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Genetics

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58474

Summary

여기, 우리 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 초파리 비주얼 시스템 내에서 낮은 풍부에 효율적으로 하기 위한 셀 분리 프로토콜을 제시.

Abstract

다음 세대 시퀀싱의 감도에 최근 개선 세포의 작은 숫자 transcriptomic 및 게놈 분석의 적용을 촉진 했습니다. 다양 한 셀 형식 관련 유전자 도구를 자랑 하는 초파리 시각 시스템 개발 연구를이 기술을 활용 하 여 정확한 세포 해상도와 개발의 분자 기초를 해결 하기 위한 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 이러한 접근 가능 하, 그것은 안정적이 고 효율적으로 정화 세포는 두뇌 내의 낮은 풍부에서 존재 하는 능력을 중요 하다. 여기, 우리는 유전 모자이크 실험에서 단일 세포 클론의 효율적인 정화를 허용 하는 방법 제시. 이 프로토콜 우리가 지속적으로 달성 셀룰러 고수익 정화 형광을 사용 하 여 정렬 (FACS) (모든 레이블이 지정 된 셀의 25%), 세포를 활성화 하 고 성공적으로 단일 세포 클론 통해 생성에 transcriptomics 분석을 수행 후 repressible 셀 표시 (MARCM)와 함께 모자이크 분석. 이 프로토콜은 transcriptomic 및 게놈 분석에 적용 특정 세포 유형 시각 시스템에서 다른 유전자 조작의 맥락에서 개발의 다른 단계에 걸쳐 이상적 이다.

Introduction

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Drosophila 시각 시스템 개발 및 행동의 유전 기초 공부에 대 한 뛰어난 모델입니다. 그것은 특정 세포 유형2,3를 조작 하기 위한 고급 유전자 툴킷 진부한 세포질 건축1 구성 되어 있습니다. 이 시스템의 주요 힘이 자율적으로 유전자 기능 유전 모자이크 방법4,5를 사용 하 여 단일 셀 해상도 셀 형식에는 기능입니다. 우리 셀 형식별 transcriptomic 수행을 다음 세대 시퀀싱에 최근의 진보와 함께 이러한 유전적 도구를 결합 하 고 유전 모자이크 실험에서 복제 하는 단일 셀에 게놈 분석.

이 위해 선택적으로 두뇌에 있는 낮은 풍부한 세포 인구를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 개발 필수적 이다. 이전에 우리는 FACS, 번데기 개발 동안 시각적 시스템에서 특정 세포 유형을 분리 하 고 RNA-seq6을 사용 하 여 그들의 transcriptomes 결정에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 실험에서 특정 유형 (예: R7 대뇌)의 세포의 대부분 붙일 표시 했다. 유전 모자이크 실험, 어떤 점에서 동일한 유형의 셀의 하위 집합만 표시 됩니다,이 메서드를 사용 하 여 우리 품질 시퀀싱 데이터를 얻기 위해 충분 한 세포를 분리 하지 못했습니다. 이 해결 하기 위해 우리 셀 분리 프로토콜을 개선 하 여 세포 수확량 증가 하고자 했다.

우리의 접근 방식은 천연된 셀의 건강 극대화, 해 부 및 분리 버퍼를 변경 하 여 세포 건강을 개선 하는 프로토콜의 총 길이 감소 하 고 해 부 조직에 기계적 장애의 양을 줄일 것 이었다. 우리는 repressible 셀 표식5 (MARCM), 단일 붙일 클론 야생 타입 또는 돌연변이의 유전자에 대 한 특정 세포 유형의 분류의 생성 수 있는 모자이크 분석을 사용 하 여 향상 된 프로토콜7 테스트는 그렇지 않으면 heterozygous 비행입니다. 어디, 동일한 조건 하에서 우리의 이전 프로토콜 시퀀스 (seq) RNA에 대 한 충분 한 자료를 생성 하지 못했습니다, 향상 된 프로토콜은 성공적 이었다. 우리 reproducibly 높은 세포 수확량 (레이블이 지정 된 셀의 25%)를 달성 하 고 약간 1000 셀7에서 고품질 RNA-seq 데이터를 가져오는.

