Summary
Qui, presentiamo un protocollo di dissociazione delle cellule per isolare in modo efficiente le cellule presenti in abbondanza bassa all'interno del sistema visivo di Drosophila attraverso celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS).
Abstract
Recenti miglioramenti nella sensibilità di sequenziamento di nuova generazione hanno facilitato l'applicazione di analisi genomiche e trascrittomica ad un piccolo numero di cellule. Utilizzando questa tecnologia per lo studio di sviluppo nel sistema visivo della drosofila, che vanta una ricchezza di strumenti genetici specifici del tipo di cella, fornisce un approccio potente per affrontare le basi molecolari di sviluppo con precisa risoluzione cellulare. Un siffatto approccio essere fattibile, è fondamentale avere la capacità di attendibilmente ed efficientemente purificare cellule presenti in abbondanza bassa all'interno del cervello. Qui, presentiamo un metodo che permette di purificazione efficiente di singola cellula Clona in esperimenti di mosaico genetico. Con questo protocollo, realizziamo costantemente un alto rendimento cellulare dopo purificazione mediante fluorescenza attivato cella ordinamento (FACS) (~ 25% di tutte le celle con etichettate) ed eseguito con successo analisi trascrittomica su singola cellula cloni generati attraverso analisi di mosaico con un indicatore di cella reprensibile (MARCM). Questo protocollo è ideale per l'applicazione di analisi genomiche e trascrittomica di tipi cellulari specifici nel sistema visivo, attraverso diverse fasi di sviluppo e nel contesto delle diverse manipolazioni genetiche.
Introduction
Il sistema visivo di Drosophila è un eccezionale modello per studiare la base genetica dello sviluppo e comportamento. Si compone di un' architettura cellulare stereotipato1 e un toolkit di genetico avanzato per la manipolazione delle cellule specifiche tipi2,3. Un punto di forza di questo sistema è la capacità di interrogare in modo autonomo la funzione del gene in tipi cellulari di interesse con risoluzione singola cella, utilizzando metodi mosaico genetico4,5. Abbiamo cercato di combinare questi strumenti genetici con gli avanzamenti recenti nel sequenziamento di nuova generazione per eseguire cella specifica del tipo trascrittomica e analisi genomica nella singola cella cloni in esperimenti di mosaico genetico.
A tale scopo, è essenziale sviluppare una tecnica robusta ed efficiente per isolare selettivamente popolazioni bassa abbondante delle cellule nel cervello. In precedenza, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare tipi cellulari specifici nel sistema visivo durante lo sviluppo Pupa mediante FACS e determinare la loro trascrittomi utilizzando RNA-seq6. In questi esperimenti, la stragrande maggioranza delle cellule di un tipo particolare (ad es. R7 fotorecettori) fluorescente sono stata etichettata. Utilizzando questo metodo, negli esperimenti di mosaico genetico, in cui sono etichettati solo un sottoinsieme delle cellule dello stesso tipo, non siamo riusciti a isolare abbastanza cellule per ottenere dati di sequenziamento di qualità. Per risolvere questo problema, abbiamo cercato di aumentare il rendimento cellulare migliorando il protocollo di dissociazione delle cellule.
Il nostro approccio era quello di diminuire la lunghezza totale del protocollo per massimizzare la salute delle cellule dissociate, migliorare la salute cellulare alterando la dissezione e la dissociazione di buffer e ridurre la quantità di rottura meccanica al tessuto dissecato. Abbiamo testato il protocollo migliore7 usando analisi di mosaico con una cella reprensibile indicatore5 (MARCM), che permette la generazione di singolo fluorescente etichettati cloni particolari tipi di cellule, che sono wild-type o mutanti per un gene di interesse in un in caso contrario eterozigote fly. Dove, in condizioni identiche, il nostro protocollo precedente non è riuscito a generare abbastanza materiale per RNA-seq, il protocollo migliore era successo. Abbiamo riproducibile raggiungere un alto rendimento cellulare (~ 25% delle cellule con etichettate) e ottenere alta qualità RNA-seq dati da appena 1.000 cellule7.
Un numero di protocolli precedentemente è stati descritti per isolare particolare cellula scrive dentro drosofila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. questi protocolli sono progettati principalmente per isolare le cellule che sono abbondanti all'interno del cervello. Il nostro protocollo è ottimizzato per isolare popolazioni di cellule abbondanti basso (meno di 100 cellule per cervello) nel sistema visivo utilizzando FACS per analisi genomiche e trascrittomica successiva. Con questo protocollo, ci proponiamo di fornire un modo per isolare riproducibile basse abbondanti cellule dal sistema visivo Vola FACS e ottenendo dati del trascrittoma di alta qualità di RNA-seq.
