Summary
Burada acı davranış deneyleri Rodents ardından kafa içi farmakolojik deneyler gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı araştırmacılar moleküler ve hücresel hedefleri beyindeki ağrı tedavisinde farmakolojik ajanlar için teslim etmek izin verir.
Abstract
Duygusal ve Bilişsel boyutlar ile belirgin bir duyusal deneyimi acıdır. Ancak, ağrı için merkezi mekanizmalar etkili tedavi gelişimini engelleyen kötü anlaşılır kalır. Kafa içi Farmakoloji beyindeki ağrı moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için hem de yeni tedaviler için önemli bir araç sunar. Burada acı davranış testleri ile intrakranial Farmakoloji entegre bir iletişim kuralı mevcut. Özellikle, biz nasıl analjezik ilaçlar ağrı modülasyon için sorumlu olabilir bir select beyin bölgesi içine demlemek göstereceğim. Ayrıca, merkezi sinir sisteminde aday ilaç etkisini belirlemek için ağrı deneyleri kafa içi tedaviden sonra gerçekleştirilir. Kafa içi yönetim hedeflenen bölge analjezik ilaçların ağrı Rodents sağlayabilir bizim sonuçlar gösterilmektedir. Böylece, bizim Protokolü başarılı bir şekilde kafa içi Farmakoloji, ağrı davranış testleri ile birlikte ağrı mekanizmaları beyinde incelenmesi için güçlü bir araç olabilir gösterir.
Introduction
Merkezi sinir sistemi ağrı yönetmelikte önemli bir rol oynamak için bilinir. Örneğin, Glutamat beyin sinyalizasyon ağrı1,2bağlamında düzenleyici bir rol vardır. Bu nedenle, hücresel ve moleküler sinyal yolları ile ilgili ağrı beyinde çalışmaya gerek yoktur. Buna ek olarak, belirli beyin bölgelerinde moleküler hedeflerin ağrı tedavisinde değiştirilebilir anlamak için bir ihtiyaç vardır. Beyindeki ağrı mevcut çalışmalar Elektrofizyoloji birlikte vitro çalışmalar ile sistemik (mayi) teslim farmakolojik ajanların güveniyor. Vitro çalışmalar vivo içinde ağrı mekanizmaları ortaya çıkarmak açık açıkları var. Bu arada, sistemik ilaç dağıtım kesin hücresel hedefleri betimlemek değil. Vivo kafa içi enjeksiyonları kimyasal ve biyolojik ajanlar beyin nörolojik ve moleküler yolları eğitim için güçlü bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda diğer alanları başarıyla bağımlılığı ve ödül davranışları ve kemirgenler3,4devre yolları çalışmaya vivo kafa içi enjeksiyonları kullandık. Ancak, ağrı bağlamında, vivo kafa içi Farmakoloji kullanımı yetersizdir.
Kafa içi enjeksiyonlar beynin belirli bir alana bir ilacın hassas enjeksiyon sağlar. Ayrıca, belirli yolları ve reseptörleri çok seçici ilaçlar kullanılarak hedeflenebilir. Bir kafa içi iletim sistemi ile hassas ilaçlar ile birlikte ağrı için moleküler ve hücresel hedefler hedef için bize izin verir. Bu ilaçların kafa içi doğumdan sonra araştırmacılar kemirgenler davranışını ilk etkisi gözlemleyebilirsiniz. De yapılan deneylerden kemirgenler davranışlar Farmakoloji ile bağlantılı olabilir.
Bu protokol için biz kortikal Glutamat ağrı yönetmelikte sinyal mekanizmasının göstermek için prefrontal korteks (PFC) AMPAkine infüzyon örneğini kullandı. AMPAkines allosteric modülatörler bilinen sentetik bileşiklerdir. Onlar yeteneği rahatlatmak için akut göstermiştir ve hayvan kronik ağrı5,6modelleri. Önceki çalışmalarda AMPAkines eylem benzeri siteleri beyin5,6' olduğunu göstermektedir. PFC, yukarıdan aşağıya ruh hali ve davranış düzenleyen subcortical alanlarda denetimine sergileyen beyin bölgesidir. Bu çıkış projeksiyonlar bazıları ağrı yönetmelik1,2,7tuşu olmasını göstermiştir. Daha ayrıntılı olarak, PFC sinyal Glutamat ağrı düzenleyen olduğu gösterilmiştir. Böylece, PFC AMPAkines ağrı Birleşik Devletleri incelenmesi için hedeflenen beyin alanı olarak seçildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada tüm yordamları New York Üniversitesi okul tıp kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Kılavuzu ile tutarlı olarak bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım için onaylanmıştır.