여러 프로토콜 이전 초파리6,8,9,10,11,,1213 에 특정 세포 유형을 설명 되었습니다. , 14 , 15 , 16. 이러한 프로토콜은 대부분 뇌 내에서 풍부한 셀을 격리 하기 위한 것. 우리의 프로토콜 FACS를 사용 하 여 후속 transcriptomic 및 게놈 분석에 대 한 시각적 시스템에서 낮은 풍부한 세포 인구 (100 개 미만의 세포 뇌 당)를 분리 하는 데 최적화 되어 있습니다. 우리 reproducibly FACS 및 RNA이 고품질 transcriptome 데이터 취득에 의해 비행 시각 시스템에서 낮은 풍부한 세포를 분리 하는 방법을 제공을 목표로이 프로토콜

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Protocol

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1. 실험 전에 계획

  1. 시작 하기 전에 실험, 유전학 특별히 원하는 셀을 예상 대로 작동 하는 경우 확인 하는 소규모 파일럿 실험을 수행 합니다.
    1. 첫 번째 패스, 사용 immunohistochemistry와 가벼운 현미경을 원치 않는 셀으로 표시 됩니다. 이상적으로, 유전자 표시는 망막과 시 엽 (그림 3) 내에서 특정 있을 것입니다. 만 광 엽 세포 분리에 사용 되 고 중앙 두뇌에 라벨 그래서 문제가 되지 않습니다. 동시에 관심의 셀 수는 뇌 당 표시 결정 합니다.
    2. 유전 상표는 수행 하는 경우 셀의 순수한 인구를 확인 하는 파일럿 FACS 실험 (그림 4) 원하는 특이성 reproducibly 고립 될 수 있다 그리고 또한 관심의 셀 수를 평가 하기 위해 격리 될 수 있습니다 각 두뇌에서. 필요한 경우, 풍부를 결정 하기 위해 정량 PCR 통해 격리 된 세포의 순도 또는 덜 농축 특정 유전자의 평가.
  2. 십자가 실험에 대 한 자료의 원하는 금액을 얻는 데 필요한 수를 결정 합니다.
    참고: 실험 경험에 따라, 붙일 레이블 셀 ~ 17-25%가이 프로토콜을 지속적으로 격리 되며 높은 품질 RNA 시퀀싱 데이터에서 1000 FACS 정화 셀 (적은 세포는 충분 한 있을 수 있습니다) 몇 가지 얻을 수 있습니다.
    1. RNA-seq 분석에 대 한 1000 셀을 붙일 뇌 (20 셀 광 엽 당) 당 표시의 적어도 40 셀 인지 확인 합니다. ~ 10 관심사의 세포는 뇌, 당 정화 한다 그래서 100 머리를 해 부.
    2. 각 실험에서 해 부에 발달의 적절 한 단계에서 100 ~ 파리를, (이 부모님의 genotypes 따라 달라 집니다) 분산에 대 한 선택 ~ 100 십자가 사용 합니다. 파리는 관심의 대립/transgenes homozygous 적은 십자가 설정할 수 있습니다.
    3. 세포 건강을 극대화 하 고 유전자 발현 및 게놈 조직 두뇌는 해 부, 하지만이 조정 될 수 있다 후에 발생할 수 있는 일반적인 변경 최소화 1 h 절 개 창을 제한 합니다. Dissectors는 dissectors의 기술에 따라 1 시간에 100 머리를 해 부 하는 데 필요한 수를 결정 합니다.

2. 비행 일

참고: 파리는 제기 25 ° C ~ 50% 습도 별도로 명시 하지 않는 한. 암컷의 유전자 형을 아래 표시 됩니다 유전자 F, 그리고 수 컷의 유전자 형 m.