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Protocol
1. pianificazione prima dell'esperimento
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Prima di iniziare l'esperimento, eseguire un esperimento pilota su piccola scala per confermare se la genetica funziona come previsto per etichettare in modo specifico le cellule desiderate.
- Come primo passaggio, uso immunoistochimica e microscopia per determinare se le cellule indesiderate vengono etichettate. In teoria, marcatori genetici saranno specifici all'interno della retina e del lobo ottico (Figura 3). Solo i lobi ottici sono utilizzati per dissociazione delle cellule e così etichettatura nel cervello centrale non è un problema. Allo stesso tempo, determinare quante celle di interesse sono etichettate al cervello.
- Se le etichette genetiche hanno la specificità desiderata, eseguire un esperimento pilota di FACS (Figura 4) per determinare se una popolazione pura di cellule possono essere isolate in modo riproducibile, e anche per valutare quante celle di interesse possono essere isolate da ogni cervello. Se necessario, valutare la purezza delle cellule isolate mediante PCR quantitativa per determinare l'arricchimento o-arricchimento dei geni specifici.
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Determinare il numero di croci necessaria ad ottenere la quantità desiderata di materiale per l'esperimento.
Nota: Basato su esperienza sperimentale, ~ 17 – 25% delle cellule fluorescente contrassegnati sono costantemente isolato con questo protocollo, e dati di sequenziamento di RNA di alta qualità sono ottenuti da poco più di 1.000 cellule di FACS purificato (meno cellule possono essere sufficiente).- Per ottenere 1.000 cellule per analisi di RNA-seq, assicurarsi che ci siano almeno 40 celle di interesse fluorescente etichettati al cervello (20 celle per lobo ottico). Circa ~ 10 celle di interesse dovrebbero essere purificate al cervello, quindi sezionare 100 cervelloni.
- Per ottenere ~ 100 mosche nella fase appropriata del sviluppo di sezionare in ogni esperimento, utilizzare ~ 100 croci se selezionando contro bilanciatori (varia a seconda i genotipi dei genitori). Se le mosche sono omozigoti per alleli/transgeni di interesse possono essere impostati un minor numero di croci.
- Limitare la finestra di dissezione per 1 h per massimizzare la salute cellulare e ridurre al minimo i cambiamenti non specifici di espressione genica e l'organizzazione del genoma che possa verificarsi dopo cervelli vengono sezionati, ma questo può essere regolata. Determinare il numero di dissettori per sezionare 100 cervelloni in 1 h, che dipende dalla abilità dei dissettore necessaria.
2. Vola lavoro
Nota: Mosche vengono generati a 25 ° C con umidità di ~ 50% se non diversamente specificato. Sotto il genotipo delle femmine è indicato come genotipo F e quella dei maschi come genotipo M.
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Espansione delle scorte
- Ottenere ~ 100 fiale di giovani mosche (non più di un settimana vecchio con genotipo F) e ~ 30 fiale di genotipo M.
- Il giovedì della settimana 1, flip 100 fiale di genotipo F sul cibo fresco. A partire dal venerdì, capovolgere i flaconi ogni giorno attraverso il martedì della settimana 2. Questi 6 salti mortali utilizzerà per raccogliere vergini. Anche il mercoledì della settimana 2, mosche di genotipo M sul cibo fresco di vibrazione e cancellare i genitori il venerdì della settimana 2. Queste fiale utilizzerà per raccogliere i maschi per le croci.
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Raccolta di vergini
- Da lunedì della settimana 3, raccogliere vergini dai flaconcini di genotipo F. 2 - 3 volte al giorno di raccogliere e memorizzare le vergini a 18 ° C con ~ 50% di umidità. Ripetere questa operazione ogni giorno attraverso il martedì della settimana 4. Si consiglia vivamente di raccogliere come molti vergini come possibile, poiché molti di loro muoiono prima le croci sono impostate. In genere, ~ 2.500 vergini devono essere raccolti per impostare 100 croci.
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L'impostazione di croci
- Il venerdì della settimana 4, impostare i numeri desiderati delle Croci (in genere 100 – 200 croci ogni esperimento) con 15 vergini del genotipo F e 7 maschi di genotipo M per ciascuna croce. È molto importante utilizzare i maschi giovani e sani con le ali intatte.
- Capovolgere le croci ogni giorno dalla domenica al sabato della settimana 5. Completare le croci con freschi vergini o maschi se sono trovati mosche morte. È essenziale per evitare il cibo si secchi, quindi l'acqua le fiale come necessario. Cibo secco diminuirà notevolmente il rendimento.
