Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה תא לבידוד ביעילות תאים נוכח שפע נמוך בתוך מערכת הראייה דרוזופילה דרך התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS).
Abstract
השיפורים האחרונים בהרגישות של רצף הדור הבא יש הקלה היישום של transcriptomic וניתוחים גנומית למספר קטן של תאים. ניצול הטכנולוגיה הזאת ללמוד פיתוח במערכת דרוזופילה חזותי, ובו שפע של כלים גנטיים ייחודיים לסוג התא, מספקת גישה רב-עוצמה למיעון הבסיס המולקולרי של פיתוח עם רזולוציה הסלולר מדויק. עבור גישה כזו להיות ריאלי, זה הכרחי יש את היכולת לשלוט בצורה אמינה ויעילה לטהר תאים נוכח שפע נמוך בתוך המוח. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת טיהור יעיל של תא בודד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי. עם פרוטוקול זה, נוכל להגיע באופן עקבי הסלולר תשואה גבוהה לאחר טיהור באמצעות קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) (% ~ 25 תאים עם תוויות כל), בהצלחה ביצע ניתוחים transcriptomics על שיבוטים תא בודד שנוצר דרך ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM). פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור החלת transcriptomic וניתוחים גנומית לסוגי תאים מסוים ב מערכת הראייה, מעבר בשלבים שונים של פיתוח, בהקשר של שינויים גנטיים שונים.
Introduction
מערכת הראייה דרוזופילה הוא מודל מצטיינים ללמוד את הבסיס הגנטי של התפתחות והתנהגות. זה מורכב של אדריכלות הסלולר הסטראוטיפי1 ערכת כלים גנטיים מתקדמים מניפולציות תא ספציפי סוגים2,3. כוח מרכזי של מערכת זו היא היכולת לחקור באופן עצמאי את ג'ין פונקציה סוגי תאים עניין עם רזולוציה תא בודד, באמצעות פסיפס גנטי שיטות4,5. חיפשנו לשלב כלים גנטיים אלה עם התפתחויות אחרונות רצף הדור הבא כדי לבצע transcriptomic ייחודיים לסוג התא, ניתוח גנומי בתא יחיד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי.
כדי לעשות זאת, זה חיוני לפתח שיטה חזקה ויעילה לבודד באופן סלקטיבי תא בשפע נמוך אוכלוסיות במוח. בעבר, פיתחנו פרוטוקול עבור בידוד סוגי תאים ספציפיים ב מערכת הראייה במהלך הפיתוח הגולמי דרך FACS, וקביעת transcriptomes שלהם באמצעות ה-RNA-seq6. בניסויים אלה, הרוב המכריע של תאים מסוג מסוים (למשל photoreceptors R7) הודבקו תוויות fluorescently. באמצעות שיטה זו, בניסויים פסיפס גנטי, שבה מסומנים רק ערכת משנה של תאים מאותו סוג, נכשלנו לבודד מספיק תאים כדי להשיג איכות רצף הנתונים. כדי לטפל בבעיה זו, חיפשנו להגברת התאית על ידי שיפור בפרוטוקול דיסוציאציה התא.
הגישה שלנו היתה להקטין את האורך הכולל של פרוטוקול כדי למקסם את הבריאות של תאים הפומבית, לשפר את הבריאות התאית על ידי שינוי מאגרי לנתיחה, דיסוציאציה, להפחית את כמות הפרעה מכנית הרקמה גזור. . בדקנו את פרוטוקול משופרת7 באמצעות ניתוח פסיפס עם תא repressible סמן5 (MARCM), אשר מאפשר לדור של בודדת fluorescently המסומנות שיבוטים של סוגי לתא מסוים, פראי סוג או מוטציה עבור הגן עניין ב אחרת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים לטוס. שם, בתנאים זהים, פרוטוקול קודמות שלנו נכשל לייצר מספיק חומר RNA-seq, פרוטוקול משופרת היה מוצלח. אנו reproducibly להשיג תשואה גבוהה הסלולר (% ~ 25 תאים עם תוויות), להשיג נתונים RNA-seq באיכות גבוהה של תאים קטנה כמו 1,0007.