  1. 주식을 확대
    1. 젊은 파리 (아무 이상 유전자 F와 오래 된 주)의 100 ~ 병 및 유전자 형 M ~ 30 튜브를 얻을.
    2. 주 1 일 신선한 식품에 유전자 F 100 튜브를 플립. 금요일에 starting, 주 2의 화요일을 통해 매일 튜브를 플립. 이러한 6 넘겼습니다 처녀를 수집에 사용 됩니다. 또한 수요일에 주 2, 신선한 식품에 유전자 형 M의 파리를 플립 하 고 부모 주 2의 금요일에 취소 키를 누릅니다. 이러한 튜브는 남성 십자가 대 한 수집에 사용 됩니다.
  2. 처녀를 수집
    1. 주 3 월요일부터 유전자 F 튜브에서 처녀를 수집 합니다. 2-3 회 하루를 수집 하 고 18 ° C ~ 50% 습도 처녀를 저장. 주 4의 화요일을 통해 매일 반복. 이후 그들 중 많은 다이, 가능한 많은 처녀 수집 하이 좋습니다 십자가 설정 하기 전에. 일반적으로, ~ 2500 처녀 100을 수집 한다 십자가.
  3. 십자가 설정
    1. 주 4 일에 유전자 f 15 처녀와 십자가 (일반적으로 실험 당 100-200 십자가)의 원하는 숫자와 각 교차에 대 한 유전자 형 M의 7 남성을 설정 합니다. 그대로 날개를 가진 젊고 건강 한 남성을 사용 하 여 매우 중요 하다.
    2. 플립 십자가 주 5 토요일 일요일부터 매일. 죽은 파리가 발견 되 면 신선한 처녀 또는 남성 십자가 보충. 그것은 밖으로 건조에서 음식 방지, 그래서 필요에 따라 튜브를 물 필수적 이다. 마른 음식을 크게 수익률을 줄일 것 이다.
  4. FACS 정렬에 대 한 부정적인 제어
    1. 표시 되 고 원하는 셀 없이 부정적인 컨트롤 포함 FACS 정렬. 이상적으로, 부정적인 제어 있어야 합니다 (예: UAS GFP) 기자 하지만 하지 드라이버 (예: GAL4), 기자 (UAS-구문 "새" 수)의 기초 식 게이팅 FACS 정렬에 대 한 적절 한 설정에 결정 될 수 있다 그래야. 실험 파리와 동시에 부정적인 컨트롤에 대 한 파리를 대칭 이동 하 고 같은 방식으로 그들을 무대.
  5. 준비 번데기
    1. 번데기 개발 (예: puparium 대형 [h APF] 후 40 h), 스테이지의 특정 단계에서 세포를 수집 1 h 기간에 맞게 1 h 시간 창에 pupae 해 (위에서 설명한)에 대 한 할당. FACS 셀 분리 해 후 발생 하 고 40 분 후 직접 수행 되어야 한다. 따라서, 준비와 해의 정확한 시간 FACS 가용성에 의해 결정 됩니다.
    2. 특정 시간에 주 6 일 무대에서 40 h APF pupae를, (예를 들어, 오후 5 시) pupae 40 h 후 해 부를 (예를 들어, 수요일에 오전 9). 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 부드럽게 백색 사전 pupae를 선택 하 고 미리 데워 진된 튜브에 벽에 그들을 배치. 만 원하는 유전자와 번데기를 선택 하십시오.
  6. 생물 복제
    1. 각 실험에 대 한 적어도 3 생물 복제를 할. 간단한 방법으로 같은 십자가 사용 하 여 같은 주 (주 6)에 세 번 실험을 반복 합니다. 예를 들어, 화요일 및 수요일, 두 번째 및 세 번째 복제에 대 한 pupae 각각 무대. 각각 목요일 및 금요일 이러한 pupae를 해 부.