1. stereotaksik kanül implantasyon
- 10-12 hafta yaşlı erkek Sprague-Dawley Rat kullanın.
- Daha önce açıklandığı gibi 1.5-%2 isoflurane1,3,5hayvanlarla anestezi. Hayvan keskin Forseps ile güçlü bir çimdik için yanıt vermemeye başlar sonra ameliyat. Emin olmak için basınçlı kap tüm aletleri, steril cerrahi eldiven kullanın ve oftalmik merhem zarar önlemek için hayvanın gözleri ekleyin.
- Stereotaxic koordinatları AP ile 12.5 derece açıyla PFC içine ikili 26-gauge Kılavuzu Kanüller implant: 2,9 mm; ML: +/ −1.6 mm; DV: −2.1 mm. Kanüller ekleyebilmeniz için delik delik çapı kullanılan Kanüller boyutuna göre ile istenen koordinatları kafatası.
Not: Burada, PFC kafa içi implantları için potansiyel hedef olarak gösterdi bir dizi önceki çalışmalar1,2,7ağrı işleme önemli rolü nedeniyle incelenmiştir. Diğer belirli beyin bölgeleri işlevi incelemek için araştırmacılar farklı beyin atlas koordinatlarına kullanabilirsiniz. Kafa içi ameliyat hakkında daha fazla bilgi Goffer ve ark (2013)3, Lee ve ark (2015)1ve güneş ve ark (2017)10bakın. - Fareler ameliyattan en az 1 hafta için kurtarmak izin verir. Cerrahi, metabolik gereksinimleri desteklemek için kurtarma önce subkutan sıvı enjekte ve topikal bupivacaine taze kapalı kesik içinde geçerlidir. Uyan ve sağlıklı ve uygun bir iyileşme sağlamak 3 gündür hayvan yazı işleyişlerini izlemek kadar hayvan üzerinde sıcak bir yastık koyun.
- Bir kez hayvanlar ameliyat tam olarak iyileşti, enjeksiyonları başlar (sonraki adım).
2. kafa içi ve mayi enjeksiyonları
- PE-50 boru bağlı kafa içi enjeksiyonlar için kullanmak için 10-μL bir ucunda Hamilton 1.0 mm implant kılavuzları ötesinde genişletmek 33'lik enjektör kanül ile batar.
- 0.5 μL enjekte (veya daha az arzu edilirse) çalışma uyuşturucu veya bu fareleri PFC salin. PFC fareler daha büyük bir bölgede olduğundan, bu miktar diğer bölgelerine yayılır değil. Ancak, daha küçük beyin bölgeleri veya fare için küçük bir hacim kullanın. Enjekte tutar beyin ve hayvan tür bölge bağlı olacaktır.
Not: Lütfen DMSO sinir hücrelerini tahrip eder çünkü bu serum DMSO yerine bir denetim olarak kullanılması gerektiğini unutmayın. Ancak, çalışmalar az % 50 DMSO (Yani, daha az toplam hacmi bu durumda olduğu gibi 0.3 μL) davranışı ile müdahale değil8,9çalışmalar göstermiştir gibi çok az miktarda DMSO infüzyon için güvenli olabilir. - Birim bilateral 100 s ve tutmak enjektör Kanüller Bu çözümün yavaş Difüzyon izin vermek bir ek 60 s öncesinde kaldırma için yerinde bir süre enjekte et.
- Sinerjik farmakolojik etkileri çalışmaları için ortak sistemik yöntemlerle başka bir ilacı vermek. Bu durumda, istenen uyuşturucu veya denetim intracranially enjekte ve intraperitoneally hemen sonra ek bir ilacı vermek. Örnek olarak, bu çalışmada biz morfin ve bir katkı etkisi için test etmek için Ampakines sinerjik analjezik etkileri okudu. Biz bir AMPAkine intracranially, 1 mg/kg morfin (sistemik bir güvenli doz)10mayi teslimat ile birlikte infüzyon.
