Summary
在这里, 我们提出了细胞离解协议, 以有效地隔离的细胞在低丰度的果蝇视觉系统通过荧光活化细胞排序 (外地资产管制署)。
Abstract
最近对下一代测序灵敏度的改进促进了 transcriptomic 和基因组分析在小数目细胞中的应用。利用这一技术研究果蝇视觉系统的发展, 它拥有丰富的细胞类型特异基因工具, 为解决发展的分子基础提供了一个强有力的方法, 精确的细胞分辨率。为了使这种方法可行, 关键是要有能力可靠和有效地纯化存在于低丰度脑内的细胞。在这里, 我们提出了一个方法, 允许有效地纯化单细胞克隆在遗传马赛克实验。通过该协议, 我们通过荧光活化细胞分选 (25% 的所有标记细胞), 在纯化后始终达到高细胞产量, 并成功地对通过转录组学的单细胞克隆进行了分析。用 repressible 细胞标记 (MARCM) 进行马赛克分析。这个协议是理想的应用 transcriptomic 和基因组分析的特定细胞类型的视觉系统, 跨越不同的发展阶段, 并在不同的基因操作的背景下。
Introduction
果蝇视觉系统是研究发育和行为的遗传基础的优秀模型。它包括一个定型的蜂窝结构1和一个先进的基因工具箱, 用于操作特定的细胞类型2,3。该系统的一个主要优点是能够通过基因镶嵌方法4、5, 自主地在细胞类型感兴趣的单元中对基因功能进行查询。我们试图将这些基因工具与下一代测序的最新进展结合在一起, 在基因镶嵌实验中对单细胞克隆进行细胞类型特异的 transcriptomic 和基因组分析。
要做到这一点, 必须建立一个稳健和有效的方法, 有选择地隔离低丰细胞群的大脑。以前, 我们开发了一个协议, 用于隔离视觉系统中的特定细胞类型在蛹开发过程中通过应用, 并确定其 transcriptomes 使用 RNA 序列6。在这些实验中, 绝大多数的特定类型的细胞 (例如R7 光传感器) 被荧光标记。利用这种方法, 在遗传马赛克实验中, 只有同一类型的细胞子集被标记, 我们未能分离出足够的细胞以获得质量测序数据。为了解决这个问题, 我们试图通过改进细胞离解协议来提高细胞的产量。
我们的方法是减少协议的总长度, 以最大限度地提高分离细胞的健康, 通过改变解剖和离解缓冲来改善细胞健康, 并减少对解剖组织的机械干扰量。我们测试了改进的协议7使用马赛克分析与 repressible 细胞标记5 (MARCM), 它允许生成单个荧光标记克隆的特定细胞类型, 即野生类型或突变体的兴趣基因否则异型飞。在相同的条件下, 我们早先的协议未能为 RNA 序列生成足够的材料, 改进后的协议就成功了。我们重现性获得高细胞产量 (25% 的标记细胞), 并获得高质量的 RNA 序列数据从多达1000细胞7。
以前已经描述了许多协议, 以隔离果蝇6、8、9、10、11、12、13中的特定单元格类型。,14,15,16. 这些议定书主要用于隔离大脑中丰富的细胞。我们的协议是优化, 以隔离低丰富的细胞数量 (每大脑少于100个细胞) 在视觉系统中使用的 transcriptomic 和基因组分析。通过该协议, 我们的目的是为重现性从飞行视觉系统中分离出低丰细胞, 并通过 RNA-转录获得高质量的数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 实验前的规划
-
在开始实验之前, 进行一个小规模的试验, 以确认遗传学是否按预期的那样进行, 以明确标记所需的细胞。
- 作为第一个通行证, 使用免疫组化和光显微镜来确定是否有不需要的细胞被标记。理想的情况下, 基因标记将是特定的视网膜和视神经 (图 3)。只有光学裂片用于细胞离解, 所以在大脑中央的标签不是一个问题。同时, 确定每个大脑有多少个感兴趣的细胞被标记。