3. 샘플 준비

참고:이 프로토콜에 사용 된 모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

  1. 해 및 조직 분리에 대 한 솔루션을 준비
    1. 분해 효소 혼합 재고 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조) ddH2O 26 Wünsch 단위 (우)의 농도에 동결 건조 된 효소를 재구성 하 여 / mL. 260 우 (큰 병)를 포함 하는 유리병, 유리병, ddH2O의 10 mL를 추가할 및 단일 사용 aliquots (4.2 µ L은 분리 당 필요)를 확인. -20 ° c.에 게 재고 솔루션 각 실험 두 샘플 (부정적인 제어 및 실험 조직)의 분리를 요구 한다.
    2. Rinaldini의 솔루션 (RS)와 완전 한 슈나이더의 미디어 (CSM) x 10 (월요일의 주 6) 해 부 하기 전에 하루를 준비 합니다. 각 것에 대 한 CSM의 5 mL 및 RS x 1의 약 5 mL 2 샘플의 분리에 대 한 CSM의 5 mL을 준비 (부정 제어 실험). 4 ° C에서 한 달 최대 10 x RS 및 CSM 주일 4 ° C에서 저장 합니다.
      1. 준비 하려면 10 x rs 100 mL, NaCl, KCl, NaH24, NaHCO3 및 ddH2O 250 mL 비 커 100 mL에 포도의 1 g 1 g의 50 밀리 그램의 200 mg의 8 g을 분해. 필터는 0.22 m m 필터와 소독.
      2. DdH2O는 microtube 1 mL를 L Glutathione의 20 밀리 그램을 추가 합니다.
      3. 업체인 CSM의 50 mL를 준비 하려면 추가 열을의 5 mL 비활성화 소 혈 청 인슐린 솔루션 10 mg/mL의 0.1 mL, 200 m L-글루타민 솔루션 m의 5 mL, L-티, 20 mg/mL의 12.5 μ 그리고 페니실린-스 솔루션 (5000 단위의 페니실린과 스의 5 mg의 1 mL / mL) 38.9 ml 슈나이더의 미디어의. 필터는 0.22 m m 필터와 소독.
      4. RS 작업 솔루션 x 1을 ddH2O 10 x RS 희석. 각 샘플에 대 한 비 접착제 microtubes에 1 x rs 500 μ를 준비 합니다.
    3. 물 욕조에 설정 하 고 37 ° c.에 온도 설정 온도 온도계를 사용 하 여 정확 하 게 다는 것을 확인 하십시오. 물 목욕 papain 활성화 전에 정확한 온도에 있어야 합니다. 아침 해 부 하기 전에 저녁 온도 설정 하는 것이 좋습니다.
  2. Papain과 분해 효소 준비 혼합
    참고: 모든 분리 하기 전에 신선한 papain 솔루션을 확인 합니다.
    1. 화요일에 주 6 약 45 분에 해를 시작 하기 전에, 4 ° C에서 papain 분말의 1 유리병을 검색 하 고 실 온에서 품 어. 또한 papain 분말에 추가 나중에 실 온에서 Eppendorf 관에 CSM 정해.
    2. 해의 시작에 앞서 분 실내 온도 CSM 유리병 (뚜껑)를 통해 직접 papain의 추가 하는 농도 100 단위/mL을 주사기를 사용 하 여 (각 유리병에 분말의 양을 약간 다르다;는 유리병 포함 123 단위 추가 1.23 m 업체인 CSM의 L)입니다. 혼합, 먼저, 뚜껑의 안쪽에 붙어 있는 분말을 잡으려고 유리병을 반전 하 고 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.
    3. 물 목욕에서 37 ° C 물 들어 있는 비 커에 유리병을 추가 합니다. Papain 솔루션의 유리병 부동 하지 있는지 확인 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 papain 활성화
    4. Papain는 물 목욕에서 비 커를 추가한 후-20 ° C에서 분해 효소 혼합 (26 우/mL)의 약 수를 검색 하 고 실 온에서 품 어. 정품 인증의 30 분, 후 실 온에서 papain를 품 어.
    1. 주 6 일 깨끗 한 집게와 차가운 CSM에 준비 된 번데기 두뇌를 해 부 고 광 엽과 중앙 두뇌의 교차점에 곤란 하 여 시 돌출부를 잘라.
    2. (한 microtube 실험 조직에 대 한)와 부정적인 제어 조직 한 1 x rs 500 μ를 포함 하는 microtube 하단에 돌출부를 추가 합니다. 얼음에 튜브를 항상 유지.
    3. 1 시간에 최대한 많은 돌출부를 해 부. 부정적인 통제 조직 10 돌출부는. 수영장은 microtubes 사이의 전송 중 조직 손실 제거 하는 단일 microtube로 광 엽 해 부.
  3. 세포 분리
