Summary
Aquí presentamos un protocolo para llevar a cabo experimentos farmacológicos intracraneales seguidos por análisis de comportamiento del dolor en roedores. Este protocolo permite a los investigadores ofrecer objetivos moleculares y celulares en el cerebro, de agentes farmacológicos en el tratamiento del dolor.
Abstract
El dolor es una experiencia sensorial saliente con dimensiones afectivas y cognitivas. Sin embargo, mecanismos centrales para el dolor siguen siendo mal entendidos, lo que dificulta el desarrollo de terapias eficaces. Farmacología intracraneal presenta una herramienta importante para la comprensión de los mecanismos moleculares y celulares del dolor en el cerebro, así como para nuevos tratamientos. Aquí presentamos un protocolo que integra Farmacología intracraneal con pruebas de comportamiento de dolor. En concreto, mostramos cómo infundir fármacos analgésicos en una región del cerebro selectos, que puede ser responsable de la modulación del dolor. Además, para determinar el efecto de la droga del candidato en el sistema nervioso central, se realizan ensayos de dolor después del tratamiento intracraneal. Nuestros resultados demuestran que la administración intracraneal de fármacos analgésicos en una región específica puede proporcionar alivio del dolor en roedores. Así, nuestro protocolo con éxito demuestra que farmacología intracraneal, combinada con pruebas de comportamiento del dolor, puede ser una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos de dolor en el cerebro.
Introduction
El sistema nervioso central es conocido por desempeñar un papel clave en la regulación del dolor. Por ejemplo, el glutamato en el cerebro tiene un papel regulador en el contexto de dolor1,2. Por lo tanto, es necesario para el estudio de vías de señalización celulares y moleculares en el cerebro con respecto al dolor. Además, hay que entender si dianas moleculares en regiones específicas del cerebro pueden ser modificados para tratar el dolor. Los estudios actuales del dolor en el cerebro dependen en vitro los estudios de electrofisiología en combinación con entrega (intraperitoneal) sistémica de agentes farmacológicos. Estudios in vitro tienen déficit evidente en revelar los mecanismos de dolor en vivo . Mientras tanto, el suministro de medicamentos sistémicos no delinear las precisa dianas celulares. En vivo intracraneales inyecciones de agentes químicos y biológicos se han convertido en una poderosa herramienta para estudiar los caminos neurológicos y moleculares en el cerebro. En los últimos años, otros campos han utilizado en vivo intracraneal inyecciones para estudiar con éxito comportamientos de adicción y la recompensa y las vías de circuito en roedores3,4. Sin embargo, en el contexto de dolor, el uso de en vivo intracraneal Farmacología está careciendo.
Las inyecciones intracraneales permiten exactos de la inyección de un medicamento en un área específica del cerebro. Además, receptores y vías específicas pueden orientarse utilizando medicamentos altamente selectivos. La combinación de un sistema de entrega intracraneal con fármacos de precisión nos permite atacar objetivos moleculares y celulares para el dolor. Después del parto intracraneal de estos fármacos, los investigadores pueden observar los efectos inmediatos en el comportamiento de los roedores. De experimentos realizados, comportamientos de los roedores pueden vincularse con la farmacología.
En este protocolo, utilizamos el ejemplo de la ampaquina infusión en la corteza prefrontal (PFC) para demostrar el mecanismo del glutamato cortical de señalización en la regulación del dolor. Ampaquinas son compuestos sintéticos que son moduladores alostéricos. Han demostrado la capacidad para aliviar el agudo y dolor crónico en animales modelos5,6. Estudios anteriores sugieren que los sitios probables de la acción de ampaquinas son en el cerebro5,6. El PFC es una región del cerebro que muestra de arriba hacia abajo el control a las áreas subcorticales que regulan el estado de ánimo y comportamiento. Algunas de estas proyecciones de salida han demostrado ser clave en la regulación de dolor1,2,7. Más específicamente, glutamato en el PFC se ha demostrado para regular el dolor. Así, el PFC fue elegido como un área del cerebro específica para el estudio de ampaquinas en Estados de dolor.
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Protocol
Todos los procedimientos en este estudio fueron aprobados por la Nueva York University School de medicina institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) como compatible con la guía del National Institute of Health (NIH) para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. implantación de cánula estereotáctica
- Uso de ratas Sprague-Dawley macho 10-12 semana de edad.
- Como se describió anteriormente, anestesiar animales con 1.5-2% isoflurano1,3,5. Una vez que el animal responde a un fuerte pellizco con pinzas afiladas, realizar la cirugía. Asegúrese de autoclave todos los instrumentos, utilice guantes quirúrgicos estériles y añadir ungüento oftálmico a ojos del animal para evitar daños.