מספר פרוטוקולים שתוארו קודם לכן כדי לבודד סוגי לתא מסוים דרוזופילה6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. פרוטוקולים אלה נועדו בעיקר עבור בידוד תאים שנמצאים בשפע בתוך המוח. פרוטוקול שלנו ממוטבת עבור בידוד אוכלוסיות תאים בשפע נמוך (פחות מ- 100 תאי המוח) ב מערכת הראייה באמצעות FACS עבור transcriptomic הבאים וניתוחים גנומית. עם פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק דרך reproducibly בידוד תאי שופע נמוכה של מערכת הראייה לעוף על ידי FACS וקבלת נתונים transcriptome באיכות גבוהה על ידי RNA-תת סעיף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכנון לפני הניסוי
-
לפני תחילת הניסוי, לבצע ניסוי הפיילוט בקנה מידה קטן כדי לאשר אם הגנטיקה פועלים כצפוי במיוחד לסמן את התאים הרצויים.
- לעבור תחילה, השתמש אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ אור כדי לקבוע אם מסומנות תאים לא רצויים. באופן אידיאלי, גנטיים יהיו ספציפיות בתוך הרשתית הראייה האונה (איור 3). רק אונות אופטיים משמשים תא דיסוציאציה, תיוג אז במוח המרכזית אינה מהווה בעיה. במקביל, לקבוע כמה תאים עניין מסומנות לפי המוח.
- אם תוויות גנטי יש יחודיות הרצוי, לבצע ניסוי FACS פיילוט (איור 4) כדי לקבוע אם אוכלוסיית תאים ניתן לבודד reproducibly, גם כדי להעריך כמה תאים עניין ניתן לבודד כל מהמוח. אם יש צורך, להעריך את הטוהר של תאים בודדים באמצעות PCR כמותי כדי לקבוע את העשרת או דה-העשרה של גנים ספציפיים.
-
לקבוע את מספר צלבים צריכה להשיג את הכמות הרצויה של חומר עבור הניסוי.
הערה: בהתבסס על ניסיון ניסיוני, ~ 17 – 25% של תאים fluorescently עם תוויות באופן עקבי מבודד עם פרוטוקול זה הינם באיכות גבוהה RNA-רצף נתונים מתקבלים מן כמה כתאי FACS מטוהרים 1,000 (פחות תאים עשוי להיות מספיק).- כדי לקבל 1,000 תאים עבור ניתוחים RNA-seq, ודא כי ישנם תאים לפחות 40 עניין fluorescently תווית לכל המוח (20 תאים לכל האונה אופטיים). בסביבות 10 ~ תאים עניין מומלץ לטהר לכל המוח, לנתח אז המוח 100.
- כדי להשיג זבובים ~ 100 בשלב המתאים של פיתוח לנתח ניסוי, השתמש צלבים ~ 100 אם בחירת נגד כוחות מאזנים (זה ישתנה בהתאם אחרים של ההורים). אם זבובי homozygous עבור אללים/transgenes של עניין ניתן להגדיר צלבים פחות.
- להגביל את החלון לנתיחה h 1 כדי למקסם את הסלולר הבריאות ולצמצם את שינויים שאינם ספציפיים ביטוי גנים, ארגון הגנום יכול להתרחש לאחר המוח הם גזור, אבל זה יכול להיות מותאם. לקבוע את מספר dissectors נדרש לנתח מוחות 100 ב- h 1, אשר תלוי במיומנות של dissectors.
2. לטוס לעבוד
הערה: זבובים מגודלים 25 ° c עם לחות ~ 50% אלא אם נכתב אחרת. להלן גנוטיפ של נקבות מסומן בתור גנוטיפ F, וכי של זכרים גנוטיפ מ'.
-
הרחבת מניות
- להשיג ~ 100 צלוחיות של זבובים צעירים (לא יותר מאשר בשבוע הישן עם גנוטיפ F) ~ 30 בקבוקונים של גנוטיפ מ'.
- ביום חמישי של השבוע 1, להעיף 100 צלוחיות של גנוטיפ F על מזון טרי. החל ביום שישי, להעיף את הבקבוקונים בכל יום ביום שני של השבוע 2. אלה סלטות 6 ישמש כדי לאסוף את בתולות. גם ביום רביעי השבוע 2, להעיף זבובים של גנוטיפ מ' על מזון טרי, לנקות את ההורים ביום שישי 2 בשבוע. את שתי המבחנות ישמש כדי לאסוף את הזכרים על הצלבים.