    1. 돌출부를 커버 하기에 충분 한을 떠나 P200 피 펫을 사용 하 여 해 부 시 돌출부와 1 x RS는 microtube부터 조심 스럽게 제거 합니다. 신중 하 게 두뇌를 가능한 조금 방해 되므로 튜브의 측면에 1 x rs 500 μ를 추가 합니다. 얼음에 튜브를 항상 유지.
    2. 돌출부는 바닥에 정착 하자. 그냥 한 번, 200 μ를 채택 하 고 혼합 플라스틱 (돌출부 주위에 이동 한다). 다시 정착 하는 돌출부를 하자.
    3. 두 개의 샘플 (실험 및 부정적인 제어)의 aliquot 600 μ는 microtube로 실내 온도 papain 활성화. 실내 온도 분해 효소 혼합의 4.2 μ 0.18 우/mL의 최종 농도를 600 μ papain 솔루션에 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 이것은 분리 솔루션 이다.
    4. 조심 스럽게 각 샘플에서 1 x RS를 제거 하 고 돌출부를 분리 솔루션의 300 μ를 추가. 25 ° C, microtube thermomixer에 15 분 동안 1000 rpm에서 샘플을 품 어.
    5. 5, 10 분 시간 포인트에서 thermomixer 및 돌출부는 microtube의 바닥에 싱크 하자 중지. 혼합 솔루션 및 밖으로 피펫으로 200 μ를 차지 합니다.
    6. 15 분 후 돌출부는 바닥에 정착 하 고 돌출부 (하려고 하지 방해 하는 돌출부)에서 조심 스럽게 분리 솔루션을 제거 하자.
    7. 1 x RS 두 번 씻어. 이렇게 하려면 신중 하 게 추가 500 μ 1 RS (하려고 하지 돌출부를 방해) x. 혼합 하려면, 200 μ를 피펫으로 부드럽게 다음 피펫으로 microtube에 밖으로. 돌출부는 바닥에 침 몰 하 고 반복 하자.
    8. 각 샘플 (이전 단계와 동일) CSM의 500 μ로 두 번 씻는 다.
    9. 조심 스럽게 업체인 CSM을 제거 하 고 관에 CSM의 또 다른 200 μ를 추가 합니다. 솔루션은 균질 성까지 거품, 없이 아래로 pipetting으로 조직 방해 P200 피 펫을 사용 하 여 (즉, 더 이상 볼 수 조직의 잔해).
    10. 얼음에 5 mL FACS 튜브에 세포 현 탁 액 30 μ m 메쉬 모자를 통해 필터링 (는 P200 사용 하 고 전체 서 스 펜 션 통과 있는지 확인). 분리 microtube 린스에 CSM의 또 다른 500 μ를 추가 하 고 솔루션 FACS 관으로 필터링.
    11. 신중 하 게 FACS 튜브의 모자를 벗고, 아래는 p 200와 메쉬 필터 솔루션을 수집 하 고 FACS 튜브에 서 스 펜 션의 나머지를 추가. 샘플은 FACS에 대 한 준비가 되었습니다.
    12. FACS 정화 셀 준비를 사전에 수집에 대 한 microtubes를가지고 해야 합니다. RNA-seq, RNA 정화 키트에서 실내 버퍼 (세포의 용 해 버퍼)의 300 μ를 포함 하는 microtubes에 직접 각 샘플에서 셀 정렬 (1: 100 2-사용 하기 전에 Mercaptoethanol 추가).
  4. FACS 정렬
    참고: 분리, 후 즉시 FACS (최대 1 시간)에 의해 셀 정렬. 있는지 확인 하십시오 책 FACS 세션에 따라 실험을 위해 계획할 때. 셀 정렬 100 μ m 노즐 크기 일반적으로 사용 됩니다.
    1. 부정적인 제어 및 정렬에 대 한 게이트 설정 실험 샘플 셀 분포를 비교 합니다. 이상적으로, 파일럿 FACS 실험에서 게이팅 설정 하며 부정적인 컨트롤 샘플 확인 또는 미리 설립 게이팅의 미세 조정 제공할 것입니다. 관심의 셀 배경 셀 부정적인 제어 및 실험 샘플 (그림 4)에 존재 하는에서 잘 분리 되어야 한다 (파일럿 실험에서 이것을 테스트).
    2. 준비 된 컬렉션 튜브에서 정렬된 셀을 수집 합니다.
  5. RNA 정화
    1. 후 실내 버퍼, 아래로 세포를 lyse을 피펫으로 300 μ에 직접 셀을 정렬 합니다.
    2. 동물 및 정화를 사용 하 여 인간의 세포에서 총 RNA의 정화의 표준 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트 열에 DNA 소화7( 재료의 표참조). RNase 무료 물 20 μ에 RNA elute
    3. 액체 질소와-80 ° c.에 게 RNA 샘플을 동결
    4. 각 실험에 대 한 제어 및 실험 조건에 대 한 최소 3 복제를 수행 합니다. 동시에 모든 샘플에 대 한 cDNA 라이브러리를 준비 하 고 기술 변화에 대 한 제어를 같은 흐름 셀에 모든 샘플을 실행할. 일단 모든 RNA 샘플 준비가 속도 vac를 사용 하 여 2-5 μ (각 샘플)을 볼륨을 줄이기 위해.

