח קטן יותר או עבור עכברים, השתמש אמצעי אחסון קטן יותר. הסכום מוזרק תלויות האזור של המוח ושל מינים של בעלי חיים.
הערה: שימו לב שכי תמיסת מלח אמור לשמש כפקד במקום דימתיל סולפוקסיד כי דימתיל סולפוקסיד העצבים. עם זאת, כמות מאוד קטנה של דימתיל סולפוקסיד עשוי להיות בטוח עבור אינפוזיה, כמו מחקרים הראו כי פחות מ 50% דימתיל סולפוקסיד (דהיינו, פחות הנפח הכולל של μL 0.3, כמו במקרה זה) עלולים לא להפריע להתנהגות מחקרים8,9. - להזריק נפח דו צדדיים על פני תקופה של 100 s ולשמור מזרק קנולות במקומם נוספים 60 s לפני הסרת כדי לאפשר דיפוזיה איטית של פתרון זה.
- ללימודים של תופעות תרופתי סינרגטי, לנהל במשותף תרופה נוספת באמצעות שיטות מערכתית. במקרה זה, להזריק את הסם הרצוי או שליטה intracranially ולפקח תרופה נוספת intraperitoneally מייד לאחריו. לדוגמה, במחקר זה למדנו את ההשפעות כאבים סינרגטי של מורפיום Ampakines כדי לבדוק את אפקט תוסף. אנחנו חדורים AMPAkine של intracranially, בשילוב עם משלוח בקרום הבטן של 1 מ"ג/ק"ג מורפיום (מנה מערכתית בטוח)10.
הערה: מומלץ כי זריקות תוך-גולגולתי נעשית תחילה, הם קשים יותר לביצוע מאשר זריקות בקרום הבטן.
3. כאבים מבחני והערכה
- ללמוד את השפעת זריקות תוך-גולגולתי על כאב אקוטי התנהגות אצל חולדות, השתמש במבחן plantar (בדיקות הארגריבס) לחישוב ההשהיה נסיגה בתגובה לגירויים תרמי. המנגנון של הרגריבס מתמקדת של קרן אינפרא אדום דרך מטוס זכוכית על הרגל של החולדה; העכברוש הוא עומד, לנוע בחופשיות מעל המטוס זכוכית. בעת ביצוע מבחן הארגריבס, ממקדים את הקרן אינפרא-אדום מתחת לאזור plantar של הרגל של החולדה.
- התחל על-ידי ביצוע הבדיקות של התוכנית הבסיסית הרגריבס לפני זריקות, כדי ליצור ערך בסיס להשוואה.
- לא להזריק כל סם מסוג כלשהו לפני הקמת ערך בסיסית. לערוך ניסויים טוב 5, 5 דקות אחד מהשני. משפטים טובים מזוהה באמצעות נסיגה ברורה, קרי, כאשר העכברוש אזנו את הברך שלו, מרימה את הרגל שלה כלפי מעלה ולתוך הגוף.
הערה: ודא שהניסויים הם בנפרד, כדי למנוע רגישות עולה של העכברוש 5 דקות. המנגנון של הרגריבס מקליט באופן אוטומטי בזמן הנסיגה, פעם קרן אינפרא-אדום הוא שבור. כתוצאה מכך, יש להקפיד הנחה ניסויים של גפיים, העברת משקל, וכו ' אם משפט מוזלים מתרחשת, להמתין 5 דקות, חזור על המשפט. - לחשב את סף נסיגה על ידי לקיחת הממוצע של הניסויים 5.
- לאחר קבלת ממוצע בסיסית, התחילו את הניסיון להביא לנסיגה פעמים לאחר אינפוזיה של סמים. בדיקות הארגריבס ניתן בביצוע 20-30 דקות לאחר זריקות תוך גולגולתי, למרות התזמון מדויק עשוי להיות תלוי פרמקוקינטיקה של הסוכנים ספציפיים. הדבר נועד להבטיח החולדה ספג את התרופה חווה את השפעותיו. לנהל את הניסוי הזה באופן זהה כשלב 3.1.
