Summary
Hier presenteren we een cel dissociatie protocol voor het efficiënt isoleren van cellen aanwezig bij lage overvloed binnen het visuele systeem van Drosophila door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS).
Abstract
Recente verbeteringen in de gevoeligheid van de volgende generatie sequencing hebben vergemakkelijkt de toepassing van transcriptomic en genomische analyses op kleine aantallen cellen. Met behulp van deze technologie om te bestuderen van ontwikkeling in het visuele systeem van Drosophila, dat beschikt over een schat aan cel type-specifieke genetische hulpmiddelen, biedt een krachtige aanpak voor het aanpakken van de moleculaire basis van ontwikkeling met precieze cellulaire resolutie. Voor een dergelijke aanpak niet haalbaar, is het van cruciaal belang dat de capaciteit voor het betrouwbaar en efficiënt zuiveren cellen aanwezig bij lage overvloed binnen de hersenen. Hier presenteren we een methode waarmee de efficiënte reiniging van eencellige klonen in genetische mozaïek experimenten. Met dit protocol consequent we een cellulaire lucratieve na zuivering met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS) (~ 25% van alle gelabelde cellen), en met succes uitgevoerd transcriptomics analyses op eencellige klonen gegenereerd via mozaïek analyse met een repressible cel marker (MARCM). Dit protocol is ideaal voor het toepassen van transcriptomic en genomische analyses op specifieke celtypes in het visuele systeem, in verschillende stadia van ontwikkeling en in het kader van verschillende genetische manipulaties.
Introduction
Het visuele systeem van Drosophila is een uitstekend model voor het bestuderen van de genetische basis van ontwikkeling en gedrag. Het omvat een stereotiepe het cellulaire platform1 en een geavanceerde genetische toolkit voor het manipuleren van specifieke cel typen2,3. Een belangrijke troef van dit systeem is de mogelijkheid om autonoom ondervragen genfunctie in celtypes van belang met eencellige resolutie, met behulp van genetische mozaïek methoden4,5. Wij willen deze genetische hulpmiddelen combineren met recente vooruitgang in volgende generatie rangschikken uit te voeren van cel type-specifieke transcriptomic en genomische analyses in één cel gekloond in genetische mozaïek experimenten.
Om dit te bereiken, is het essentieel een robuuste en efficiënte methode om selectief isoleren lage overvloedige cel populaties in de hersenen te ontwikkelen. Eerder, ontwikkelden we een protocol voor het isoleren van specifieke celtypes in het visuele systeem tijdens de ontwikkeling van de pop via FACS, en het vaststellen van hun transcriptomes met RNA-seq6. De overgrote meerderheid van de cellen van een bepaald type (bijvoorbeeld R7 researchdieren) waren in deze experimenten, fluorescently gelabeld. Met behulp van deze methode in genetische mozaïek experimenten, waarin slechts een subset van cellen van hetzelfde type worden aangeduid, verzuimd wij te isoleren voldoende cellen om kwaliteit rangschikken gegevens te verkrijgen. Om aan te pakken dit, willen wij de cellulaire opbrengst verhogen door het verbeteren van de cel dissociatie protocol.
Onze benadering was te verminderen van de totale lengte van het protocol bij het maximaliseren van de gezondheid van gedissocieerde cellen, verbetering van de cellulaire gezondheid door een wijziging van de dissectie en dissociatie buffers, en verminderen de hoeveelheid mechanische verstoring van het ontleed weefsel. We testten de verbeterde protocol7 mozaïek analyse met een repressible cel marker5 (MARCM), waarmee de generatie van single fluorescently label klonen van bepaalde celtypen, die wild type of mutant voor een gen van belang in een anders heterozygoot vliegen. Wanneer onder identieke omstandigheden, niet onze eerdere protocol genereren genoeg materiaal voor RNA-seq, was het verbeterde protocol succesvol. We reproducibly bereiken van een hoge cellulaire opbrengst (~ 25% van gelabelde cellen) en gegevens van de RNA-seq van hoge kwaliteit te verkrijgen van zo weinig als 1000 cellen7.