4. 준비 cDNA 라이브러리 및 스마트 seq2에 의해 시퀀싱

참고: 기술 변화를 최소화 하기 위해 모든 cDNA 라이브러리를 동시에 만들고 동일한 흐름 셀에서 시퀀스.

  1. 스마트 seq217 다음 수정 제외에 대 한 표준 프로토콜에 따라 cDNA 라이브러리를 집중된 RNA의 1.5 μ의 입력을 사용 하 여: 다른 고 충실도 PCR 마스터 PCR를 위해 ( 재료의 표참조)를 혼합 사용 증폭; 열에 PCR 정화를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 자석 구슬 대신 ( 재료의 표참조)을 키트.
  2. 스마트 seq2 프로토콜 tagmentation 후 반전 녹음 방송으로 최종 농축 PCR 단계 후 PCR 사전 증폭 단계를 포함합니다. PCR 확대 주기의 수 입력된 물자의 풍부에 따라 다릅니다. 입력으로 1000 셀, 일반적으로 사용 하 여 PCR 증폭을 사전 단계에서 15 주기 및 12 사이클 최종 농축 PCR 단계에 대 한.
  3. 라이브러리를 풀 고 단일 흐름 셀 (예를 들어, NextSeq 플랫폼)에 순서.

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Representative Results

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일반적인 계획
프로토콜의 일반적인 체계는 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 세 가지 주요 부분으로 나누어져: 작업, 샘플 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석. "실험 전에 계획" 세션 프로토콜의 편의상 일반적인 계획에 포함 되지 않습니다.

타임 라인
(비행 작업 및 샘플 준비) 프로토콜의 주요 부품의 캘린더는 그림 2에 표시 됩니다.

Confocal 현미경 검사 법에 의해 셀 전용 라벨 확인
대표적인 실험 L3 lamina monopolar 뉴런 (L3) 붙일 분류 했다. L3 신경 5 동종 lamina 뉴런 (L1-L5)을 광범위 하 게 조정 된 대뇌 R1-r 6에서에서 입력을 받을 대상 모 수에 신경 하 synapsing에 의해 높은 센터 정보를 릴레이 중 하나입니다. MARCM 실험에서 단일 셀 L3 클론 mitotic 재결합에 의해 생성 하 고 붙일 이라고 표시 된 두 개의 마커 myr-tdTOM (막), H2A GFP (핵). 십자가에 사용 되는 파리의 genotypes 표 1에 나와 있습니다. 셀 전용 라벨을 확인 하려면 원하는 유전자 형의 플라이 두뇌 관심 (40 h APF)의 발달 단계에서 해 부 했다. Immunostaining는 앞에서 설명한7 24B10 항 체로 서 dsRed과 GFP (그림 3, 마젠타 및 녹색)에 대 한 특정 항 체를 참조 하 여 lamina 및 모 neuropils (그림 3, 블루)에 대 한 수행 했습니다. Confocal 현미경 검사 법 L3 광 엽에서 dsRed와 GFP 이라는 유일한 셀 형식 확인.

