Summary
Nous présentons ici un protocole pour effectuer des expériences pharmacologiques intracrâniennes suivies de tests de comportement de la douleur chez les rongeurs. Ce protocole permet aux chercheurs de livrer des cibles moléculaires et cellulaires du cerveau, des agents pharmacologiques dans le traitement de la douleur.
Abstract
La douleur est une expérience sensorielle saillante avec dimensions cognitives et affectives. Cependant, les mécanismes centraux pour la douleur restent mal compris, qui entravent le développement de thérapeutiques efficaces. Intracrânienne pharmacologie présente un outil important pour la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de la douleur dans le cerveau, ainsi que de nouveaux traitements. Nous présentons ici un protocole qui intègre la pharmacologie intracrânienne avec douleur comportement stable. Plus précisément, nous montrons comment infuser des médicaments analgésiques dans une région du cerveau select, qui peut être responsable de la modulation de la douleur. En outre, afin de déterminer l’effet du médicament candidat dans le système nerveux central, douleur analyses après traitement intracrânien. Nos résultats démontrent que l’administration intracrânienne de médicaments analgésiques dans une région ciblée peut apporter un soulagement de la douleur chez les rongeurs. Ainsi, notre protocole démontre que la pharmacologie intracrânienne, combiné avec douleur comportement stable, peut être un outil puissant pour l’étude des mécanismes de la douleur dans le cerveau.
Introduction
Le système nerveux central est appelé à jouer un rôle clé dans le règlement de la douleur. Par exemple, glutamate de signalisation dans le cerveau a un rôle régulateur dans le contexte de la douleur1,2. Par conséquent, il y a un intérêt pour l’étude des voies de signalisation cellulaires et moléculaires dans le cerveau en ce qui concerne la douleur. En outre, il est nécessaire de comprendre si les cibles moléculaires dans certaines régions du cerveau peuvent être modifiées pour traiter la douleur. Les études actuelles de la douleur dans le cerveau s’appuient sur des études in vitro d’électrophysiologie en combinaison avec délivrance (intrapéritonéale) systémique d’agents pharmacologiques. Des études in vitro ont des déficits évidents en révélant en vivo les mécanismes de la douleur. Pendant ce temps, administration de médicaments systémiques ne pas délimiter les cibles cellulaires précis. In vivo intracrâniennes injections d’agents chimiques et biologiques sont devenues un outil puissant pour étudier les voies moléculaires et neurologiques dans le cerveau. Ces dernières années, autres domaines ont utilisé en vivo intracrânienne injections d’étudier avec succès les addiction et récompenser les comportements et les voies de circuit dans les rongeurs3,4. Toutefois, dans le contexte de la douleur, l’utilisation de la pharmacologie in vivo intracrânienne est absent.
Les injections intracrâniennes permettent une injection précise d’un médicament dans une zone spécifique du cerveau. Par ailleurs, les récepteurs et les voies spécifiques peuvent être ciblés à l’aide de médicaments hautement sélectifs. La combinaison d’un système de prestation intracrânienne avec des médicaments de précision nous permet de viser des cibles moléculaires et cellulaires pour la douleur. Après administration intracrânienne de ces medicaments, chercheurs peuvent observer les effets immédiats dans le comportement des rongeurs. Des expériences menées, les comportements des rongeurs peuvent être reliés à la pharmacologie.
Dans ce protocole, nous avons utilisé l’exemple d’AMPAkine infusion dans le cortex préfrontal (PFC) pour démontrer le mécanisme du glutamate corticale de signalisation dans le règlement de la douleur. AMPAkines sont des composés synthétiques qui sont connus des modulateurs allostériques. Ils ont montré la capacité à soulager aiguë et la douleur chronique chez les animaux modèles5,6. Des études antérieures suggèrent que les sites susceptibles d’action des AMPAkines sont dans le cerveau5,6. Le CFM est une région du cerveau qui expose la descendante de contrôle aux régions sous-corticales pour réguler l’humeur et le comportement. Certains de ces projections sortie ont démontré être clé en douleur règlement1,2,7. Plus précisément, glutamate de signalisation dans le PFC s’est avéré de réglementer la douleur. Ainsi, le PFC a été choisi comme une zone du cerveau ciblés pour l’étude des AMPAkines dans la douleur.
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Protocol
Toutes les procédures dans la présente étude ont été approuvées par la New York University School of médecine institutionnelle Animal Care et le Comité d’utilisation (IACUC) comme conforme au Guide National Institute of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. stéréotaxiques canule Implantation
- Utiliser 10-12 semaines vieux mâles rats Sprague-Dawley.
- Comme décrit précédemment, anesthésier les animaux avec 1,5 à 2 % isoflurane1,3,5. Une fois que l’animal ne répond pas à une forte pincée avec une pince forte, effectuer la chirurgie. Veillez à stériliser tous les instruments, utilisez des gants chirurgicaux stériles et ajouter pommade ophtalmique aux yeux de l’animal pour éviter tout dommage.