Een aantal protocollen zijn eerder beschreven om te isoleren van bepaalde celtypen in Drosophila6,-8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. deze protocollen zijn vooral bestemd voor het isoleren van cellen die overvloedig in de hersenen zijn. Ons protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van lage overvloedige cel populaties (minder dan 100 cellen per hersenen) in het visuele systeem met behulp van FACS voor latere transcriptomic en genomische analyses. Met dit protocol streven we naar een manier om reproducibly isoleren van lage overvloedige cellen uit het vliegen visuele systeem door FACS en het verkrijgen van hoge kwaliteit transcriptome gegevens door RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereidingen voordat het Experiment
-
Uitvoeren voordat u het experiment start, een kleinschalige pilot experiment om te bevestigen dat de genetica werken zoals verwacht om specifiek label de gewenste cellen.
- Als eerste pass, gebruik immunohistochemistry en om te bepalen of de lichte microscopie van worden ongewenste cellen aangeduid. In het ideale geval zullen genetische tellers specifieke binnen het netvlies en optic kwab (Figuur 3). Alleen optische kwabben worden gebruikt voor de cel dissociatie en dus in de centrale hersenen labeling is geen probleem. Op hetzelfde moment, moet u bepalen hoeveel cellen van belang worden aangeduid per hersenen.
- Als de genetische label(s) de gewenste specificiteit hebben, uitvoeren van een pilot FACS experiment (Figuur 4) om te bepalen of een zuivere bevolking van cellen kunnen worden reproducibly geïsoleerd en ook om te beoordelen hoeveel cellen van belang kan worden geïsoleerd van elke hersenen. Desgewenst beoordeling van de zuiverheid van geïsoleerde cellen door middel van kwantitatieve PCR te bepalen van de verrijking of de verrijking van specifieke genen.
-
Bepaal het aantal kruisjes die nodig zijn voor het verkrijgen van de gewenste hoeveelheid materiaal voor het experiment.
Opmerking: Gebaseerd op experimentele ervaring, ~ 17 – 25% van fluorescently geëtiketteerde cellen zijn consequent geïsoleerd met dit protocol, en kwalitatief hoogwaardige RNA-sequencing gegevens zijn verkregen uit zo weinig als 1000 FACS gezuiverd cellen (minder cellen wellicht voldoende zijn).- Voor het verkrijgen van 1000 cellen voor RNA-seq analyses, zorgen ervoor dat er ten minste 40 cellen van belang fluorescently label per hersenen (20 cellen per optic kwab). Ongeveer 10 ~ cellen van belang moeten worden gezuiverd per hersenen, ontleden dus 100 hersenen.
- Gebruiken voor het verkrijgen van ~ 100 vliegt in het passende stadium van ontwikkeling te ontleden in elk experiment, ~ 100 kruisen als selecteren tegen balancers (dit zal variëren afhankelijk van de genotypen van de ouders). Als vliegen homozygoot voor de allelen/transgenen van belang die minder kruisen kunnen worden ingesteld zijn.
- De dissectie venster beperken tot 1 h tot cellulaire gezondheid te maximaliseren en minimaliseren van niet-specifieke wijzigingen in genexpressie en organisatie van het genoom die optreden kan na hersenen worden ontleed, maar dit kan worden aangepast. Bepaal het aantal dissectors moeten ontleden 100 hersenen in 1 h, die afhankelijk van de vaardigheid van de dissectors.
2. werk vliegen
Opmerking: Vliegen zijn gerezen bij 25 ° C ~ 50% vochtigheid tenzij anders vermeld. Hieronder het genotype van de vrouwtjes is aangeduid als Genotype F, en die van mannetjes als Genotype M.
-
Groeiende voorraden
- ~ 100 flesjes van jonge vliegen (niet meer dan een week oud met Genotype F) en ~ 30 flesjes van Genotype M verkrijgen.
- Spiegelen op donderdag van Week 1, 100 flesjes van Genotype F op vers voedsel. Op vrijdag begint, spiegelen de flesjes per dag door middel van de dinsdag van Week 2. Deze 6 flips zal worden gebruikt voor het verzamelen van maagden. Ook op woensdag van Week 2, flip flies van Genotype M op vers voedsel en leeghalen van de ouders op vrijdag van Week 2. Deze flesjes zal worden gebruikt voor het verzamelen van mannen voor de kruisen.