-
איסוף בתולות
- מיום שני השבוע 3, לאסוף בתולות הבקבוקונים גנוטיפ F. 2 - 3 פעמים ביום לאסוף ולאחסן הבתולות-18 ° C ~ 50% לחות. חזור על פעולה זו בכל יום דרך יום שלישי בשבוע 4. מומלץ לאסוף בתולות רבים ככל האפשר, כיוון שרבים מהם למות לפני חוצה מוגדרים. בדרך כלל, ~ 2,500 בתולות צריך להיות שנאספו כדי להגדיר 100 חוצה.
-
הגדרת צלבים
- ביום שישי בשבוע 4, להגדיר המספרים הרצויים צלבים (בדרך כלל 200-100 צלבים לכל ניסוי) עם בתולות 15 של גנוטיפ F וזכרים 7 של גנוטיפ M עבור כל צלב. חשוב מאוד להשתמש זכרים צעירים ובריאים עם כנפיים ללא פגע.
- הפוך חוצה כל יום מיום ראשון עד יום שבת בשבוע 5. תוספת חוצה עם בתולות טריים או זכרים אם נמצאו זבובים מתים. זה חיוני כדי למנוע את האוכל מתייבשת, אז מים הבקבוקונים כנדרש. מזון יבש יקטן באופן משמעותי את התשואה.
-
בקרה שלילית FACS למיון
- לכלול פקד שלילי ללא התאים הרצויים להיותו שכותרתו FACS למיון. באופן אידיאלי, הפקד שלילי צריך הכתב (למשל UAS-GFP) אבל לא הנהג (למשל GAL4), כך ביטוי הבזליים של הכתב (UAS-בונה יכולה להיות "דולף") יכול להיקבע לקביעת מתאימה gating FACS למיון. הפוך את הזבובים עבור הפקד שלילי בו זמנית עם הזבובים ניסיוני, שלב אותם באותו אופן.
-
הגלמים הזמני
- כדי לאסוף תאים בשלב מסוים של התפתחות הגולמי (למשל h 40 לאחר היווצרות puparium [h APF]), הבמה הגלמים בחלון הזמן 1 h כדי להתאים עם תקופת 1 h המוקצב והניתוחים (שנדונו לעיל). FACS צריכה להתבצע ישירות לאחר תא דיסוציאציה, אשר מתרחשת לאחר ניתוח ולוקח ~ 40 דקות. לכן, הזמן המדויק של היערכות, והניתוחים נקבעת לפי זמינות FACS.
- כדי להשיג הגלמים ב 40 h APF, שלב ביום שני של השבוע 6 בנקודת זמן מסוימת (למשל, 5 pm) לנתח הגלמים 40 h מאוחר יותר (למשל, 9 בבוקר ביום רביעי). להשתמש במברשת רטובה בעדינות לבחור לבן הגלמים קדם ולמקם אותם על הקיר, בקבוקונים ומחוממת מראש. רק לבחור את הגלמים עם גנוטיפ הרצוי.
-
משכפל ביולוגי
- האם משכפל ביולוגית לפחות 3 עבור ניסוי. כדרך פשוטה, חזור על הניסוי שלוש פעמים באותו השבוע (שבוע 6) באמצעות חוצה אותו. לדוגמה, שלב הגלמים עבור השני והשלישי משכפל בימים שלישי ורביעי, בהתאמה. לנתח את הגלמים האלה בימים חמישי ושישי, בהתאמה.
3. הכנת הדוגמא
הערה: כל ריאגנטים בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה של חומרים.
- להתכונן פתרונות והניתוחים, רקמות דיסוציאציה
- להכין את האנזים הפרוטאוליטי תערובת הפתרון מניות (ראה טבלה של חומרים) על ידי לשחזר את האנזים lyophilized עם ddH2O לריכוז של Wünsch 26 יחידות (Wu) / mL. בשביל בקבוקון המכיל 260 וו (בקבוקון גדולים), להוסיף 10 מ של ddH2O למבחנה ובצע את aliquots חד-פעמיים (4.2 µL נדרשים לכל דיסוציאציה). פתרון מלאי החנות ב-20 ° C. ניסוי מחייב דיסוציאציה של שני מדגמים (שליטה שלילי ורקמות ניסויית).