- Stereotaxically implante cánulas bilaterales guía 26-calibre en el PFC en un ángulo de 12,5 grados con coordenadas AP: +2,9 mm; ML: + −1.6 m; DV: −2.1 mm. Para introducir las cánulas, perfore agujeros en el cráneo en las coordenadas deseadas, con diámetro de agujero según el tamaño de las cánulas que se utilizan.
Nota: Aquí, el PFC se estudió como destino potencial para los implantes intracraneales debido a su importante papel en el procesamiento del dolor, que se ha demostrado en varios estudios anteriores1,de2,7. Para estudiar la función de otras áreas específicas del cerebro, los investigadores pueden utilizar diferentes coordenadas según el atlas del cerebro. Para más detalles sobre la realización de cirugía intracraneal ver Goffer et al (2013)3, Lee et al (2015)1y Sun et al (2017)10. - Permitir que las ratas a recuperarse de la cirugía durante al menos 1 semana. Después de la cirugía, inyectar líquidos subcutáneos antes de la recuperación para ayudar a cubrir los requerimientos metabólicos y aplicar bupivacaína tópica en la incisión recién cerrada. Coloque el animal en una almohadilla caliente hasta que se despierte y monitorear la operación post animal durante 3 días asegurar la buena salud y una recuperación adecuada.
- Una vez que los animales se han recuperado completamente de la cirugía, iniciar las inyecciones (siguiente paso).
2. inyecciones intraperitoneales e intracraneales
- Para inyección intracraneal, utilice tubos de PE-50 conectado en un extremo para 10 μL Hamilton jeringas con cánula de calibre 33 inyector que se extienden de 1,0 mm más allá de las guías de implantado.
- Inyectar 0,5 μL (o menos si se desea) del fármaco del estudio o solución salina en el PFC de estas ratas. Ya que el PFC es una región más grande en las ratas, esta cantidad no se extenderá a otras regiones. Sin embargo, para las regiones del cerebro más pequeños o para los ratones, utilizar un volumen menor. Dependerá de la cantidad inyectada en la región del cerebro y de la especie animal.
Nota: Tenga en cuenta que salina debe usarse como un control en lugar de DMSO porque DMSO es neurotóxico. Sin embargo, una muy pequeña cantidad de DMSO puede ser segura para la infusión, como los estudios han demostrado que menos del 50% de que DMSO (es decir, menos de un volumen total de 0,3 μL, como en este caso) no puede interferir con el comportamiento estudia8,9. - Inyectar el volumen bilateral durante un período de 100 cánulas de inyector s y mantenga en lugar de un adicional 60 s antes de su retiro permitir la difusión lenta de la solución.
- Estudios de efectos farmacológicos sinérgicas, co administrar otro fármaco a través de métodos sistémicos. En este caso, inyectar la droga deseada o control intracranealmente y administrar un fármaco adicional por vía intraperitoneal inmediatamente después. Por ejemplo, en este estudio hemos estudiado los efectos analgésicos sinérgicos de la morfina y ampaquinas para probar un efecto aditivo. Nos infunde una ampaquina intracranially, en combinación con entrega intraperitoneal de 1 mg/kg de morfina (una dosis sistémica segura)10.
Nota: Se recomienda que las inyecciones intracraneales se realizan en primer lugar, ya que son más difíciles de realizar que las inyecciones intraperitoneales.
3. analgesia análisis y evaluación
- Para estudiar el efecto de las inyecciones intracraneales en el comportamiento del dolor agudo en ratas, utilice la prueba de plantar (pruebas de Hargreaves) para calcular la latencia de retirada en respuesta a estímulos térmicos. Aparato de Hargreaves enfoca un haz de rayos infrarrojos a través de un vidrio plano en pata de rata; la rata es de pie y moviéndose libremente por encima del plano de vidrio. Al realizar la prueba de Hargreaves, centrar el haz de luz infrarroja en el área plantar de pie de Ratoncito.
- Comenzar por la realización de pruebas de referencia Hargreaves antes de inyecciones, para establecer un valor de referencia para la comparación.
- No inyecte cualquier droga de cualquier tipo antes de establecer un valor de referencia. Realizar 5 ensayos buena, 5 minutos de distancia. Un buen juicio indica una clara retirada, es decir, cuando la rata dobla su rodilla y levanta su pie hacia arriba y en el cuerpo.