- 如果基因标签具有所需的特异性, 则执行一项试验性的重现性实验 (图 4), 以确定是否可以分离出纯的细胞群, 并评估每个大脑中有多少细胞有兴趣被隔离。如果需要, 通过定量 PCR 评估分离细胞的纯度, 以确定特定基因的富集或去富集。
-
确定所需的十字架数量, 以获得所需的材料量的实验。
注: 根据实验经验, 荧光标记细胞的17–25% 与该协议一致隔离, 高质量的 RNA 测序数据仅从1000个纯化细胞中获得 (少量细胞可能足够)。- 为了获得1000细胞的 RNA 序列分析, 确保有至少40个细胞的兴趣荧光标记每脑 (20 细胞每视神经)。大约10细胞的兴趣应该被纯化每脑, 所以解剖100大脑。
- 在每项实验中, 要在适当的发展阶段获得100只苍蝇, 如果选择对照平衡器 (这将因父母的基因型而异), 则使用100的十字交叉。如果苍蝇是纯合的等位基因/转基因的利益较少的十字架可以设置。
- 将解剖窗口限制为1小时, 以最大限度地提高细胞的健康水平, 并最大限度地减少对基因表达和基因组组织的非特定变化, 这些改变可以在大脑解剖后发生, 但这可以调整。确定在1小时内解剖100大脑所需的 dissectors 数量, 这取决于 dissectors 的技能。
2. 飞行工作
注: 苍蝇是上升25°c 与 ~ 50% 湿度, 除非另有说明。在女性的基因型之下被表明作为基因型 F, 并且那男性基因型 m。
-
扩大库存
- 获得100瓶幼蝇 (不超过一周) 与基因型 F 和 ~ 30 瓶基因型 m。
- 在星期四1周, 将100瓶基因型 F 翻转到新鲜食物中。从星期五开始, 每天将瓶子翻转到2周的星期二。这6翻转将被用来收集处女。并且在星期三星期 2, 翻转基因型 M 的飞行到新鲜的食物并且清除父母在2星期的星期五。这些瓶子将被用来收集男性的十字架。
-
收集处女
- 从星期一3周, 从基因型 F 小瓶收集处女。每天收集2-3 次, 并存储处女在18°c 与50% 的湿度。在4周的星期二, 每天重复此操作。强烈建议收集尽可能多的处女, 因为很多人死 之前, 十字架被设置。通常, 应该收集2500个处女来设置100个十字架。
-
设置交叉
- 在星期五4周, 设置所需的交叉数 (典型的100–200十字架每个实验) 与15个处女基因型 F 和7男性的基因型 M 为每个十字架。这是非常重要的是使用年轻和健康的男性与完整的翅膀。
- 从星期日到星期六5周, 每天翻转十字架。如果发现死苍蝇, 补充与新鲜的处女或男性的十字架。这是必不可少的, 以防止食品干燥, 所以水的瓶子需要。干食品将显著降低产量。
-
对资产管理分类的负控制
- 包括一个负控制项, 而不需要对所需的单元格进行标记以进行资产管理分类。理想情况下, 负控制应该有记者 (如无人驾驶的 GFP), 但不是驱动程序 (如GAL4), 以便记者的基本表达 (无人管理的结构可以 "漏水") 可以确定设置适当的门控分类。同时用实验苍蝇翻转苍蝇的负控制, 并以同样的方式进行。
-
分期蛹
- 在蛹发育的特定阶段收集细胞 (例如, 在蛹壳形成 [h APF] 后40小时), 在1小时的时间窗口中分期蛹, 以配合为解剖分配的 1 h 期 (上文讨论)。术后应直接进行细胞分离后, 在解剖后发生, 并采取40分钟。因此, 分期和解剖的确切时间由资产管制处的可用性决定。
- 要获得 40 h APF 的蛹, 在星期一6周的特定时间点 (例如下午5点) 解剖蛹40小时 (例如星期三上午9点)。使用湿画笔轻轻采摘白色的前蛹, 并把它们放在墙上预热瓶。只用理想的基因型选择蛹。
-
生物复制
- 为每个实验做至少3个生物复制。作为一个简单的方法, 重复实验三次在同一周 (6 周) 使用相同的十字架。例如, 第二和第三个阶段蛹分别在星期二和星期三复制。分别在星期四和星期五解剖这些蛹。
3. 样品准备
注: 本协议中使用的所有试剂均列于材料表中。
- 为解剖和组织离解准备解决方案