FACS에 의해 낮은 풍부한 세포의 고립
결과 정렬 하는 대표 FACS는 그림 4에 표시 됩니다. 100000 이벤트 기록 되었다. 29.9 모든 이벤트의 % 잠재적인 singlets 이며 나머지는 파편 또는 집계 될 수 있습니다. 남자와 서로 다른 크기와 셀 다음에 따라 단위와 크기 문이 되었다. 나머지 하나의 셀 (FSC singlets, 모든 이벤트의 27.3%), L3 뉴런 P1에 꽉 클러스터로 출연 (그림 4, 견본, 마젠타색)는 잘 배경 셀 (그림 4, 견본, 블루)에서 분리 되었다. P 1에 있는 셀의 크기는 비슷한 동종 세포 인구와 일치. 특히, dsRed 및 GFP의 중간 형광 강도 P2 (그림 4, 견본, 녹색)에 몇 가지 셀 p 1에 있는 셀의 꽉 클러스터와 배경 사이의 배 부 되었다. 이러한 세포의 정체성 불분명 했다. P2 셀 P1 세포 보다 다른 크기를 했다, 이후 이러한 세포 비 관련 될 가능성이 있었다. 일반적인 셀에서 잠재적인 오염을 방지 하려면 P1 셀만 실험에 대 한 수집 했다. 100000 이벤트에서 45 P1 셀 얻을 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜의 일반적인 계획. 프로토콜은 세 부분으로 구성 됩니다: 작업, 샘플 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석. 각 부품의 대략적인 처리 시간이 표시 됩니다. 각 부품의 주요 단계는 해당 박스 영역에도 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 비행 작업 및 샘플 준비 일정. 프로토콜에는 약 6 주 걸립니다. 주요 단계에 대 한 타이밍은 달력에 표시 됩니다. 해 부, 분리 및 RNA 정화 FACS 정렬, 같은 날에 완료 되 고 간단 하 게 달력에 표시 되지 않습니다. 3 생물 복제는 동일한 십자가와 같은 주에 순차적으로 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 선택적 라벨을 보여주는 대표적인 confocal 현미경 이미지를 원하는 세포 형광 표식으로. MARCM 실험에서 단일 L3 lamina monopolar 뉴런 myr tdTOM H2A GFP L3 전용 GAL4 드라이버 (9-9-GAL4)18를 사용 하 여 표현 되었다. 원하는 유전자 형의 플라이 두뇌 40hr APF에서 해 부 되었고 (lamina 및 모 수 neuropils 참조)로 안티-dsRed, 안티-GFP와 24B10 항 체와 스테인드. 형광 라벨 confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 했다. L3 신경 세포는 lamina 및 프로젝트 축 삭 모 neuropil 내 종료에서 태어난 다. 각 두뇌에 L3 뉴런의 하위 집합 표현 모두 형광 기자 하 고 이들은 마커를 표현 시 엽에 유일한 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 하나의 L3 lamina 신경 MARCM FACS를 통해 클론 정화: 대표 FACS 음모. 빌 게이츠 (예: P1) 균질 단일 셀을 셀 단위, 크기, 및 형광 강도에 따라 창조 되었다. 마찬가지로 높은 수준의 myr tdTOM 및 H2A GFP를 표현 하는 L3 뉴런 P1 (마젠타)에서 수집 되었습니다. 몇 가지 셀 중간 형광 강도 (녹색) P2에서 관찰 된다. 이러한 P1, L3 뉴런 보다 크기에 서로 다른 그리고 일반적인 셀을 대표할 수 있었다. 이러한 수집 하지 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

유전자 형 소스
w; TubP-GAL80, FRT40, 27 G 05-FLP::PEST/CyO, Kr GAL4 UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B 외., 2018
w; FRT40/CyO, Kr GAL4 UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B 외., 2018

표 1: Genotypes 십자가에 사용 되는 파리의.