-
Het verzamelen van maagden
- Van maandag van Week 3, maagden van het Genotype F flesjes te verzamelen. 2 - 3 keer per dag verzamelen en opslaan van de maagden bij 18 ° C ~ 50% vochtigheid. Herhaal dit elke dag via de dinsdag van Week 4. Het is sterk aanbevolen om het verzamelen van zoveel maagden mogelijk zijn, aangezien veel van hen sterven voordat de kruisen zijn ingesteld. Typisch, ~ 2.500 maagden moeten worden verzameld om in te stellen 100 kruist.
-
Instellen van kruisen
- Op vrijdag van Week 4, stelt u de gewenste aantallen kruisen (meestal 100 – 200 kruisjes per experiment) met 15 maagden van Genotype F en 7 mannen van Genotype M voor elk kruis. Het is zeer belangrijk voor jonge en gezonde mannen met intact vleugels gebruiken.
- Flip de kruizen die elke dag van zondag tot en met zaterdag van Week 5. De kruisen te vullen met verse maagden of mannetjes als dode vliegen zijn gevonden. Het is essentieel om te voorkomen dat het voedsel uitdrogen, dus de flesjes water indien nodig. Droog voedsel zal leiden tot aanzienlijke afname van de opbrengst.
-
Negatieve controle voor het sorteren van FACS
- Een negatieve controle opnemen zonder de gewenste cellen wordt geëtiketteerdt voor de FACS sorteren. Ideaal, de negatieve controle moet de verslaggever (bijvoorbeeld UAS-GFP) maar niet het stuurprogramma (bijvoorbeeld GAL4), zodat de basale expressie van de verslaggever (UAS-constructies kunnen worden "lekke") kan worden bepaald om te stellen passende gating voor het sorteren van de FACS. Draait u de vliegen voor de negatieve controle op hetzelfde moment met de experimentele vliegen en etappe hen op dezelfde manier.
-
Enscenering poppen
- Voor het verzamelen van cellen op een specifieke fase van de ontwikkeling van de pop (b.v. 40 uur na de puparium formatie [h APF]) stadium de poppen in het venster van de tijd van een 1 h te koppelen aan de periode van 1 uur gereserveerd voor ontledingen (hierboven besproken). FACS moet plaatsvinden direct na cel dissociatie, die optreedt na ontledingen en duurt ~ 40 min. Het exacte tijdstip van fasering en dissecties wordt dus bepaald door FACS beschikbaarheid.
- Voor het verkrijgen van poppen bij 40 h APF, etappe op maandag van Week 6 op een specifiek tijdstip (bijvoorbeeld 5 pm) om te ontleden poppen 40 h later (bijvoorbeeld 9 uur op woensdag). Gebruik een natte penseel zachtjes kiezen witte pre poppen en leg ze op de muur in voorverwarmde flesjes. Kies alleen de poppen met gewenste genotype.
-
Biologische replicatieonderzoeken
- Doen ten minste 3 biologische replicatieonderzoeken voor elk experiment. Als een eenvoudige manier, herhaal het experiment drie keer in de week (Week 6) met behulp van de dezelfde kruisen. Bijvoorbeeld, etappe poppen voor de tweede en derde wordt gerepliceerd op dinsdag en woensdag, respectievelijk. Ontleden van deze poppen op donderdag en vrijdag, respectievelijk.
3. de monstervoorbereiding
Opmerking: Alle van de in dit protocol gebruikte reagentia staan in de Tabel van materialen.
- Bereiden van oplossingen voor ontledingen en weefsel dissociatie
- Voorbereiden van de stockoplossing van de mix Proteolytische enzymen (Zie Tabel van materialen) door de krachten van het gelyofiliseerd enzym met ddH2O tot een concentratie van 26 Wünsch eenheden (Wu) / mL. Voor een flacon met 260 Wu (grote flacon), voeg 10 mL van ddH2O aan de flacon, en maken van de eenmalig gebruik aliquots (4.2 µL zijn verplicht per dissociatie). Stockoplossing van het winkel bij-20 ° C. Elk experiment vereist dissociatie van twee monsters (negatieve controle en experimentele weefsel).