- 制备蛋白水解酶混合库存溶液 (见材料表) 通过重组冻干酶与 ddH2O 浓度 26 Wünsch 单位 (吴)/毫升。对于含有260吴 (大瓶) 的瓶子, 添加10毫升的 ddH2O 的瓶子, 并作出单一用途的整除数 (4.2 µL 是要求每离解)。库存解决方案在-20 摄氏度。每个实验都需要两个样本 (阴性对照和实验组织) 的分离。
- 准备 10x Rinaldini 的解决方案 (RS) 和完成施耐德的媒体 (CSM) 在解剖前一天 (星期一6周)。为每个刀准备5毫升的 csm, 约5毫升 1x RS 和5毫升的 csm, 用于解离2个样品 (负控制和实验)。存储 10x RS 在4摄氏度, 长达一个月, CSM 在4摄氏度, 长达一周。
- 要准备100毫升的 10x RS, 溶解8克氯化钠, 200 毫克氯化钾, 50 毫克的 NaH2PO4, 1 克的 NaHCO3和1毫升的葡萄糖在 100 ml 的 ddH 2 毫升烧杯。过滤器消毒0.22 毫米过滤器。
- 在微细中加入20毫克的 l-谷胱甘肽到1毫升的 ddH2O。
- 准备50毫升的 CSM, 添加5毫升的热灭活牛血清, 0.1 毫升10毫克/毫升胰岛素溶液, 5 毫升200毫米 l-谷氨酰胺溶液, 12.5 毫克/毫升 l-谷胱甘肽, 20 毫升青霉素-链霉素溶液 (1 单位青霉素和5000毫克链霉素/毫升) 到施耐德的媒体38.9 毫升。过滤器消毒0.22 毫米过滤器。
- 稀释 10x rs 与 ddH2O, 使 1x rs 工作解决方案。为每个样品准备 500 ul 1x RS 在非胶粘剂管内。
- 打开水浴, 将温度设置为摄氏37摄氏度。使用温度计确保温度准确。水浴必须在正确的温度之前, 木瓜蛋白酶激活。建议在早晨解剖前的傍晚设置温度。
- 制备木瓜蛋白酶和蛋白水解酶
注: 使木瓜蛋白酶溶液在每次分离前新鲜。- 在星期二6周左右开始解剖前45分钟, 从4°c 检索1瓶木瓜蛋白酶粉, 在室温下孵化。还在室温下将 CSM 放在离心管中, 随后加入木瓜粉。
- 分钟在解剖开始前使用注射器将室温 CSM 添加到木瓜蛋白酶瓶 (直接通过瓶盖), 使浓度为100单位/毫升 (每瓶中的粉末数量略有不同; 对于含有123个单元的瓶子, 添加1.23 米CSM 的 L)。要混合, 首先反转瓶子捕捉任何粉末卡在里面的帽子, 然后吸管向上和向下。
- 将瓶子添加到装有37°c 水的烧杯中。确保木瓜蛋白酶溶液的瓶子不漂浮。激活木瓜蛋白酶30分钟, 在37摄氏度。
- 在水浴中将木瓜蛋白酶添加到烧杯中后, 从-20 摄氏度中提取出蛋白水解酶 (26 整除/毫升), 并在室温下孵化。活化30分钟后, 在室温下孵化木瓜蛋白酶。
- 夹层
- 在星期二6周, 解剖蛹大脑在寒冷的 CSM 与清洁钳, 并切断视神经裂片通过捏在视神经和中枢大脑的交界处。
- 将裂片添加到含有 500 ul 1x RS 的微细 (一个微细用于实验组织, 一个用于负控制组织) 的底部。总是把管子放在冰上。
- 在1小时内解剖尽可能多的裂片。对于阴性的控制组织, 10 裂片是足够的。池解剖视神经裂片成一个单一的微细, 以消除组织丢失在转移之间管内。
- 细胞离解
- 用 P200 吸管小心地从微细上取出 1x RS, 留下足够的覆盖裂片。小心地添加 500 ul 的 1x RS 在管的一侧, 以便尽可能少地扰乱大脑。总是把管子放在冰上。
- 让裂片沉淀到底部。只需一次, 拿起 200 ul 和吸管, 以混合 (裂片应该移动)。让裂片再次安定。
- 对两个样品 (实验和阴性对照), 整除 600 ul 的活化室温木瓜蛋白酶成微细。将室温蛋白水解酶的 4.2 ul 添加到 600 ul 木瓜蛋白酶溶液中, 以获得最终浓度为0.18 的五毫升。吹打上下混合。这是离解解。
- 小心地删除每个样本的 1x RS, 并添加 300 ul 的离解溶液的裂片。在微细 thermomixer 中孵化样品25摄氏度, 1000 rpm 15 分钟。