- הכינו 10 x של Rinaldini פתרון (RS) ולא מדיה (CSM של שניידר מלאה) יום לפני הקרע (שני של שבוע 6). להכין 5 מיליליטר CSM עבור כל בניתוח ולאחר כ- 5 מ ל 1 x ר' ו- 5 מיליליטר CSM על דיסוציאציה של דגימות 2 (שלילית שליטה וניסויים). אחסן את ר' 10 x-4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש, ואת CSM ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע.
- כדי להכין 100 מ של 10 x ר', להמיס 8 גרם של NaCl, 200 מ ג אשלגן כלורי, 50 מ"ג של2PO NaH4, 1 g של NaHCO3 ו 1 גר' גלוקוז ב- 100 מ של ddH2O גביע 250 מ. מסנן לחטא עם מסנן 0.22 מ מ.
- הוסף 20 מ ג L-גלוטתיון 1 מ"ל של ddH2O microtube.
- כדי להכין 50 מ של CSM, הוסף 5 מ של חום להשבית סרום שור, 0.1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל אינסולין פתרון, 5 מ ל-200 מ מגלוטמין פתרון, μL 12.5 של 20 מ"ג/מ"ל L-גלוטתיון, 1 מ"ל של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 יחידות של פניצילין, 5 מ"ג של סטרפטומיצין / mL) מ ל 38.9 של המדיה של שניידר. מסנן לחטא עם מסנן 0.22 מ מ.
- לדלל עם ddH2O לעשות 1 x ר' הפתרון עובד 10 x ר'. להכין μL 500 של ר' x 1 ללא דבק microtubes עבור כל דגימה.
- הפעל באמבט מים ולהגדיר את הטמפרטורה ב 37 º C. ודא כי הטמפרטורה היא מדויקת באמצעות מד חום. לאמבט מים חייב להיות בטמפרטורה הנכונה לפני הפעלת פפאין. מומלץ לקבוע את הטמפרטורה ערב קודם ניתוח בוקר.
- הכינו פפאין ואת האנזים הפרוטאוליטי להתמזג
הערה: ודא פפאין פתרון טריים לפני כל דיסוציאציה.- ביום שלישי של שבוע 6 בערך 45 דקות לפני שמתחילים את והניתוחים, לאחזר את מבחנה 1 של אבקת פפאין מ- 4 ° C, דגירה בטמפרטורת החדר. גם להפריש CSM בצינור גלאים בטמפרטורת החדר מאוחר יותר להוסיף האבקה פפאין.
- דקות לפני תחילת יחליט להשתמש מזרק כדי להוסיף את טמפרטורת החדר CSM בקבוקון פפאין (ישירות דרך הכיפה) כך הריכוז הוא 100 יחידות/mL (כמות האבקה ב כל בקבוקון שונה במקצת; בשביל בקבוקון המכיל 123 יחידות להוסיף 1.23 מ' L של CSM). לערבב, תחילה להפוך את הצנצנת כדי ללכוד אבקה תקוע בצד הפנימי של הכיפה ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה.
- הוסף את המבחנה גביע המכילה 37 מעלות צלזיוס המים באמבט מים. ודא שבקבוקון פפאין פתרון לא צף. להפעיל את פפאין למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר הוספת פפאין את גביע באמבט מים, לאחזר aliquot מתערובת האנזים הפרוטאוליטי (26 וו/mL) מ-20 ° C, דגירה זה בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות של הפעלת, דגירה של פפאין בטמפרטורת החדר.
- ניתוח
- ביום שלישי בשבוע 6, לנתח את המוח הגולמי בשלבים תוך קר CSM עם מלקחיים נקי ולנתק את האונות הראייה על ידי צובט בצומת של האונה הראייה והמוח המרכזית.
- הוסף האונות לתחתית microtube המכילה 500 μL של ר' x 1 (אחד microtube של הרקמה ניסיוני) ואחד עבור הרקמה שליטה שלילי. שמור תמיד את הצינורות על קרח.