- Bereiden 10 x Rinaldini de oplossing (RS) en Complete Schneiders Media (CSM) de dag vóór de dissectie (maandag van Week 6). Bereiden van 5 mL van CSM voor elke dissector en ongeveer 5 mL 1 x RS en 5 mL van CSM voor dissociatie van 2 monsters (negatieve controle en experimentele). Sla de 10 x RS bij 4 ° C voor maximaal een maand en CSM bij 4 ° C voor maximaal een week.
- Ter voorbereiding van 100 mL 10 x RS, Los 8 g NaCl, KCl, NaH2PO4, 1 g NaHCO3 en 1 g glucose in 100 mL ddH2O in een bekerglas van 250 mL 50 mg 200 mg. Filter steriliseren met een 0,22 mm filter.
- 20 mg L-Glutathione aan 1 mL voor ddH2O in een microtube toevoegen.
- Ter voorbereiding van 50 mL van CSM, voeg 5 mL van warmte geïnactiveerd runderserum 0,1 mL insuline-oplossing van 10 mg/mL, 5 mL 200 mM L-Glutamine oplossing, 12,5 μL van 20 mg/mL L-Glutathione, en 1 mL penicilline-streptomycine oplossing (5.000 eenheden van penicilline en streptomycine 5 mg / mL) aan 38,9 mL Schneiders media. Filter steriliseren met een 0,22 mm filter.
- Verdun 10 x RS met ddH2O om 1 x RS werkende oplossing. Het bereiden van 500 μL van 1 x RS in niet-klevende slangen voor elk monster.
- Zet een waterbad en selecteer de temperatuur bij 37 ° C. Zorg ervoor dat de temperatuur is nauwkeurig met behulp van een thermometer. Het waterbad moet op de juiste temperatuur vóór papaïne activering. Het is aanbevolen om de avond vóór een ochtend dissectie van de temperatuur instellen.
- Bereiden papaïne en Proteolytische enzymen mix
Opmerking: Zorg papaïne oplossing vers vóór elke dissociatie.- Op dinsdag van Week 6 ongeveer 45 min voordat de ontledingen halen 1 flacon papaïne poeder uit 4 ° C en bij kamertemperatuur incuberen. Ook gereserveerd CSM in een buis Eppendorf bij kamertemperatuur later toevoegen aan het papaïne poeder.
- min voor de aanvang van dissecties gebruiken een spuit de kamertemperatuur CSM toevoegen aan de flacon van papaïne (direct via het GLB), zodat de concentratie is 100 eenheden/mL (de hoeveelheid poeder in elk flesje is lichtjes verschillend; voor een flacon met 123 eenheden toevoegen 1.23 m L van CSM). Als u wilt mengen, eerst het omkeren van de ampul vast te leggen van alle poeder vast te zitten aan de binnenkant van het GLB en Pipetteer vervolgens omhoog en omlaag.
- De flacon toevoegen aan een bekerglas water van 37 ° C in het waterbad. Zorg ervoor dat het flesje van papaïne oplossing is niet zwevend. Activeren van de papaïne gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Na de papaïne toevoegt aan een bekerglas in het waterbad, een aliquoot gedeelte van het mengsel van Proteolytische enzymen (26 Wu/mL) ophalen-20 ° C en laat het bij kamertemperatuur inwerken. Na 30 min van activering, Incubeer de papaïne bij kamertemperatuur.
- Ontledingen
- Op dinsdag van Week 6, ontleden de gefaseerde pop hersenen in koude CSM met schone pincet en afgesneden van de optische kwabben door te knijpen op het kruispunt van de kwab van de optiek en de centrale hersenen.
- De lobben toevoegen aan de onderkant van een microtube met 500 μL van 1 x RS (één microtube voor de experimentele weefsel) en één voor de negatieve controle weefsel. Houd altijd de buizen op ijs.