Nota: Asegúrese de que los ensayos son 5 min para evitar la sensibilización de la rata. Aparato de Hargreaves registra automáticamente el tiempo de retirada, una vez que el rayo infrarrojo se rompe. Como resultado, asegúrese de último minuto en los ensayos de la locomoción, cambio de peso, etc. si se produce un juicio con descuento, esperar 5 minutos y repetir el ensayo. - Calcular límites de retiro tomando el promedio de los 5 ensayos.
- Después de obtener un promedio de línea de base, comienza el experimento para obtener tiempos de retiro después de la infusión de drogas. Pruebas de Hargreaves pueden ser realizado 20-30 min después de inyecciones intracraneales, aunque el momento preciso puede ser dependiente en la farmacocinética de los agentes específicos. Esto es para asegurar que la rata de absorción de la droga y está experimentando sus efectos. Realizar este experimento de la misma manera como paso 3.1.
- Calcular los umbrales de retirada como se menciona en el paso 3.2.
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Representative Results
Por ejemplo, nos infunde una ampaquina en el PFC vía cánulas (figura 1). También nos infunde morfina sistémica para evaluar los efectos analgésicos sinérgicos entre ampaquinas y morfina. Estos resultados muestran que las ampaquinas y morfina tienen un efecto analgésico aditivo. También muestra que las inyecciones intracraneales tienen el poder de descubrir, al menos en parte, un mecanismo para la activación de la droga en el contexto de dolor.
Figura 1. Inyección intracraneal de ampaquinas y la inyección sistémica de morfina proporcionar analgesia complementaria. Un gráfico comparando latencias de retirada de la prueba de Hargreaves después de inyecciones intracraneales de cualquier solución salina, ampaquinas o ampaquinas con inyección sistémica de morfina. Barras de error representan media SEM. n = 8; p < 0.0001, **p = 0.0099, *p = 0.0124, desapareado de Student t-test. Esta figura ha sido adaptada de Sun et al. (2017) 10, con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, hemos demostrado que farmacología intracraneal es una poderosa herramienta para estudiar mecanismos de dolor y tiene potencial como un sistema terapéutico de entrega. En nuestro protocolo, entregado ampaquinas directamente en el PFC y encontraron que incrementando glutamato de señalización en el PFC, ampaquinas proporcionaron alivio del dolor. Hemos sido capaces de demostrar esto mediante el uso de inyecciones intracraneales combinadas con inyecciones intraperitoneales, con ensayos de dolor posterior. Basada en la evidencia de los efectos para aliviar el dolor, cuando ampaquinas son entregados a lo PFC, el estudio actual sugiere que los PFC puede estar involucrado como un objetivo de ampaquinas. Esto es una ventaja importante del enfoque farmacológico intracraneal, cuando se combina con la prueba de comportamiento. Además, la capacidad de combinar intracraneal con entrega sistémica de fármacos nos permite entender la relación terapéutica entre dos diferentes fármacos y las interacciones farmacológicas potenciales. En el ejemplo mostrado en este estudio, administrar una ampaquina en el PFC en combinación con morfina muestra un esperado efecto aditivo, que indica que ampaquinas y morfina operan a través de diferentes mecanismos moleculares.
Aunque la farmacología en vivo es una poderosa herramienta para el estudio de dolor, que tiene limitaciones. En primer lugar, es posible que, en manos inexpertas, puede difundir el medicamento infundido a las vecinas regiones del cerebro. Se trata de un problema particular con los ratones. Esto podría superar con el uso de drogas activada por luz e implantación de fibras ópticas, medición de niveles de drogas en diferentes distancias desde el sitio de la inyección o inyectando la droga a cerrar sitios anatómicos. Inyecciones en segundo lugar, intracraneales pueden ser corta duración, pero el período de tiempo del efecto no es completamente conocido debido a la farmacocinética de la droga. Otras técnicas, como optogenetics, permiten instantánea activación o inactivación de una región deseada del cerebro; Esta técnica es más directa y tiene un período conocido de efecto. Por otra parte, en vivo Farmacología puede apuntar receptores específicos o vías de señalización y así proporcionar un nivel adicional de especificidad molecular. Así, en el futuro, será necesario explorar combina Farmacología en vivo con técnicas adicionales, tales como en vivo fisiología y optogenetics. Con la combinación de estas herramientas, nuevos caminos y vías específicas del receptor pueden descubiertas y utilizadas para tratar el dolor.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del General médica Ciencias (GM102691, GM115384), Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento (NS100065), (Bethesda, MD, USA) y la anestesia fondo de Nueva York Universidad Departamento de investigación de Anestesiología (Nueva York, NY, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
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