Summary
نقدم هنا بروتوكولا لإجراء التجارب الدوائية داخل الجمجمة متبوعاً بألم السلوك فحوصات في القوارض. ويسمح هذا البروتوكول الباحثين إنجاز الأهداف الجزيئية والخلوية في الدماغ، لعوامل دوائية في علاج الألم.
Abstract
الألم تجربة حسية بارزة مع الأبعاد العاطفية والمعرفية. ومع ذلك، تظل الآليات المركزية للألم غير مفهومة، التي تعوق تطوير علاجات فعالة. الصيدلة داخل الجمجمة يمثل أداة هامة لفهم الآليات الجزيئية والخلوية من الألم في الدماغ، وكذلك لعلاجات جديدة. نقدم هنا بروتوكول يدمج الصيدلة داخل الجمجمة مع اختبار السلوك الألم. على وجه التحديد، نعرض كيفية ضخ المخدرات مسكن في منطقة الدماغ select، التي قد تكون مسؤولة عن التحوير الألم. وعلاوة على ذلك، لتحديد مدى تأثير المخدرات مرشح في النظام العصبي المركزي، يتم إجراء فحوصات الألم بعد العلاج داخل الجمجمة. وتبين النتائج التي توصلنا إليها أن الإدارة داخل الجمجمة المخدرات مسكن في منطقة مستهدفة يمكن أن توفر إغاثة ألم في القوارض. وهكذا، لدينا بروتوكول يوضح بنجاح أن الصيدلة داخل الجمجمة، جنبا إلى جنب مع الألم اختبار السلوك، يمكن أن تكون أداة قوية لدراسة آليات الألم في الدماغ.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي المعروف بدور رئيسي في تنظيم الألم. على سبيل المثال، قد غلوتامات الإشارات في الدماغ بدور تنظيمي في سياق الألم1،2. ومن ثم، هناك حاجة لدراسة مسارات الإشارات الخلوية والجزيئية في الدماغ فيما يتعلق بالألم. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى فهم إذا كان يمكن تعديل أهداف جزيئية في مناطق محددة من الدماغ لعلاج الألم. الدراسات الحالية للألم في الدماغ يعتمدون في المختبر الدراسات الكهربية في تركيبة مع الجهازية تسليم وكلاء الدوائية (داخل). في المختبر الدراسات لديها عجز واضح في الكشف عن آليات الألم في فيفو . وفي الوقت نفسه، إيصال الأدوية الجهازية لا تحدد الأهداف الخلوية الدقيقة. في فيفو الحقن داخل الجمجمة من العوامل الكيميائية والبيولوجية أصبحت أداة قوية لدراسة مسارات عصبية والجزيئية في الدماغ. وفي السنوات الأخيرة، استخدمت الحقول الأخرى في فيفو الحقن داخل الجمجمة بنجاح دراسة سلوكيات الإدمان والمكافأة ومسارات الدائرة في القوارض3،4. ومع ذلك، في سياق الألم، ينقصنا الاستخدام في فيفو الصيدلة داخل الجمجمة.
الحقن داخل الجمجمة تسمح لدقيقة حقن المخدرات في منطقة معينة من الدماغ. وعلاوة على ذلك، مسارات محددة والمستقبلات يمكن استهداف استخدام المخدرات انتقائية للغاية. المزيج من نظام التسليم داخل الجمجمة مع المخدرات الدقة يسمح لنا باستهداف الأهداف الجزيئية والخلوية للألم. بعد تسليم هذه الأدوية داخل الجمجمة، يمكن للباحثين يلاحظ الآثار المباشرة في سلوك القوارض. من تجارب أجريت أيضا، ويمكن ربط السلوكيات القوارض مع علم الصيدلة.