- Ontleden zoveel lobben mogelijk in 1 h. Voor de negatieve controle weefsel zijn 10 lobben genoeg. Zwembad ontleed optische kwabben in een enkele microtube te elimineren weefsel verlies tijdens de overdracht tussen de slangen.
- Cel dissociatie
- Verwijder voorzichtig de 1 x RS uit de microtube met ontleed optische kwabben met behulp van een precisiepipet P200, verlaten genoeg ter dekking van de lobben. Voeg 500 μL van 1 x RS aan de kant van de buis, zodat de hersenen zo weinig mogelijk te verstoren. Houd altijd de buis op ijs.
- Laat die de lobben naar de bodem regelen. Slechts een keer, nemen 200 μl en Pipetteer uit te mengen (lobben moeten bewegen). Laat de lobben opnieuw regelen.
- Voor beide monsters (experimentele en negatieve controle), aliquoot 600 μL van geactiveerde kamertemperatuur papaïne in een microtube. 4.2 μL van kamertemperatuur Proteolytische enzymen mix in 600 μL papaïne oplossing voor het verkrijgen van een eindconcentratie van 0.18 Wu/mL toevoegen. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Dit is de dissociatie-oplossing.
- Verwijder de RS 1 x van elk monster voorzichtig en 300 μL van dissociatie oplossing toevoegen aan de lobben. Incubeer de monsters bij 25 ° C, 1000 rpm gedurende 15 min. in een microtube thermomixer.
- Stop het thermomixer en laat de lobben naar de bodem van de microtube zinken op de 5 en 10 min tijd punten. 200 μL van de oplossing en Pipetteer uit duren te mengen.
- Na 15 min, laat de lobben regelen naar beneden en verwijder voorzichtig de dissociatie-oplossing van de lobben (probeer niet te verstoren de lobben).
- Wassen tweemaal met 1 x RS. Om dit te doen, voeg voorzichtig 500 μL 1 x RS (probeer niet te verstoren de lobben). Te mengen, pipet zachtjes omhoog 200 μl, en vervolgens pipet uit in de microtube. Laat de lobben zinken naar de bodem en herhaal.
- Wassen van elk monster tweemaal met 500 μL van CSM (hetzelfde als de vorige stap).
- Zorgvuldig verwijderen van de CSM en voeg een andere 200 μL van CSM aan de buis. Met behulp van een precisiepipet P200, het verstoren van het weefsel door pipetteren omhoog en omlaag zonder schuim, totdat de oplossing is een homogeen (dat wil zeggen, neen meer kan zien eventuele restanten van weefsel).
- Filtreer de celsuspensie via een 30 μm mesh cap in een tube van 5 mL FACS op ijs (gebruik een P200 en zorg ervoor dat de gehele schorsing doorloopt). Voeg een andere 500 μL van CSM te spoelen de dissociatie microtube en filtreer de oplossing in de buis FACS.
- Zorgvuldig de dop van de tube FACS opstijgen, verzamelen de oplossing onder de mesh filter met een P200 en toe te voegen aan de rest van de suspensie in de buis FACS. De monsters zijn klaar voor FACS.
- Zorg ervoor dat u slangen voor het verzamelen van FACS gezuiverd cellen klaar op voorhand. Voor RNA-seq, sorteren cellen van elk monster rechtstreeks in slangen met 300 μL van RLT buffer (lysis-buffermengsel) uit de RNA zuivering kit (toevoegen 1:100 2-Mercaptoethanol vóór gebruik).
- FACS sorteren
Opmerking: Na dissociatie, sorteren onmiddellijk de cellen door FACS (1 h max). Zorg ervoor dat boek FACS sessies dienovereenkomstig bij de planning voor het experiment. Een cel sorter met 100 μm mondstuk grootte wordt meestal gebruikt.- Vergelijk de cel distributie in de negatieve controle en het experimentele monster instellen de gating voor het sorteren. In het ideale geval stellen de gating in de pilot FACS experiment zal, en de negatieve controlemonster bevestiging of fine tuning van de vooraf vastgestelde gating. De cellen van belang moeten goed worden gescheiden van de achtergrond-cellen die aanwezig in zowel de experimentele monster (Figuur 4) als de negatieve controle zijn (deze test in de proefprojecten).