- 在5和10分钟的时间点, 停止 thermomixer, 让裂片下沉到底部的微细。拿起 200 ul 的解决方案, 吸管出来混合。
- 15分钟后, 让裂片沉淀到底部, 小心地从裂片中取出离解液 (尽量不要扰乱裂片)。
- 用 1x RS 洗两次。要做到这一点, 小心添加 500 ul 1x RS (尽量不要打扰的裂片)。要混合, 轻轻吸管 200 ul, 然后吸管到微细。让裂片下沉到底部, 重复。
- 用 500 ul 的 CSM (与上一步相同) 清洗每样样品两次。
- 仔细删除 csm, 并添加 200 ul 的 csm 到管。使用 P200 吸管, 在不起泡的情况下吹打向上和向下扰乱组织, 直到溶液是均匀的 (即,不能再看到任何组织的残余物)。
- 过滤细胞悬浮通过一个30微米的网状盖成一个5毫升的在冰上的流式管 (使用 P200, 并确保整个悬浮通过)。再添加 500 ul 的 CSM, 以冲洗离解微细, 并将溶液过滤到流化管中。
- 小心地脱去了 P200 管的瓶盖, 在滤网过滤器下面收集解决方案, 并将其添加到外流管中的其余悬浮液中。样品已准备就绪。
- 一定要预先准备好管内, 以便收集到净化细胞。对于 rna 序列, 将每个样品中的细胞从 rna 纯化试剂盒中直接排列成含有 300 ul RLT 缓冲 (裂解缓冲器) 的管内 (在使用前添加 1:100 2-巯基乙醇)。
- 资产管制分类
注: 分离后, 立即对细胞进行分类 (1 小时最大)。在计划实验时, 一定要相应地订定这些课程。通常使用100微米喷嘴大小的单元格分拣机。- 比较阴性对照和实验样品中的细胞分布, 建立分选门。理想情况下, 在试点的外地实验中建立门控, 负控制样本将提供确认或微调的预先建立的门。感兴趣的细胞应该与负控制和实验样本中存在的背景细胞分离, (图 4) (在试验试验中试验)。
- 收集已准备好的收集管中的已排序单元格。
- RNA 纯化
- 在将细胞直接分类到 300 ul RLT 缓冲器后, 吸管向上和向下溶解细胞。
- 纯化 rna 遵循标准协议纯化的动物和人类细胞的总 RNA 使用净化试剂盒 (见材料表) 与专栏 DNA 消化7。洗脱 RNA 在 20 ul RNase 水。
- 用液氮冷冻 RNA 样品, 贮存在-80 摄氏度。
- 为每个实验执行至少3复制为控制和实验条件。同时为所有样品准备 cDNA 文库, 并在同一流动单元上运行所有样品以控制技术的变异性。一旦所有的 RNA 样品准备就绪, 使用一个速度 vac, 以减少体积 2–5 ul (每个样本)。
4. Smart-seq2 制备 cDNA 文库和测序
注意: 为了最大限度地减少技术的变异性, 请同时制作所有的 cDNA 库, 并在同一个流单元格上进行序列化。
- 使用 1.5 ul 的浓缩 RNA 的输入, 通过遵循 Smart-seq217的标准协议来制作 cDNA 库, 除了以下修改: 使用不同的高保真 pcr 主组合 (见材料表) pcr放大使用一列 pcr 纯化试剂盒 (见材料表) 代替磁性珠子提纯 pcr 产品。
- Smart-seq2 协议包括在反向转录后的 pcr 预扩步骤以及 tagmentation 后的最终浓缩 pcr 步骤。PCR 放大周期的数量取决于输入材料的丰度。以1000个细胞作为输入, 典型地使用15周期在 PCR 预放大的步和12周期为最后的浓缩 PCR 步。
- 在单个流单元格 (例如, NextSeq 平台) 上汇集库并对它们进行排序。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
一般方案
该协议的一般方案如图 1所示。该协议分为三大部分: 飞行工作, 样品准备, 测序和数据分析。"实验前的规划" 会议不包括在简单的一般方案中。