في هذا البروتوكول، استخدمنا المثال ضخ أمباكيني في قشرة prefrontal (PFC) تثبت إليه غلوتامات القشرية إشارات في التنظيم الأم. أمباكينيس هي المركبات الاصطناعية التي تعرف المغيرون اللوستيريك. أنها أظهرت القدرة على تخفيف حدة ونماذج الألم المزمن في الحيوان5،6. الدراسات السابقة تشير إلى أن المواقع المحتملة لعمل أمباكينيس في5،الدماغ6. الهيدروكربون المشبع بالفلور وهي منطقة في الدماغ الذي يسلك من أعلى إلى أسفل عنصر التحكم إلى المناطق سوبكورتيكال لتنظيم المزاج والسلوك. بعض من هذه الإسقاطات الإخراج أظهرت أن يكون المفتاح في الألم اللائحة1،،من27. وبشكل أكثر تحديداً، قد تبين غلوتامات إشارات في اللجنة المالية الدائمة لتنظيم الألم. وهكذا، اختير الهيدروكربون المشبع بالفلور كمنطقة مستهدفة الدماغ لدراسة أمباكينيس في الدول الأم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات في هذه الدراسة بموافقة "نيويورك جامعة كلية للطب المؤسسية الحيوان الرعاية" واستخدام اللجنة (IACUC) متسقا مع "المعهد الوطني للصحة" (NIH) الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1-غرس القنية ستيريوتاكسيك
- استخدم الأسبوع 10-12 القديمة ذكور الفئران سبراغ داولي.
- كما هو موضح سابقا، تخدير الحيوانات مع 1.5-2% إيسوفلوراني1،،من35. حالما يصبح الحيوان غير قادر على الاستجابة إلى رشة قوية مع الملقط حادة، إجراء عملية جراحية. تأكد من اﻷوتوكﻻف جميع الصكوك واستخدام القفازات الجراحية المعقمة، وإضافة مرهم العيون إلى العيون للحيوان لمنع الضرر.
- ستيريوتاكسيكالي زرع cannulas ثنائية 26-قياس دليل إلى PFC زاوية درجة 12.5 مع إحداثيات AP: +2.9 مم؛ مل: + −1.6 مم؛ العنف المنزلي: −2.1 ملم. من أجل إدراج cannulas، حفر ثقوب في الجمجمة عند الإحداثيات المطلوبة، مع حفرة قطرها وفقا لحجم cannulas المستخدمة.
ملاحظة: هنا، الهيدروكربون المشبع بالفلور ودرس كهدف محتمل ليزرع داخل الجمجمة بسبب دورها الهام في معالجة الألم، التي أثبتت في عدد من الدراسات السابقة1،،من27. يمكن استخدام الباحثين لدراسة مهمة أخرى مناطق محددة من الدماغ، إحداثيات مختلفة وفقا لنظام أطلس الدماغ. لمزيد من التفاصيل حول إجراء جراحة داخل الجمجمة الرجاء راجع تضليع et al (2013)3ولي et al (2015)1والشمس وآخرون (2017)10. - السماح للفئران للتعافي من الجراحة لمدة أسبوع واحد على الأقل. في أعقاب عملية جراحية، حقن السوائل تحت الجلد قبل الاسترداد للمساعدة على دعم متطلبات الأيض، وتطبيق bupivacaine الموضعية في شق طازجة مغلقة. وضع الحيوان على وسادة دافئة حتى تستيقظ، ورصد عملية post الحيوان لمدة 3 أيام لضمان الصحة الجيدة، واستعادة سليم.
- بمجرد الحيوانات شفوا تماما من الجراحة، يبدأ حقن (الخطوة التالية).
2-داخل الجمجمة وداخل حقن
- للحقن داخل الجمجمة، استخدام أنابيب PE-50 المرفقة في نهاية واحدة إلى 10 ميكروليتر هاملتون المحاقن مع حاقن 33-قياس القنية التي تمتد 1.0 مم بعد أدلة مزروع.
- حقن ميكروليتر 0.5 (أو أقل إذا رغبت في ذلك) لدراسة المخدرات أو المالحة في اللجنة المالية الدائمة لهذه الفئران. للجنة المالية الدائمة ومنطقة أكبر في الفئران، هذا المبلغ لن يمتد إلى مناطق أخرى. ومع ذلك، لمناطق الدماغ أصغر أو للفئران، استخدام وحدة تخزين أصغر. كمية حقن سيتوقف على منطقة الدماغ والأنواع الحيوانية.