Not: Mayi enjeksiyonları yapmak daha zor olduğu gibi kafa içi enjeksiyonları ilk, yapılır önerilir.
3. analjezi deneyleri ve değerlendirme
- Sıçanlarda akut ağrı davranışı üzerinde kafa içi enjeksiyonları etkisini incelemeye, plantar testi (Hargreaves testleri) termal uyaranlara yanıt olarak para çekme gecikmesi hesaplamak için kullanın. Hargreaves aparatı cam uçağa sıçan ayak üzerine bir Kızılötesi ışını odaklanır; fare ayakta ve cam uçak üzerinde serbestçe hareket. Hargreaves Testi gerçekleştirirken, sıçan ayak plantar alan altındaki Kızılötesi ışını odaklanır.
- Enjeksiyon karşılaştırma için bir temel değer kurmak için önce temel Hargreaves testleri gerçekleştirerek başlar.
- Bir temel değer oluşturma önce herhangi bir herhangi bir ilaç enjekte değil. 5 iyi denemeler, 5 min ayrı kuralları. İyi deneme açık bir geri çekilme, fareyi onun diz bends ve yukarı doğru ve vücuda onun ayak asansörler Yani, simgesiyle gösterilir.
Not: denemeler 5 dk Sensitizasyonu sıçan önlemek için ayrı olduğundan emin olun. Kızılötesi ışın kırık olduğunda Hargreaves aparatı çekilmesi, zaman otomatik olarak kaydeder. Sonuç olarak, deneme hareket üzerinden indirim emin olun, ağırlık kaydırması, indirimli bir deneme ortaya çıkarsa, vb 5 dakika bekleyin ve tekrar deneme. - Para Çekme eşikleri 5 denemeler ortalamasını alarak hesaplar.
- Bir temel ortalama elde ettikten sonra para çekme kere ilaçların infüzyon sonra almak için deney başlamak. Ne kadar hassas zamanlama özel ajanlar farmakokinetik üzerinde bağımlı olabilir Hargreaves testleri kafa içi enjeksiyonları sonra yapılan 20-30 dakika olabilir. Bu fare uyuşturucu absorbe ve etkileri yaşanıyor sağlamaktır. Adım 3.1 olarak aynı şekilde bu deney yapmak.
- Para Çekme eşikleri adım 3.2 belirtildiği gibi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek olarak, PFC Kanüller (şekil 1) yolu ile içine bir AMPAkine infüzyon. Ayrıca sistemik AMPAkines ve morfin arasında sinerjik analjezik etkileri değerlendirmek için morfin infüzyon. Bu sonuçlar AMPAkines ve morfin katkı bir analjezik etkisi gösteriyor ki. Ayrıca kafa içi enjeksiyonları keşfetmek, en azından kısmen, uyuşturucu etkinleştirme içeriğinde acı için bir mekanizma gücüne sahip gösterir.
Şekil 1. AMPAkines kafa içi enjeksiyon ve morfin sistemik enjeksiyon tamamlayıcı analjezi sağlamak. Para Çekme gecikmeleri Hargreaves testinden sonra serum fizyolojik, AMPAkines veya AMPAkines kafa içi enjeksiyonları morfin sistemik enjeksiyon ile karşılaştırma bir grafik. Hata çubukları temsil demek SEM n = 8; p < 0,0001, **p = 0.0099, *p 0.0124, = unpaired bir öğrenci t-test. Bu rakam güneş ve ark. adapte edilmiş (2017) 10, Elsevier izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, kafa içi Farmakoloji ağrı mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır ve terapötik bir iletim sistemi gibi potansiyel vardır göstermiştir. Bizim iletişim kuralı ' AMPAkines PFC doğrudan teslim ve sinyal PFC AMPAkines ağrı sağlanan Glutamat güçlendirerek bulundu. Biz bunu kafa içi enjeksiyonları sonraki ağrı deneyleri ile mayi enjeksiyonları ile birlikte kullanılarak göstermek başardık. AMPAkines için PFC teslim edildiğinde ağrısı giderici etkileri, kanıtlara dayanarak, çalışmada PFC AMPAkines bir hedef tutulabilir öneriyor. Bu davranış testleri ile birlikte İntrakraniyal farmakolojik yaklaşımın önemli bir avantajı var. Buna ek olarak, ilaçların sistemik teslimatla İntrakraniyal birleştirme olanağını bize iki farklı ilaç ve potansiyel farmakolojik etkileşimleri arasındaki terapötik ilişkiyi anlamak izin verir. Bu çalışmada gösterilen örnekte PFC morfin ile birlikte içine bir AMPAkine yönetme AMPAkines ve morfin farklı moleküler mekanizmalar aracılığıyla faaliyet gösteren beklenen bir katkı etkisi gösterir.