- לנתח אונות רבים ככל האפשר 1 h. הרקמה שליטה שלילי, הם מספיק 10 אונות. בריכת ביתר אופטיים אונות microtube יחיד כדי למנוע איבוד רקמות במהלך העברה בין microtubes.
- דיסוציאציה תא
- הסר בזהירות את ר' 1 x מ microtube עם ביתור אונות הראייה באמצעות פיפטה P200, משאיר מספיק כדי לכסות את האונות. להוסיף בזהירות 500 μL של 1 x ר' לצד של הרכבת התחתית, כדי להפריע את המוח כמה שפחות. שמור תמיד את הצינורית על קרח.
- תן האונות ליישב את העניין. רק פעם אחת, לקחת את 200 μL, פיפטה החוצה כדי לערבב (אונות תנוע). תן האונות ליישב שוב.
- עבור שני מדגמים (בקרה ניסויית ושליליים), aliquot 600 μL של הפעלת בטמפרטורת החדר פפאין לתוך microtube. הוסף μL 4.2 מתערובת האנזים הפרוטאוליטי בטמפרטורת החדר בתוך תמיסת פפאין μL 600 בריכוז הסופי של וו 0.18/mL. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. זהו הפתרון דיסוציאציה.
- בזהירות להסיר את ר' 1 x כל מדגם ולהוסיף 300 μL של דיסוציאציה פתרון האונות. דגירה בדגימות 25 ° c, 1,000 סל ד למשך 15 דקות thermomixer microtube.
- 5 ו- 10 דקות זמן נקודות, להפסיק את thermomixer ולתת האונות לשקוע לתחתית microtube. לקחת את μL 200 של פתרון, pipet החוצה כדי לערבב.
- לאחר 15 דקות, תן האונות ליישב את העניין, הסר בזהירות את הפתרון דיסוציאציה בין האונות (try שלא להפריע האונות).
- לשטוף פעמיים עם 1 x ר'. כדי לעשות זאת, בזהירות להוסיף 500 μL 1 x ר' (try שלא להפריע האונות). כדי לערבב בעדינות pipet למעלה 200 μL, pipet ואז לצאת אל microtube. תן האונות שקעו וחזור.
- לשטוף כל מדגם פעמיים עם 500 μL של CSM (כמו בשלב הקודם).
- בזהירות להסיר את CSM ולהוסיף עוד 200 μL של CSM ברכבת התחתית. באמצעות פיפטה P200, לשבש את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה בלי קצף, עד הפתרון הוא הומוגני (קרי, אין עוד באפשרותך לראות כל שרידים של רקמות).
- לסנן התליה תא באמצעות כובע רשת 30 μm לתוך צינור 5 מ"ל FACS על קרח (תשתמש P200, ותוודא המתלה כולו עובר). להוסיף עוד 500 μL של CSM לשטוף את microtube דיסוציאציה, לסנן את הפתרון לתוך הצינור FACS.
- בזהירות. תוריד את הכובע של הצינור FACS, לאסוף את הפתרון מתחת מסנן רשת עם P200 והוסף אותו לשאר חלקי המתלה בצינור FACS. הדגימות מוכנים FACS.
- ודאו שיש לכם microtubes לאיסוף תאים FACS מטוהרים מוכן מראש. עבור ה-RNA-seq, למיין תאים כל מדגם ישירות לתוך microtubes המכיל 300 μL מאגר RLT (פירוק מאגר) מתוך ערכת טיהור RNA (להוסיף בטחונות 2–Mercaptoethanol לפני השימוש).
- FACS מיון
הערה: לאחר דיסוציאציה, למיין מיד את התאים על ידי FACS (מקסימום 1h). ודא ספר FACS להפעלות בהתאם בעת תכנון לניסוי. סדרן התא עם גודל החרירים של 100 μm משמשת בדרך כלל.- להשוות את התפלגות התא הפקד שלילי, המדגם ניסיוני כדי להגדיר את gating עבור המיון. באופן אידיאלי, לבסס את דרך השער פיילוט FACS, המדגם שליטה שלילי יספקו אישור או כוונון עדין של gating הוקמה מראש. התאים עניין להפרידם היטב את התאים הרקע הקיימים הפקד שלילי והן המדגם ניסיוני (איור 4) (זה מבחן בניסויים פיילוט).