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Controllo negativo per l'ordinamento di FACS
- Includere un controllo negativo senza le cellule desiderate essere etichettate per l'ordinamento di FACS. Idealmente, il controllo negativo dovrebbe avere il reporter (ad es. UAS-GFP) ma non il driver (ad esempio GAL4), in modo che l'espressione basale del reporter (UAS-costrutti possono essere "colanti") può essere determinato per impostare appropriato gating per lo smistamento di FACS. Capovolgere le mosche per il controllo negativo allo stesso tempo con le mosche sperimentale e loro in scena nello stesso modo.
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Pupe di stadiazione
- Raccogliere le cellule in una fase specifica di sviluppo pupa (ad es. 40 h dopo la formazione del pupario [h APF]), fase le pupe in una finestra di tempo di 1 h da abbinare con il periodo di 1h assegnato per le dissezioni (discusse in precedenza). FACS deve essere eseguita direttamente dopo dissociazione delle cellule, che si verifica dopo le dissezioni e prende ~ 40 min. Così, il tempo esatto di staging e dissezioni è determinato dalla disponibilità di FACS.
- Per ottenere pupe a 40 h APF, tappa il lunedì della settimana 6 ore un momento specifico (ad es., 17) dissezionare pupe 40 ore più tardi (per esempio, 9 il mercoledì). Utilizzare un pennello bagnato per delicatamente scegliere bianchi pre-pupe e metterli sulla parete in fiale pre-riscaldati. Scegliere solo le pupe con genotipo desiderato.
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Replicati biologici
- Fare almeno 3 replicati biologici per ogni esperimento. Come un modo semplice, ripetere l'esperimento tre volte nella stessa settimana (settimana 6) utilizzando le stesse croci. Ad esempio, Stadio pupe per la seconda e la terza replica il martedì e il mercoledì, rispettivamente. Sezionare queste pupe il giovedì e il venerdì, rispettivamente.
3. preparazione del campione
Nota: Tutti i reattivi utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.
- Preparare le soluzioni per dissezioni e dissociazione del tessuto
- Preparare la soluzione di riserva miscela di enzimi proteolitici (Vedi Tabella materiali) mediante ricostituzione dell'enzima liofilizzato con ddH2O a una concentrazione di 26 unità Wünsch (Wu) / mL. Per un flaconcino contenente 260 Wu (grande flaconcino), aggiungere 10 mL di ddH2O al flaconcino e rendere aliquote monouso (4,2 µ l sono necessari per dissociazione). Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C. Ogni esperimento richiede la dissociazione di due campioni (controllo negativo e tessuti sperimentali).
- Preparare 10 x soluzione (RS di Rinaldini) e completa di Schneider Media (CSM) il giorno prima la dissezione (lunedì della settimana 6). Preparare 5 mL del CSM per ogni dissettore e circa 5 mL di 1x RS e 5 mL di CSM per dissociazione di 2 campioni (controllo negativo e sperimentale). Memorizzare il 10 x RS a 4 ° C per un massimo di un mese e CSM a 4 ° C per fino ad una settimana.
- Per preparare 100 mL di 10 x RS, sciogliere 8 g di NaCl, 200 mg di KCl, 50 mg di NaH2PO4, 1 g di NaHCO3 e 1 g di glucosio in 100 mL di ddH2O in un becher da 250 mL. Filtro sterilizzare con un filtro di 0,22 mm.
- Aggiungere 1 mL di ddH2O in una microprovetta 20 mg di L-glutatione.
- Per preparare 50 mL di CSM, aggiungere 5 mL di calore inattivato siero bovino, 0,1 mL di soluzione di insulina di 10 mg/mL, 5 mL di 200 mM soluzione di L-Glutammina, 12,5 μL di 20 mg/mL L-glutatione e 1 mL di soluzione di penicillina-streptomicina (5.000 unità di penicillina e 5 mg di streptomicina / mL) a 38,9 mL di media di Schneider. Filtro sterilizzare con un filtro di 0,22 mm.
- Diluire 10 x RS con ddH2O per rendere 1 x RS lavoro soluzione. Preparare 500 μL di 1 x RS in microprovette non adesivo per ogni campione.
- Girare su un bagno di acqua e impostare la temperatura a 37 ° C. Assicurarsi che la temperatura sia accurata utilizzando un termometro. Bagno d'acqua deve essere alla giusta temperatura prima dell'attivazione di papaina. Si consiglia di impostare la temperatura la sera prima una dissezione di mattina.
- Preparare la papaina e degli enzimi proteolitici si fondono
Nota: Assicurarsi che soluzione papaina fresco prima di ogni dissociazione.- Il martedì della settimana 6 circa 45 min prima di iniziare le dissezioni, recuperare 1 flaconcino di polvere di papaina da 4 ° C ed incubare a temperatura ambiente. Anche accantonare CSM in una provetta Eppendorf a temperatura ambiente per poi aggiungere la polvere di papaina.