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Discussion

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이 프로토콜은 간단 하 고 실행 하기 기술적으로 곤란 하지 하지만 여러 주요 단계는 것을 간과 하는 경우는 세포의 수율에 상당한 감소를 일으킬. (2.3.2 단계입니다.) 그것은 중요 한 십자가 건강 한, 그리고 음식을 밖으로 건조 하지 않습니다. 십자가의 정규 급수는 바로 유전자 형의 올바른 개발 단계에서 해 부에 사용할 수 있는 파리의 수를 최대화 하려면 필수적입니다. 얼마나 자주 급수 할 필요가 십자가 사용 음식과 파리의 주택 조건에 따라 달라 집니다. 십자가 밖으로 건조 하지 않습니다 있도록 검토 튜브 하루에 두 번 하 고 그에 따라 물을 추가. (단계 3.3입니다.) 그것은 또한 단일 microtube 자신의 microtube를 사용 하 여 각 것 있고 그 이후에 샘플 풀링 반대 분리 하는 데 사용으로 해 부 머리를 합동 하는 것이 중요. 이 전송 될 수 있는 microtubes 사이 잃어버린 어떤 두뇌를 제거 합니다. (단계 3.4.9입니다.) 때 수동으로 조직 방해를 위아래로 pipetting, 조직의 아무 나머지 정지에 눈으로 볼 수 있습니다 때까지 이렇게 생명 이다. 불완전 한 조직 장애 FACS, 통해 정렬할 수 있습니다 및 따라서 세포 수확량 감소는 단일 셀의 수를 줄일 것입니다.

세포의 주요 한계는 물자를 시작 합니다. 이와 관련는 해는 여러 가지 이유로 제한 속도: (1) 분리 프로토콜 필요 시 돌출부는 머리 해 부하 고 (2)를 조직 개발 하는 동안 정확한 시간 지점에서 중앙 두뇌에서 분리 하는 시간 해에 대 한 창 되어야 합니다 제한, (3) 이상-기간 해와 FACS, 사이 큰 차선의 기회 세포 건강 및 유전자 발현 및 게놈 조직 (즉, 짧은 해 부에 대 한 일반적인 효과 기간 더). 해 부 시간 시간의 최소 금액에 원하는 양의 재료를 수정 해야 합니다. 문제 해결의 대부분 파일럿 실험에서 수행 됩니다. 여기에 결정적 이다: 밝기와 특이성 (그림 3), 평가 대 한 유전 라벨 최적화 여부 관심의 세포의 재현 인구는 명확 하 게 배경 셀 FACS 플롯 (그림 4)에서 차별, 결정는 (1 단계 참조 후속 응용 프로그램에 대 한 자료의 충분 한 금액을 얻기 위해 해 부 하는 두뇌의 수. 일), 비행 시간 두뇌의 적절 한 숫자를 해 부 하는 데 필요한 최소한의 금액을 결정 하 고.

이 프로토콜의 주요 사전 효율적인 절연 transcriptomic 및 우리의 이전 방법6이상 감도 상당히 개선 게놈 응용 프로그램에 대 한 낮은 풍부한 셀의 수입니다. 우리의 의견을 바탕으로, 붙일 레이블된 인구 광 엽 당 100 개 미만의 세포 구성 된 효율적으로 RNA-seq 분석에 대 한 격리 수 있습니다. Transcriptomic 및 게놈 분석 유전 모자이크 실험, 어떤 점에서 특정 유형의 셀의 하위 집합은 유전자 조작 그렇지 않으면 정상적인 배경에서에서 적용할 수 있습니다. 이것은 중요 한 사전, 같은 실험 복잡 한 조직에서 세포 자치와 자치 비 유전자 기능을 결정 하기 위한 필수적입니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 연구는 NINDS의 보너스 번호 K01NS094545, 신경 퇴행 성 질환의 연구에 대 한 Lefler 센터에서 andgrants에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 우리 인정 Liming 탄 제이슨 McEwan 귀중 한 대화 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

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References

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Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화
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Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).More

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

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