- לחשב את סף נסיגה כאמור בשלב 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדוגמה, אנחנו שאנרגית של AMPAkine טוראי באמצעות קנולות (איור 1). אנחנו גם חדורים מורפיום מערכתית כדי להעריך את ההשפעות כאבים סינרגטי בין AMPAkines לבין מורפיום. תוצאות אלו מראות כי AMPAkines מורפיום יש אפקט כאבים מוספים. הוא גם מראה כי זריקות תוך-גולגולתי יש את הכוח כדי לגלות, לפחות בחלקו, מנגנון הפעלה סמים בהקשר של כאב.
איור 1. הזרקה תוך-גולגולתי של AMPAkines, הזרקת מערכתית של מורפיום לספק שיכוך כאבים משלימים. גרף השוואת השהיות ארוכות יותר נסיגה הארגריבס במבחן לאחר זריקות תוך-גולגולתי של או תמיסת מלח, AMPAkines, או AMPAkines עם הזרקה מערכתית של מורפיום. קווי שגיאה מייצגים אומר עם n ב- SEM = 8; p < 0.0001, * *p = 0.0099, *p = 0.0124, אינטראקצית הסטודנט t-מבחן. איור זה כבר ממאמרו של השמש. et al. (2017) 10, באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה הראו כי פרמקולוגיה תוך-גולגולתי הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור מנגנוני הכאב ויש פוטנציאל מערכת טיפולית. הפרוטוקול שלנו אנחנו העבירה AMPAkines ישירות טוראי ראשון, מצאתי את זה על ידי שיפור גלוטמט איתות ב PFC, AMPAkines בתנאי הקלה בכאב. היינו יכולים להדגים זאת באמצעות זריקות תוך-גולגולתית בשילוב עם זריקות בקרום הבטן, עם מבחני כאב עוקבות. על סמך העדויות של כאבים אפקטים, כאשר AMPAkines מועברות את טוראי ראשון, המחקר הנוכחי עולה כי טוראי ראשון עשויים להיות מעורבים כמטרה של AMPAkines. זהו יתרון חשוב של הגישה תרופתי תוך גולגולתי, בשילוב עם בדיקת התנהגות. בנוסף, היכולת לשלב תוך-גולגולתי. עם משלוח מערכתית של סמים מאפשרת לנו להבין את הקשר הטיפולי בין שתי תרופות שונות את האינטראקציות פוטנציאל תרופתי. בדוגמה המוצגת במחקר זה, ניהול של AMPAkine לתוך טוראי בשילוב עם מורפיום מראה אפקט תוסף הצפוי, אשר מציין כי AMPAkines, מורפיום פועלים באמצעות מנגנונים מולקולריים שונים.
למרות ויוו פרמקולוגיה היא כלי רב עוצמה כדי ללמוד כאב, זה יש מגבלות. ראשית, זה אפשרי, כי בידיים לא מנוסים, הסם חדורים יכול לפזר השכנות אזורים במוח. זוהי בעיה מסוימת עם עכברים. זה יכול ניתן להתגבר עם השימוש בסמים הופעל-אור וסגור השרשה של סיבים אופטיים, מדידות של רמות התרופה במרחקים שונים של ההזרקה, או על ידי הזרקת הסם-אתרי אנטומיים. שנית, תוך-גולגולתי זריקות ניתן לטווח קצר, אבל תקופת הזמן של אפקט לחלוטין לא ידועה בשל פרמקוקינטיקה של התרופה. טכניקות אחרות, כגון optogenetics, לאפשר הפעלה נקודתית או איון של אזור הרצוי של המוח; טכניקה זו היא ישירה יותר ויש לו תקופה הידועה של השפעה. מצד שני, אין ויוו פרמקולוגיה יכול כוון קולטנים ספציפיים או איתות המסלולים, ובכך לספק רמה נוספת של מולקולרית ירידה לפרטים. לכן, בעתיד, יהיה צורך לחקור את שילוב ויוו פרמקולוגיה עם טכניקות נוספות, כגון ויוו פיזיולוגיה ו- optogenetics. עם השילוב של כלים אלה, משעולים חדשים מסלולים קולטן ספציפי יכול להיות גילה ומשמשת לטיפול בכאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי (GM102691, GM115384), המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות (NS100065), שבץ מוחי (Bethesda, MD, ארצות הברית) ומחלקת הרדמה מחקר קרן של ניו יורק האוניברסיטה של להרדמה (ניו יורק, NY, ארצות הברית).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