- Implant stereotaxically canules bilatéraux calibre 26 guide dans le PFC à 12,5 degrés avec coordonnées AP : +2,9 mm ; ML : + / −1.6 mm ; DV : −2, 1 mm. Afin d’y insérer les canules, percer des trous dans le crâne au point de coordonnées souhaité, avec le diamètre du trou selon la taille des canules utilisées.
NOTE : Ici, le PFC a été étudiée comme la cible potentielle pour les implants intracrâniennes en raison de son rôle important dans le traitement de la douleur, qui a été démontré dans un certain nombre de précédents études1,2,7. Pour étudier la fonction des autres zones spécifiques du cerveau, les chercheurs peuvent utiliser différentes coordonnées selon l’atlas du cerveau. Pour plus de détails sur l’exécution d’une intervention intracrânienne, s’il vous plaît voir Goffer et coll. (2013)3, Lee et coll. (2015)1et soleil et coll. (2017)10. - Permettre à des rats récupérer d’une chirurgie pour au moins 1 semaine. Après une intervention chirurgicale, injecter des fluides sous-cutanés avant la reprise pour aider à soutenir les besoins métaboliques et appliquez la bupivacaïne topique dans l’incision fraîchement fermée. Placer l’animal sur une dalle chaude jusqu'à ce qu’ils réveillent et contrôler le fonctionnement de post animale pendant 3 jours pour assurer la bonne santé et une bonne récupération.
- Une fois que les animaux ont complètement remis de la chirurgie, commencer les injections (étape suivante).
2. intracrâniennes et intrapéritonéales d’Injections
- Pour injections intracrâniennes, utiliser des tubes PE-50 attaché à une extrémité pour 10 μL Hamilton seringues avec canule de calibre 33 injecteur qui s’étendent de 1,0 mm au-delà les guides implantés.
- Injecter 0,5 μL (ou moins si vous le souhaitez) du médicament à l’étude ou du sérum physiologique dans le PFC de ces rats. Parce que le PFC est une région plus étendue chez les rats, ce montant s’étendra pas à d’autres régions. Toutefois, pour les plus petites régions du cerveau ou souris, utiliser un plus petit volume. La quantité injectée dépend de la région du cerveau et des espèces animales.
Remarque : Veuillez noter qu’une solution saline doit être utilisée comme un contrôle au lieu de DMSO DMSO étant neurotoxique. Cependant, une très petite quantité de DMSO peut être sans danger pour l’infusion, car des études ont montré que moins de 50 % de que DMSO (c'est-à-dire inférieure à un volume total de 0,3 μL, comme en l’espèce) ne peut pas interférer avec le comportement études8,9. - Injecter le volume bilatéralement sur une période de 100 canules d’injecteur s et le maintenir en place pendant une supplémentaire 60 s avant l’enlèvement permettre une diffusion lente de cette solution.
- Pour l’étude des effets pharmacologiques synergiques, administrer un autre médicament par le biais de méthodes systémiques. Dans ce cas, injecter la drogue souhaitée ou le contrôle des données et administrer un médicament supplémentaire par voie intrapéritonéale immédiatement après. À titre d’exemple, dans cette étude, nous avons étudié les effets de synergie analgésiques de la morphine et Ampakines à tester pour un effet additif. Nous avons infusé un AMPAkine données, en combinaison avec livraison intrapéritonéale de 1 mg/kg de morphine (une dose sécuritaire de systémique)10.
Remarque : Il est recommandé que les injections intracrâniennes sont font tout d’abord, car ils sont plus difficiles à effectuer que des injections intrapéritonéales.
3. évaluation et essais de l’analgésie
- Pour étudier l’effet des injections intracrâniennes sur le comportement de la douleur aiguë chez le rat, utiliser le test plantaire (essais de Hargreaves) pour calculer le temps de latence de retrait en réponse à des stimuli thermiques. Appareillage de la Hargreaves concentre un faisceau infrarouge à travers un plan de verre sur pied le rat ; le rat est permanent et se déplaçant librement au-dessus du plan de verre. Lorsque vous effectuez le test de Hargreaves, concentrer le faisceau infrarouge sous la zone plantaire du pied du rat.
- Commencez par les tests de base Hargreaves avant les injections, d’établir une valeur de référence pour la comparaison.
- Ne pas injecter une drogue quelconque avant d’établir une valeur de référence. Mener des essais de bonnes 5, 5 min d’intervalle. Un bon procès est indiqué par un retrait clair, c'est-à-dire lorsque le rat plie son genou et soulève son pied vers le haut et dans le corps.