ملاحظة: يرجى ملاحظة أن المحلول الملحي ينبغي أن تستخدم كعنصر تحكم بدلاً من [دمس] لأن [دمس] عصبية. ومع ذلك، قد تكون كمية صغيرة جداً من [دمس] آمنة للتسريب، كما أظهرت الدراسات أن أقل من 50% من [دمس] (أي أقل من إجمالي حجم 0.3 ميكروليتر، كما في هذه الحالة) قد لا تتداخل مع السلوك الدراسات8،9. - إدخال حجم ثنائيا على مدى فترة 100 cannulas حاقن s وتبقى في المكان قبل s 60 إضافية لإزالة للسماح ببطء نشر هذا الحل.
- للدراسات المتعلقة بآثار التآزر الدوائي، شاركت إدارة المخدرات آخر من خلال الأساليب المنهجية. في هذه الحالة، حقن المخدرات المطلوب أو عنصر التحكم إينتراكرانيالي وإدارة المخدرات إضافية إينترابيريتونيلي مباشرة بعد ذلك. على سبيل مثال، درسنا في هذه الدراسة آثار مسكن تعاوني من المورفين وأمباكينيس لاختبار تأثير مضافة. نحن غرست أمباكيني إينتراكرانيالي، في تركيبة مع التسليم داخل 1 مغ/كغ المورفين (جرعة آمنة الجهازية)10.
ملاحظة: من المستحسن أن الحقن داخل الجمجمة تتم أولاً، كما أكثر صعوبة لأداء من الحقن داخل.
3-فحوصات التسكين والتقييم
- لدراسة تأثير الحقن داخل الجمجمة على سلوك الأم حادة في الفئران، استخدم اختبار اللفافة (هارجريفز الاختبارات) لحساب الكمون الانسحاب في الاستجابة للمحفزات الحرارية. جهاز هارجريفز يركز أشعة تحت الحمراء عن طريق طائرة زجاج على الفئران القدم. الفئران الدائمة وتتحرك بحرية فوق الطائرة الزجاج. عند إجراء اختبار هارجريفز، تركز الأشعة تحت الحمراء تحت منطقة أخمص القدم في الفئران.
- ابدأ بإجراء اختبارات الأساس هارجريفز قبل الحقن، تحديد قيمة خط أساس للمقارنة.
- عدم حقن أي دواء من أي نوع قبل إنشاء قيمة خط أساس. إجراء محاكمات جيدة 5، 5 دقيقة عن بعضها البعض. تتم الإشارة إلى محاكمة جيدة قبل انسحاب واضحة، أي عند الفئران الانحناءات في الركبة ويرفع به سيرا على الأقدام إلى الأعلى وإلى الجسم.
ملاحظة: تأكد من المحاكمات 5 دقائق عن بعضها البعض لمنع توعية الفئران. جهاز هارجريفز يسجل تلقائياً وقت الانسحاب، بمجرد كسر الأشعة تحت الحمراء. كنتيجة لذلك، يجب التأكد من خصم المحاكمات من الحركة، وتحول الوزن، و ما إلى ذلك إذا كان يحدث محاكمة مخفضة وانتظر 5 دقائق وتكرار المحاكمة. - حساب عتبات الانسحاب بأخذ متوسط 5 المحاكمات.
- بعد الحصول على متوسط أساس، تبدأ هذه التجربة للحصول على أوقات الانسحاب بعد حقن المخدرات. هارجريفز يمكن أن تكون الاختبارات أداء 20-30 دقيقة بعد الحقن داخل الجمجمة، على الرغم من أن التوقيت الدقيق قد يكون معتمداً على الدوائية عوامل محددة. هذا لضمان أن الفئران قد استوعبت المخدرات، والتي تعاني من آثارها. إجراء هذه التجربة بنفس الطريقة كخطوة 3.1.
- حساب عتبات الانسحاب كما هو مذكور في الخطوة 3، 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على سبيل مثال، نحن أكسب أمباكيني إلى PFC عبر cannulas (الشكل 1). ونحن أيضا غرست المورفين النظامية لتقييم آثار مسكن تعاوني بين أمباكينيس والمورفين. وتظهر هذه النتائج أن أمباكينيس والمورفين لها تأثير مسكن مضافة. ويظهر أيضا أن الحقن داخل الجمجمة لديها القدرة على اكتشاف، على الأقل في جزء منه، إليه لتفعيل المخدرات في السياق من الألم.