时间表
图 2显示了协议的主要部分 (飞行工作和样品准备) 的日历。
用共焦显微镜验证细胞特异标记
在一个典型的实验中, L3 叶片单神经元 (L3) 荧光标记。L3 神经元是五个同源的叶片神经元 (L1-L5) 之一, 接受广泛调谐的感光细胞 R1-R6 的输入, 并通过 synapsing 将信息传递到高中心的髓质神经元。在 MARCM 实验中, 单细胞 L3 克隆是由有丝分裂重组和荧光标记的两个标记, 马币 tdTOM (膜) 和 H2A-GFP (核)。表 1显示了十字架中使用的苍蝇的基因型。为了验证细胞特定的标签, 在感兴趣的发育阶段 (40 h APF) 解剖了理想基因型的飞脑。染色的表现如前所述7使用特定的抗体对 dsRed 和 GFP (图 3, 洋红和绿色), 以及24B10 抗体作为参考的叶片和髓质 neuropils (图 3, 蓝色)。共焦显微镜证实, L3 是唯一的细胞类型标记的 dsRed 和 GFP 在视神经叶。
利用资产管制仪分离低丰度细胞
图 4显示了一个具有代表性的外地资产分类结果。记录了10万事件。29.9% 的事件是潜在的汗衫, 其余的可能是碎片或骨料。双峰和不同大小的细胞, 然后根据粒度和大小被封闭。从其余的单个细胞 (FSC 汗衫, 27.3% 的所有事件), L3 神经元出现在 P1 (图 4, 标本, 洋红) 紧密集群, 这是很好地分离的背景细胞 (图 4, 标本, 蓝色)。P1 细胞的大小与同质细胞的数量相似。值得注意的是, P2 中的少数细胞 (图 4、标本、绿) 与 dsRed 和 GFP 的中间荧光强度分布在 P1 和背景的致密细胞群之间。这些细胞的身份还不清楚。由于 P2 细胞的大小不同于 P1 细胞, 这些细胞可能是非特异的。为了避免非特异细胞的潜在污染, 仅为实验收集了 P1 细胞。从10万事件, 获得了 45 P1 细胞。
图 1: 议定书的一般方案.该协议由三部分组成: 飞行工作、样品准备、测序和数据分析。指出了各部分的近似处理时间。各部分的主要步骤也显示在相应的盒装区域中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 飞行工作时间线和样品准备.该议定书大约需要6周时间。主要步骤的时间安排显示在日历中。解剖, 离解和 RNA 纯化是在同一天进行的操作, 并没有在日历中显示简单。三生物复制在同一个星期连续做与同样十字架。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 具有代表性的共焦显微图像, 显示荧光标记对所需细胞进行选择性标记.在 MARCM 实验中, 采用 H2A-GFP L3-specific 驱动 (9-9-GAL4)18, 用单 L3 叶片单神经元表达马币-tdTOM 和 GAL4。所需基因型的飞脑被解剖在40hr 有源性的 APF 和染色抗 dsRed, 抗 GFP 和24B10 抗体 (作为参考的叶片和髓质 neuropils)。用共焦显微镜对荧光标记进行了评价。L3 神经元出生于椎板和项目轴突, 在髓质 neuropil 内终止。在每个大脑中, L3 神经元的一个子集表达了两个荧光记者, 而这些是光叶中唯一表达标记的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 通过 L3 对单层神经元 MARCM 克隆进行纯化: 具有代表性的资产管制图.门 (例如P1) 是基于细胞粒度、大小和荧光强度来分离齐次单细胞的。在 P1 (洋红) 中, L3 神经元表达了类似于 tdTOM 和 H2A-GFP 的高含量。在 P2 (绿色) 中观察到一些具有中间荧光强度的细胞。它们的大小与 P1 中的 L3 神经元不同, 可以代表非特异细胞。这些未被收集。请单击此处查看此图的较大版本.