- איסוף התאים מיון הצינורות אוסף מוכן.
- RNA טיהור
- לאחר מיון התאים ישירות לתוך μL 300 RLT מאגר, pipet למעלה ולמטה כדי lyse התאים.
- לטהר RNA בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי של טיהור של RNA הכולל מן החי, תאים אנושיים באמצעות הטיהור קיט (ראה טבלה של חומרים) עם עיכול הדנ א-טור7. Elute את הרנ א ב μL 20 RNase ללא מים.
- להקפיא את הדגימות RNA עם חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
- עבור ניסוי לבצע משכפל לפחות 3 עבור פקד ותנאים ניסיוני. להתכונן ספריות cDNA של כל הדגימות במקביל ולהפעיל כל הדגימות באותו התא זרימה כדי לשלוט על השתנות טכני. לאחר כל הדגימות RNA מוכנים להשתמש vac מהירות כדי להקטין את עוצמת הקול כדי μL 2-5 (כל דגימה).
4. הכנת cDNA ספריות וסדר על ידי חכמים-seq2
הערה: כדי למזער את השתנות טכני, להפוך את כל ספריות cDNA באותו זמן, אותן ברצף על זרימה באותו התא.
- השתמש קלט של 1.5 μL של RNA מרוכז כדי להפוך ספריות cDNA לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עבור החכם-seq217 למעט השינויים הבאים: שימוש מאסטר אחר של ה-PCR אמינות גבוהה לערבב (ראה טבלה של חומרים) עבור ה-PCR הגברה; השתמש של טיהור PCR על עמודות קיט (ראה טבלה של חומרים) במקום beads מגנטי לטהר את מוצרי ה-PCR.
- פרוטוקול חכם-seq2 כולל שלב קדם הגברה PCR לאחר שעתוק במהופך, כמו גם צעד PCR העשרה הסופי לאחר tagmentation. מספר מחזורים ב- PCR הגברה תלוי השפע של חומר קלט. עם תאי 1,000 כקלט, משתמשים בדרך כלל 15 מחזורים בשלב קדם הגברה PCR ו- 12 מחזורים עבור השלב ה-PCR העשרה הסופי.
- מאגר של הספריות, אותן ברצף על תא בודד זרימה (למשל, פלטפורמת NextSeq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה כללית
ערכה הכללית של הפרוטוקול מוצג באיור1. הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים מרכזיים: לטוס בעבודה, הכנת הדוגמא, רצף של ניתוח נתונים. הפעלת "תכנון לפני הניסוי" של הפרוטוקול אינו כולל את הערכה כללית של פשטות.
ציר הזמן
לוח שנה של החלקים העיקריים של הפרוטוקול (עבודה לעוף, הכנת הדוגמא) מוצג באיור2.
אימות ספציפיות תא תיוג על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית
בניסוי נציג, L3 פרופריה monopolar נוירונים (L3) הודבקו תוויות fluorescently. נוירון L3 הוא אחד חמש פרופריה הומולוגי הנוירונים (L1-L5) המקבלים קלט photoreceptors מכוון בהרחבה R1-R6 ומעבירות את המידע למרכז גבוהה על-ידי synapsing את הנוירונים היעד של לשד. בניסוי MARCM, תא בודד L3 שיבוטים שנוצר על ידי mitotic רקומבינציה, fluorescently המסומנות על ידי שני סמנים, myr-tdTOM (ממברנה) H2A-GFP (גרעינית). אחרים של זבובים משמש חוצה מוצגים בטבלה 1. כדי לוודא labelling תאים ספציפיים, לטוס השכל. גנוטיפ הרצוי היו גזור בשלב התפתחותי של הריבית (40 h APF). Immunostaining בוצע כפי שתואר לעיל7 באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד dsRed GFP (איור 3, מגנטה וירוק), כמו גם נוגדן 24B10 כהפניה על הנדן ואת לשד neuropils (איור 3, כחול). מיקרוסקופיה קונפוקלית אישר כי L3 הוא הסוג התא היחיד גם את dsRed וגם את ה-GFP בפורטוגלית האונה אופטיים.