- Het verzamelen van de gesorteerde cellen in de buizen bereid collectie.
- RNA zuivering
- Na het sorteren van de cellen rechtstreeks in 300 μL van RLT buffer, Pipetteer op en neer naar lyse de cellen.
- Zuiveren van RNA na het standaardprotocol van zuivering van totaal RNA van dierlijke en menselijke cellen met behulp van de reiniging kit (Zie Tabel van materialen) met aan-kolom DNA spijsvertering7. Elueer de RNA in 20 μL van RNase-gratis water.
- Bevriezen van de RNA-monsters met vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C.
- Voor elk experiment uitvoeren ten minste 3 replicatieonderzoeken voor controle en experimentele omstandigheden. De bibliotheken van cDNA voorbereiden op alle monsters op hetzelfde moment en draaien alle monsters op dezelfde stroom cel voor de bediening voor technische variabiliteit. Zodra alle RNA monsters zijn voorbereid, met een snelheid-vac kunt verkleinen van het volume tot 2-5 μl (elk monster).
4. voorbereiding van cDNA bibliotheken en het rangschikken door Smart-seq2
Opmerking: Om te minimaliseren technische variabiliteit, alle cDNA bibliotheken maken op hetzelfde moment, en hen op dezelfde stroom cel volgnummer.
- Gebruik van een ingang van 1,5 μL van geconcentreerde RNA cDNA bibliotheken maken door het volgen van het standaardprotocol voor Smart-seq217 , met uitzondering van de volgende wijzigingen: gebruik een verschillende HiFi-PCR master mix (Zie Tabel of Materials) voor PCR versterking; een zuivering van de PCR op kolommen gebruiken kit (Zie Tabel van materialen) in plaats van magnetische kralen voor het zuiveren van PCR producten.
- Het Smart-seq2-protocol bevat een PCR versterking van de pre-stap na omgekeerde transcriptie, alsmede een definitieve verrijking PCR stap na tagmentation. Het aantal cycli in de PCR versterking, is afhankelijk van de overvloed van het uitgangsmateriaal. Met 1000 cellen als input, gewoonlijk 15 cycli in de PCR versterking van de pre-stap en 12 cycli wordt gebruikt voor de definitieve verrijking PCR stap.
- Bundelen van de bibliotheken en volgorde van hen op een enkele stroom cel (bijvoorbeeld het NextSeq platform).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Algemene regeling
Een algemene regeling van het protocol is afgebeeld in Figuur 1. Het protocol is verdeeld in drie grote delen: vliegen werk, bereiding van de monsters, sequencing en data-analyse. De "Voorbereidingen voordat het experiment" sessie van het protocol is niet opgenomen in de algemene regeling voor eenvoud.
Tijdlijn
Een kalender van de belangrijke onderdelen van het protocol (Fly werk en bereiding van de monsters) is afgebeeld in Figuur 2.
Controleren of cel-specifieke etikettering door confocale microscopie
In een representatieve experiment, waren L3 lamina monopolaire neuronen (L3) fluorescently gelabeld. L3 neuron is een van de vijf homologe lamina neuronen (L1-L5) dat invoer van het in grote lijnen tuned researchdieren R1-R6 ontvangen en doorgeven van de informatie naar de hoge center door synapsing tot doel neuronen in de medulla. In een MARCM experiment, zijn eencellige L3 klonen gegenereerd door Mitotische recombinatie en fluorescently gelabeld door twee markeringen, myr-tdTOM (membraan) en H2A-GFP (nucleaire). De genotypen van vliegen in de kruisen gebruikt staan vermeld in tabel 1. Om te controleren of cel-specifieke etikettering, werden vliegen hersenen van het gewenste genotype ontleed bij het ontwikkelingsstadium van belang (40 h APF). Immunokleuring werd uitgevoerd als eerder beschreven7 met behulp van antilichamen specifiek tegen dsRed en GFP (Figuur 3, magenta en groen), evenals het antilichaam 24B10 als referentie voor de lamina en medulla neuropils (Figuur 3, blauw). Confocale microscopie bevestigd dat L3 het enige celtype geëtiketteerd door zowel de dsRed als de GFP in de optiek kwab is.