| 基因 | 源 |
| wTubP-GAL80, FRT40, 27G05-FLP::P est/CyO, Kr-GAL4, 无人操作-GFP;9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | 彭等, 2018 |
| wFRT40/CyO, Kr-GAL4, 无人-GFP;UAS-H2A-GFP/TM6B | 彭等, 2018 |
表 1: 交叉使用的苍蝇基因型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议简单, 在技术上很难执行, 但有几个关键步骤, 如果忽视将导致大量减少细胞产量。(步骤 2.3.2)。重要的是, 十字架是健康的, 食物不会干涸。定期浇水的交叉是最重要的, 以尽可能多的可用的解剖, 是正确的基因型和在正确的发展阶段。交叉需要浇水的频率取决于所使用的食物和苍蝇的居住条件。为了确保交叉不干燥, 每天检查两次瓶, 并相应添加水。(步骤3.3。同样重要的是, 把解剖的大脑分成一个单独的微细, 将用于离解, 而不是让每个刀使用自己的微细, 然后随后汇集样本。这将消除在管内之间转移失去的任何大脑, 这可能是相当可观的。(步骤 3.4.9)。当吹打, 以手动扰乱组织, 这是至关重要的, 直到没有任何残余的组织是肉眼可见的悬浮。不完整的组织中断将减少单细胞的数量, 可以通过外地行动的分类, 从而降低细胞的产量。
细胞产量的主要限制是启动材料。在这方面, 解剖是速率限制的几个原因: (1) 离解协议要求从头部解剖的视神经裂片和中央脑分离, (2) 在发育过程中获得精确的时间点组织时间用于解剖的窗口必须是有限的, (3) 解剖与外源性之间的时间间隔越长, 次细胞健康的几率越大, 对基因表达和基因组组织的非特异性影响越小 (即解剖越短期越好)。在最短的时间内, 应修改所花的解剖时间以获得所需的材料量。大多数故障诊断都是在先导实验中进行的。在这里, 重要的是: 优化基因标记的亮度和特异性 (图 3), 评估是否有兴趣的细胞的可再生的人口清楚地与背景细胞分开 (图 4), 确定需要解剖的大脑数量, 以便为后续应用程序获得足够的材料 (请参见步骤1。飞行工作), 并确定所需的最短时间来解剖适当数量的大脑。
该协议的主要进展是, 它允许有效地隔离低丰度细胞 transcriptomic 和基因组应用, 提高灵敏度大大超过我们以前的方法6。根据我们的估计, 在 RNA 序列分析中, 可以有效地分离出含有少于100细胞的荧光标记的种群。这使得 transcriptomic 和基因组分析应用于基因镶嵌实验, 其中特定类型细胞的子集在正常背景下被基因操纵。这是一个关键的进步, 因为这样的实验是必不可少的, 以确定细胞自主和非自主基因功能的复杂组织。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
这项研究是由国立卫生研究院的 NINDS 资助的, K01NS094545, andgrants 从神经退行性疾病研究 Lefler 中心。我们承认李明和杰森伊恩·麦克尤恩有价值的谈话。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