בידוד התאים נמוך-שפע על ידי FACS
FACS נציג מיון תוצאה מוצג באיור4. אירועים 100,000 נרשמו. 29.9% כל האירועים הן פוטנציאל ללבישה, השאר יכול להיות פסולת או אגרגטים. Doublets והתאים עם גדלים שונים היו מגודרת אז את צפיפות הרשת על בסיס וגודל. מתאי הנותרים יחיד (FSC ללבישה, 27.3% של כל האירועים), L3 נוירונים הופיע בעמוד השדרה ב- P1 (איור 4, הדגימה, מגנטה), אשר היה מופרדים היטב את התאים רקע (איור 4, הדגימה, כחול). גודל התאים P1 היה דומה בקנה אחד עם אוכלוסיה הומוגנית הסלולר. ראוי לציין, כמה תאים ב- P2 (איור 4, הדגימה, ירוק) עם פלורסצנטיות ביניים האינטנסיביות של dsRed ו- GFP הופצו בין האשכול חזק של תאים ב- P1 ואת הרקע. זהותו של תאים אלה לא היה ברור. מאז P2 תאים בגודל שונה מאשר התאים P1, תאים אלה היו עלולים להיות לא ספציפית. כדי למנוע זיהום פוטנציאליים את התאים שאינם ספציפיים, רק P1 תאים נאספו לניסוי. מ- 100,000 אירועים, תאים P1 45 מתקבלים.
איור 1: ערכה הכללית של הפרוטוקול. הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים: לטוס בעבודה, הכנת הדוגמא, רצף של ניתוח נתונים. הזמן המשוער של כל חלק מסומן. שלבים עיקריים של כל חלק מוצגים גם באזורים מסגרת המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ציר זמן עבור הכנת הדוגמא ועבודה לעוף. הפרוטוקול לוקח כ- 6 שבועות. התזמון של הצעדים העיקריים מוצג בלוח השנה. דיסקציה, דיסוציאציה, טיהור RNA מתבצעת באותו יום המיון FACS, אינם מוצגים בלוח השנה עבור פשטות. משכפל ביולוגי שלוש מתבצעת ברצף באותו השבוע עם חוצה אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תמונת הנציגה מיקרוסקופיה קונפוקלית מציג תיוג סלקטיבי של תאים חושק סמני פלורסנט. בניסויים MARCM, הנוירונים monopolar פרופריה L3 יחיד היו עשויים לבטא myr-tdTOM H2A-GFP באמצעות הנהג (9-9-GAL4) ספציפיים L3 GAL418. לטוס השכל. גנוטיפ הרצוי היו גזור במהירות 40 APF, מוכתם נוגדנים anti-dsRed, אנטי-GFP, 24B10 (כייחוס עבור neuropils פרופריה ואת לשד). תיוג פלורסנט הוערכה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. נוירונים L3 נרקמות פרופריה ופרוייקט אקסונים זה לסיים בתוך מורכב לשד. במוח כל, תת-קבוצה של נוירונים L3 בא לידי ביטוי בשני כתבים פלורסנט והם היו התאים רק באונה אופטיים לבטא את הסמנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: טיהור יחיד נוירון פרופריה L3 MARCM שיבוטים ויה FACS: מגרש FACS נציג. גייטס (למשל P1) נוצרו בהתבסס על עוצמת צפיפות, בגודל פלורסצנטיות תא בידוד תאי יחידה הומוגנית. נוירונים L3 לבטא רמות גבוהות באופן דומה של myr-tdTOM H2A-GFP נאספו מ ב- P1 (מגנטה). כמה תאים עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית ביניים הם נצפו P2 (ירוק). אלה הן בגודל שונה L3 נוירונים ב- P1, שעשוי לייצג תאים שאינם ספציפיים. אלה לא נאספו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| גן # מושגים בסיסיים | מקור |
| וואט; TubP-GAL80, FRT40, 27G-לה-ארגון 05-FLP::PEST/הקתולים הצעירים, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | פנג. et al., 2018 |