Remarque : Assurez-vous que les épreuves sont à 5 min d’intervalle pour empêcher une sensibilisation du rat. Appareil de la Hargreaves enregistre automatiquement au moment du retrait, une fois que le faisceau infrarouge est cassé. Par conséquent, n’oubliez pas de remise des essais de locomotion, transfert de poids, etc. en cas d’un procès réduit, attendre 5 min et répéter l’essai. - Calculer les seuils de retrait en calculant la moyenne des 5 essais.
- Après avoir obtenu une moyenne de base, commencer l’expérience pour obtenir des délais d’attente après la perfusion de médicaments. Essais de Hargreaves peuvent être effectué 20-30 min après injection intracrânienne, bien que le calendrier précis pourrait dépendre de la pharmacocinétique des agents spécifiques. Il s’agit de veiller à ce que le rat a absorbé le médicament et connaît ses effets. Faire cette expérience de la même manière que l’étape 3.1.
- Calculer les seuils de retrait tel que mentionné à l’étape 3.2.
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Representative Results
À titre d’exemple, nous avons infusé un AMPAkine dans le PFC par l’intermédiaire de canules (Figure 1). Nous avons également infusé morphine systémique afin d’évaluer les effets analgésiques synergiques entre AMPAkines et de la morphine. Ces résultats montrent que les AMPAkines et la morphine ont un effet analgésique additif. Il montre également que les injections intracrâniennes ont le pouvoir de découvrir, au moins en partie, un mécanisme d’activation de la drogue dans le contexte de la douleur.
Figure 1. Injection intracrânienne de AMPAkines et systémique de la morphine fournir une analgésie complémentaire. Graphique comparant les latences de retrait de l’essai de Hargreaves après injection intracrânienne de soit une solution saline, AMPAkines ou AMPAkines avec injection systémique de la morphine. Barres d’erreur représentent la moyenne avec SEM. n = 8 ; p < 0,0001, **p = 0,0099, *p = 0,0124, non appariées de Student t-test. Ce chiffre a été adapté de Sun et al. (2017) 10, avec la permission de Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons démontré que pharmacologie intracrânienne est un outil puissant pour étudier les mécanismes de la douleur et a un potentiel comme un système de diffusion thérapeutique. Dans notre protocole, nous avons livré AMPAkines directement dans le PFC et a constaté que, en améliorant la signalisation dans le PFC, AMPAkines fourni soulagement de la douleur de glutamate. Nous avons pu démontrer cela grâce à l’utilisation des injections intracrâniennes combinées avec des injections intrapéritonéales, avec des analyses ultérieures de la douleur. Selon la preuve des effets analgésiques, lorsque AMPAkines sont livrés à la PFC, la présente étude suggère que le PFC peut être impliqué comme cible de AMPAkines. Il s’agit d’un avantage important de l’approche pharmacologique intracrânienne, lorsqu’il est combiné avec le test de comportement. En outre, la possibilité de combiner intracrânienne avec délivrance systémique des médicaments nous permet de comprendre la relation thérapeutique entre deux médicaments différents et les interactions pharmacologiques potentielles. Dans l’exemple présenté dans cette étude, administrer un AMPAkine dans le PFC en combinaison avec la morphine montre un effet additif prévu, ce qui indique que AMPAkines et morphine agissent par le biais de différents mécanismes moléculaires.
Bien que en vivo pharmacologie est un outil puissant pour étudier la douleur, elle dispose des limites. Tout d’abord, il est possible que, dans des mains inexpérimentées, le médicament infusé peut se diffuser à des voisins des régions du cerveau. Il s’agit d’un problème particulier avec la souris. Cela pourrait être surmonté avec l’utilisation de médicaments activés par la lumière et l’implantation des fibres optiques, par mesure des concentrations du médicament à des distances différentes au site d’injection, ou par l’injection de la drogue à fermer des sites anatomiques. Deuxièmement, intracrâniennes injections peuvent être de courte durée, mais la période de prise d’effet n’est pas entièrement connue en raison de la pharmacocinétique du médicament. Autres techniques, telles qu’optogenetics, permettant une activation instantanée ou l’inactivation d’une région désirée du cerveau ; cette technique est plus directe et dispose d’un délai connu de prise d’effet. En revanche, in vivo pharmacologie peut cibler des récepteurs spécifiques ou des voies de signalisation et fournissent ainsi un niveau supplémentaire de spécificité moléculaire. Ainsi, à l’avenir, il sera nécessaire d’explorer combinant en vivo pharmacologie techniques supplémentaires, telles que in vivo physiologie et optogenetics. Avec la combinaison de ces outils, les nouveaux sentiers et voies spécifiques du récepteur peuvent être découvert et utilisés pour traiter la douleur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences (GM102691, GM115384), la National Institute of Neurological Disorders et l’accident vasculaire cérébral (NS100065), (Bethesda, MD, é.-u.) et l’anesthésie recherche fonds de New York University Department of Anesthésiologie (New York, NY, é.-u.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
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