Isolatie van lage-overvloed cellen door FACS
Een vertegenwoordiger FACS sorteren resultaat wordt weergegeven in Figuur 4. 100.000 gebeurtenissen werden vastgelegd. 29,9% van alle gebeurtenissen zijn potentiële Onderhemden, en de rest zou puin of geaggregeerd. Paren en cellen met verschillende maten werden vervolgens omheinde uit op basis van granulatie en grootte. Van de resterende enkele cellen (FSC Onderhemden, 27,3% van alle gebeurtenissen), L3 neuronen verscheen als een strakke cluster in P1 (Figuur 4, monster, magenta), die was goed gescheiden van de achtergrond cellen (Figuur 4, model, blauw). De grootte van de cellen in P1 leek consistent met een homogene cellulaire bevolking. Met name werden een paar cellen in P2 (Figuur 4, monster, green) met tussenliggende fluorescentie intensiteit van dsRed en GFP verdeeld tussen de strakke cluster van cellen in de P1 en de achtergrond. De identiteit van deze cellen was niet duidelijk. Aangezien P2 cellen had een ander formaat dan de P1-cellen, waren deze cellen waarschijnlijk niet-specifieke. Potentiële om besmetting te voorkomen van de niet-specifieke cellen, werden alleen P1 cellen verzameld voor het experiment. 100.000 evenementen, zijn 45 P1 cellen verkregen.
Figuur 1: een algemene regeling van het protocol. Het protocol bestaat uit drie delen: vliegen werk, bereiding van de monsters, sequencing en data-analyse. De geschatte verwerkingstijd van elk deel wordt aangegeven. Belangrijke stappen voor elk onderdeel worden ook weergegeven in de bijbehorende vakken regio's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: tijdlijn voor vliegen werk en monstervoorbereiding. Het protocol duurt ongeveer 6 weken. Timing voor de hoofdstappen wordt weergegeven in de kalender. Dissectie, dissociatie RNA zuivering worden gedaan in dezelfde dag als de FACS sorteren en worden niet weergegeven in de kalender voor eenvoud. Drie biologische replicatieonderzoeken worden opeenvolgend gedaan in dezelfde week met de dezelfde kruisen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: een representatieve confocale microscopie afbeelding toont de selectieve etikettering van cellen door fluorescente markeringen gewenste. In MARCM experimenten, werden één L3 lamina monopolaire neuronen gemaakt om myr-tdTOM en H2A-GFP met behulp van een stuurprogramma (9-9-GAL4) specifieke L3-GAL418te drukken. Vliegen hersenen van het gewenste genotype werden ontleed bij 40hr APF en bevlekt met anti-dsRed, anti-GFP en 24B10 antilichamen (als een referentie voor de lamina en medulla neuropils). Fluorescerende labeling werd beoordeeld door confocale microscopie. L3 neuronen zijn geboren in de lamina en project axonen dat binnen de medulla neuropil beëindigen. Een subset van L3 neuronen uitgesproken beide TL verslaggevers in elke hersenen, en waren het alleen de cellen in de optiek kwab uiting geven aan de markeertekens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: enkel L3 lamina neuron MARCM via FACS klonen zuiveren: een representatieve FACS plot. Gates (bijvoorbeeld P1) werden gemaakt op basis van cel granulariteit, de grootte en fluorescentie intensiteit te isoleren van homogene afzonderlijke cellen. L3 neuronen uiten op dezelfde wijze hoge niveaus van myr-tdTOM en H2A-GFP werden verzameld uit in P1 (magenta). Een paar cellen met tussenliggende fluorescentie intensiteit worden waargenomen in P2 (groen). Deze zijn verschillend in grootte dan L3 neuronen in P1, en niet-specifieke cellen kon vertegenwoordigen. Deze werden niet verzameld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Genotype | Bron |
| w; GFP-TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | Peng et al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | Peng et al., 2018 |