| וואט; FRT40/ארגון הקתולים הצעירים, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | פנג. et al., 2018 |
טבלה 1: אחרים של זבובים משמש חוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוא פשוט לא טכנית קשה לביצוע, אבל יש מפתח מספר צעדים זה אם מתעלמים מהם רצון לגרום לירידה ניכרת התשואה הסלולר. (שלב 2.3.2.) זה הכרחי כי צלבים הם בריאים, כי האוכל לא יתייבש. השקיה של צלבים חיוני כדי למקסם את מספר זבובים זמין עבור ניתוח של גנוטיפ נכון את, בשלב הנכון של פיתוח. באיזו תדירות צלבים צורך להיות להשקות ישתנו בהתאם האוכל ותנאי הדיור של הזבובים. כדי להבטיח צלבים לא להתייבש, לבחון את הבקבוקונים פעמיים ביום ומוסיפים מים בהתאם. (שלב 3.3.) חשוב גם אספנו את המוח ביתור לתוך microtube יחיד שישמש עבור הדיסוציאציה, בניגוד נתקל כל בניתוח להשתמש microtube שלהם ואיגום ואז לאחר מכן את הדגימות. זה יבטל את כל המוח איבד מן העברת בין microtubes, אשר יכול להיות ניכר. (שלב 3.4.9.) כאשר pipetting למעלה ולמטה לשבש באופן ידני רקמות, חיוני עד אין שרידי הרקמות גלויים לפי העין ההשעיה. הפרעה רקמות לא שלם יקטין את מספר תאים בודדים ניתן למיין ויה FACS, ובכך להקטין את התשואה הסלולר.
המגבלה העיקרית של התשואה הסלולר מתחילה חומר. בהקשר זה, ניתוח הם שער הגבלת מכמה סיבות: (1) פרוטוקול דיסוציאציה דורש אופטיים אונות גזור מהראש, הופרדו המוח המרכזי, (2) כדי לקבל את רקמות זמן מדויק-נקודות במהלך הפיתוח הפעם חלון עבור ניתוח חייב להיות מוגבל, (3) ככל-פרק הזמן בין והניתוחים FACS, גובר הסיכוי שיוצרת תא בריאות ואפקטים שאינם ספציפיים על ביטוי גנים וארגון גנומית (קרי, קצרה יותר את הקרע תקופה יותר). לנתח הזמן המושקע צריך להיות שונה כדי לקבל את הכמות הרצויה של חומר סכום מינימלי של זמן. רוב פתרון הבעיות מבוצע בניסויים פיילוט. כאן זה הכרחי: מיטוב גנטי תיוג עבור בהירות וספציפיות (איור 3), להעריך אם אוכלוסיה לשחזור של תאים עניין מובדלים בבירור מן הרקע בתאים FACS חלקות (איור 4), לקבוע מספר של המוח צריך להיות גזור להשגת כמות מספקת של חומר עבור יישומים עוקבות (ראו שלב 1. לעוף עבודה), ולקבוע את כמות מינימלית של הזמן הדרוש כדי לנתח את המספרים המתאימים של המוח.
מראש העיקריים של פרוטוקול זה הוא שזה מאפשר בידוד יעיל של תאים בשפע נמוך transcriptomic ויישומים גנומית, שיפור רגישות ניכרת מעל שלנו בשיטה הקודמת6. בהתבסס על אומדנים שלנו, שכותרתו fluorescently אוכלוסיות הכוללת פחות מ-100 תאים לכל האונה אופטיים ניתן לבודד ביעילות עבור ניתוחים RNA-seq. זה מאפשר transcriptomic וניתוחים גנומית שתחול בניסויים פסיפס גנטי, שבה קבוצות משנה של תאים של סוגים מסוימים הם מניפולציה גנטית ברקע רגילה אחרת. זה מייצג ניתן לקבל מקדמה של קריטיים, גם ניסויים כאלה חיוני לקביעת תא פונקציות גנים אוטונומיים, שאינם אוטונומית ברקמות מורכבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי NINDS של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס K01NS094545, andgrants מן המרכז לפלר עבור המחקר של הפרעות ניווניות. אנו להכיר לימינג טאן ו ג'ייסון מקיואן לשיחות יקרי ערך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