رقم 1. حقن أمباكينيس داخل الجمجمة والجهازية حقن المورفين يقدم التسكين مكملة. رسم بياني مقارنة الاختفاء الانسحاب من اختبار هارجريفز بعد داخل الجمجمة حقن المحلول الملحي أما، أمباكينيس، أو أمباكينيس مع الجهازية حقن المورفين. تمثل أشرطة الخطأ يعني مع sem. ن = 8؛ ف < 0.0001، * *p = 0.0099، *p = 0.0124، مزاوج الطالب t-اختبار. وهذا الرقم قد تم تكييفه من صن et al. (2017) 10، بإذن من السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وقد أثبتنا أن الصيدلة داخل الجمجمة هو أداة قوية لدراسة آليات الألم وإمكانات كنظام توصيل علاجية. في البروتوكول، ولدينا نحن تسليم أمباكينيس مباشرة إلى اللجنة المالية الدائمة، ووجدت أن بتعزيز غلوتامات إشارات في اللجنة المالية الدائمة، أمباكينيس المقدمة لتخفيف الآلام. كنا قادرين على إثبات ذلك عن طريق استخدام الحقن داخل الجمجمة جنبا إلى جنب مع الحقن داخل، مع فحوصات الألم اللاحقة. وتقترح الدراسة الحالية استناداً إلى أدلة آثار تخفيف الألم، عندما يتم تسليم أمباكينيس للجنة المالية الدائمة، قد تورط في الهيدروكربون المشبع بالفلور كهدف أمباكينيس. هذا ميزة هامة للنهج الدوائية داخل الجمجمة، عندما تقترن باختبار السلوك. وبالإضافة إلى ذلك، القدرة على الجمع بين داخل الجمجمة مع الجهازية إيصال المخدرات يسمح لنا بفهم العلاقة العلاجية بين اثنين من المخدرات المختلفة وتفاعلات دوائية المحتملة. في المثال الموضح في هذه الدراسة، يظهر القائمة أمباكيني إلى اللجنة المالية الدائمة في تركيبة مع المورفين تأثير مضافة المتوقعة، مما يشير إلى أن أمباكينيس والمورفين تعمل عن طريق مختلف الآليات الجزيئية.
على الرغم من أن علم الصيدلة في فيفو أداة قوية لدراسة الألم، لها حدود. أولاً، من الممكن أن المخدرات التي غرست يمكن منتشر في أيدي عديمي الخبرة، للدماغ في المناطق المجاورة. وهذه مشكلة خاصة مع الفئران. هذا يمكن التغلب على ذلك باستخدام العقاقير المنشط الضوء وغرس ألياف البصرية، بقياس مستويات المخدرات على مسافات مختلفة من موقع الحقن، أو عن طريق حقن المخدرات في إغلاق المواقع التشريحية. الحقن داخل الجمجمة، والثاني يمكن أن يكون قصير الأمد، ولكن الفترة الزمنية للأثر ليست معروفة تماما سبب الدوائية للمخدرات. تقنيات أخرى، مثل أوبتوجينيتيكس، تسمح للتنشيط الفوري أو المنظمة لمنطقة المرجوة من الدماغ؛ هذا الأسلوب هو أكثر مباشرة وفترة معروفة من تأثير. من ناحية أخرى، في فيفو الصيدلة يمكن استهداف مستقبلات محددة أو مسارات الإشارات، وبالتالي توفير مستوى إضافي من خصوصية الجزيئية. وهكذا، في المستقبل، سيكون من الضروري استكشاف الجمع بين علم الصيدلة في فيفو مع تقنيات إضافية، مثل في فيفو فسيولوجيا وأوبتوجينيتيكس. مع المزيج من هذه الأدوات، يمكن اكتشاف مسارات جديدة ومسارات مستقبلات محددة وتستخدم لعلاج الألم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها المعهد العامة الطبية العلوم الوطنية (GM102691، GM115384)، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS100065)، (بيثيسدا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) و "التخدير الصندوق من نيويورك جامعة إدارة البحوث" من التخدير (نيويورك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