Tabel 1: Genotypen van vliegen in de kruisen gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is eenvoudig en niet technisch moeilijk uit te voeren, maar er zijn verschillende sleutel stappen die als over het hoofd gezien zal leiden tot een aanzienlijke vermindering in cellulaire opbrengst. (Stap 2.3.2.) Het is cruciaal dat kruisen gezond zijn, en dat het voedsel droogt niet uit. Regelmatig water geven van kruisen is essentieel voor het maximaliseren van het aantal vliegen beschikbaar voor dissectie die van de juiste genotype en in de juiste fase van ontwikkeling zijn. Hoe vaak kruisjes moeten worden gedrenkt zal variëren afhankelijk van het voedsel gebruikt en de woonomstandigheden van de vliegen. Om ervoor te zorgen het kruisen niet uitdrogen, onderzoeken de flesjes tweemaal per dag en voeg water dienovereenkomstig. (Stap 3.3.) Het is ook belangrijk voor het bundelen van ontleed hersenen in een enkele microtube die zal worden gebruikt voor de dissociatie, in tegenstelling tot elke dissector gebruiken hun eigen microtube gelet en dan vervolgens de bundeling van de monsters. Dit zal elimineren alle hersenen verloren van de overdracht tussen de slangen, die zeer aanzienlijk kan zijn. (Stap 3.4.9.) Wanneer pipetteren omhoog en omlaag om handmatig verstoren weefsel, is het essentieel om dit te doen, zolang geen restanten van het weefsel niet zichtbaar met het blote oog in de opschorting zijn. Verstoring van de onvolledige weefsel vermindert het aantal afzonderlijke cellen die kunnen worden gesorteerd via FACS, en dus het verminderen van cellulaire opbrengst.
De belangrijkste beperking van cellulaire opbrengst is grondstof. In dit verband zijn de ontledingen snelheidsbeperking om verschillende redenen: (1) het protocol dissociatie vereist optische kwabben worden ontleed uit het hoofd en gescheiden van de centrale hersenen, (2) te verkrijgen van weefsel op nauwkeurige tijd-punten tijdens de ontwikkeling van de tijd venster voor ontledingen moet worden beperkt, (3) hoe langer de duur tussen ontledingen en FACS, hoe groter de kans op suboptimaal cell gezondheid en niet-specifieke gevolgen voor genexpressie en genomische organisatie (dat wil zeggen, hoe korter de dissectie periode hoe beter). De ontrafeling van de tijd moet worden gewijzigd om te verkrijgen van de gewenste hoeveelheid materiaal in de minimale hoeveelheid tijd. Allermeest naar de methode voor troubleshooting wordt uitgevoerd in de pilot experimenten. Hier is het cruciaal voor: optimaliseren genetische labelen voor helderheid en specificiteit (Figuur 3), beoordelen of een reproduceerbare bevolking van cellen van belang zijn duidelijk gescheiden van de achtergrond cellen op de FACS percelen (Figuur 4), bepalen de aantal hersenen die worden ontleed om te verkrijgen van een voldoende hoeveelheid materiaal voor latere aanvragen moeten (zie stap 1. Vliegen werk), en de minimale hoeveelheid benodigde tijd voor het ontleden van het juiste aantal hersenen bepalen.
De grote opmars van dit protocol is dat het toelaat efficiënte isolatie van lage overvloedige cellen voor transcriptomic en genomische toepassingen, verbetering van de gevoeligheid aanzienlijk over onze vorige methode6. Op basis van onze ramingen, kunnen fluorescently geëtiketteerde populaties bestaande uit minder dan 100 cellen per optic lobe worden efficiënt geïsoleerd voor RNA-seq analyses. Hierdoor transcriptomic en genomische analyses moeten worden toegepast in genetische mozaïek experimenten, waarin de deelverzamelingen van cellen van bepaalde typen worden genetisch gemanipuleerd in een anders normale achtergrond. Dit vertegenwoordigt een kritieke stap vooruit, als zodanig experimenten zijn van essentieel belang voor het bepalen van de cel autonome en niet-zelfstandige gene functies in complexe weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de NINDS van de National Institutes of Health award onder nummer K01NS094545, andgrants van de Lefler centrum voor de studie van neurodegeneratieve aandoeningen. Wij erkennen bekalking Tan en Jason McEwan voor waardevolle gesprekken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