Vivo Farmakoloji ağrı eğitim için güçlü bir araç olsa da, kısıtlamalar bulunmaktadır. İlk olarak, tecrübesiz ellerde, beyin bölgeleri komşu için infüzyon uyuşturucu diffüz, mümkündür. Bu fareler belirli bir sorun vardır. Bu ışık aktive ilaçların kullanımı ile üstesinden gelebilir ve optik lifler, ilaç düzeyleri enjeksiyon sitesinden farklı mesafelerde ölçümü, veya, uyuşturucu enjekte ederek implantasyonu anatomik siteleri kapatın. İkinci, kafa içi enjeksiyonları kısa süreli olabilir, ama etkisi dönemini tamamen ilaç dozları nedeniyle bilinen değil. Optogenetics gibi diğer teknikleri anlık etkinleştirme veya inactivation beyin istenen bölge için izin; Bu teknik daha doğrudan ve bilinen bir etkisi vardır. Öte yandan, in vivo Farmakoloji belirli reseptörleri veya sinyal yolları hedef ve böylece ek bir moleküler özgüllük düzeyi sağlar. Böylece, gelecekte, keşfetmek gerekli olacaktır vivo Farmakoloji vivo Fizyoloji ve optogenetics gibi ek teknikleri ile birleştirerek. Bu araçlar kombinasyonu ile yeni yollar ve reseptör belirli yolları olabilir keşfetti ve ağrı tedavisinde kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (GM102691, GM115384), sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve inme (NS100065), (Bethesda, MD, ABD) tarafından desteklenen ve anestezi Araştırma Fonu, New York Üniversitesi bölümü Anestezi (New York, NY, ABD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
- Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35 (13), 5247-5259 (2015).
- Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
- Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33 (48), 19034-19044 (2013).
- Carr, K. D., et al. AMPA receptor subunit GluR1 downstream of D-1 dopamine receptor stimulation in nucleus accumbens shell mediates increased drug reward magnitude in food-restricted rats. Neuroscience. 165, 1074-1086 (2010).
- Su, C., et al. AMPAkines target the nucleus accumbens to relieve postoperative pain. Anesthesiology. 125 (5), 1030-1043 (2016).
- Le, A. M., Lee, M., Su, C., Zou, A., Wang, J. AMPAkines have novel analgesic properties in rat models of persistent neuropathic and inflammatory pain. Anesthesiology. 121 (5), 1080-1090 (2014).
- Cooper, S. J. Anaesthetisation of prefrontal cortex and response to noxious stimulation. Nature. 254 (5499), 439-440 (1975).
- Blevins, J. E., Stanley, B. G., Reidelberger, R. D. DMSO as a vehicle for central injections: tests with feeding elicited by norepinephrine injected into the paraventricular nucleus. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 71, 277-282 (2002).
- Schmeichel, B. E., Herman, M. A., Roberto, M., Koob, G. F. Hypocretin Neurotransmission Within the Central Amygdala Mediates Escalated Cocaine Self-administration and Stress-Induced Reinstatement in Rats. Biological Psychiatry. 81, 606-615 (2017).
- Sun, Y., Liu, K., Martinez, E., Dale, J., Huang, D., Wang, J. AMPAkines and morphine provide complementary analgesia. Behavioural Brain Research. 334 (2017), 1-5 (2017).