- min prima dell'inizio delle dissezioni utilizzare una siringa per aggiungere la temperatura della camera CSM al flaconcino di papaina (direttamente attraverso il tappo), in modo che la concentrazione è di 100 unità/mL (la quantità di polvere in ogni flaconcino è leggermente diversa; per una fiala contenente 123 unità aggiungere 1,23 m L del CSM). Per mescolare, prima di capovolgere il flaconcino per catturare qualsiasi polvere bloccato all'interno della PAC e quindi dispensare su e giù.
- Aggiungere il flaconcino in un becher contenente acqua di 37 ° C nel bagno d'acqua. Accertarsi che la fiala di soluzione di papaina non galleggi. Attivare la papaina per 30 min a 37 ° C.
- Dopo aver aggiunto la papaina in un recipiente a bagnomaria, recuperare un'aliquota della miscela di enzimi proteolitici (26 Wu/mL) da-20 ° C ed incubare a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti di attivazione, incubare la papaina a temperatura ambiente.
- Dissezioni
- Il martedì della settimana 6, sezionare i cervelli in fasi pupal in CSM freddo con il forcipe pulito e tagliato i lobi ottici pizzicando all'incrocio tra il lobo ottico e il cervello centrale.
- Aggiungere i lobi verso il basso di una microprovetta contenente 500 μL di 1 x RS (una microprovetta per il tessuto sperimentale) e uno per il tessuto di controllo negativo. Tenere sempre i tubi sul ghiaccio.
- Sezionare come molti lobi possibile in 1 h. Per il tessuto di controllo negativo, 10 lobi sono sufficienti. Piscina dissecato ottica lobi in una microprovetta singola per eliminare perdita del tessuto durante il trasferimento tra microprovette.
- Dissociazione delle cellule
- Rimuovere attentamente il 1 x RS nella microprovetta con dissecati lobi ottica utilizzando una pipetta P200, lasciando sufficiente a coprire i lobi. Aggiungere con cautela 500 μL di 1x RS al lato del tubo, in modo da disturbare il cervello il meno possibile. Tenere sempre il tubo sul ghiaccio.
- Lasciate che i lobi si depositano sul fondo. Solo una volta, prendere 200 μL e pipettare fuori per mescolare (lobi dovrebbero muoversi). Lasciare i lobi stabilirsi nuovamente.
- Per i due campioni (controllo sperimentale e negativi), aliquotare 600 μL di papaina temperatura ambiente attivato in una microprovetta. Aggiungere 4,2 μL di miscela di enzimi proteolitici di temperatura ambiente in 600 µ l di soluzione di papaina per ottenere una concentrazione finale di 0.18 Wu/mL. Mescolare pipettando su e giù. Questa è la soluzione di dissociazione.
- Rimuovere il 1 x RS da ciascun campione delicatamente e aggiungere 300 μL di soluzione di dissociazione ai lobi. Incubare i campioni a 25 ° C, 1000 giri/min per 15 min in una microprovetta thermomixer.
- Presso i punti di tempo min 5 e 10, interrompere il thermomixer e lasciare che i lobi affondano sul fondo della provetta. Richiedere fino 200 μL di soluzione e dispensare fuori a mescolare.
- Dopo 15 min, lasciare che i lobi depositano alla parte inferiore e rimuovere con attenzione la soluzione di dissociazione dai lobi (cercare di non disturbare i lobi).
- Lavare due volte con 1 x RS. Per effettuare questa operazione, aggiungere cautamente 500 μL 1 x RS (cercare di non disturbare i lobi). Mix, delicatamente dispensare fino 200 μL e quindi dispensare nella provetta. Lasciate che i lobi sul fondo e ripetere.
- Lavare ogni campione due volte con 500 μL di CSM (stesso passaggio precedente).
- Rimuovere il CSM delicatamente e aggiungere un altro 200 μL di CSM al tubo. Utilizzando una pipetta P200, distruggere il tessuto pipettando su e giù senza formazione di schiuma, fino a quando la soluzione è omogenea (cioè, non possono vedere eventuali residui di tessuto).
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un berretto di maglia 30 μm in una provetta da 5 mL FACS su ghiaccio (utilizzare un P200 e assicurarsi che attraversa l'intera sospensione). Aggiungere un altro 500 μL di CSM per risciacquare i conetti di dissociazione e filtrare la soluzione nella provetta FACS.
- Con attenzione togliere il tappo del tubo FACS, raccogliere la soluzione sotto il filtro a maglia con un P200 e aggiungerlo al resto della sospensione nel tubo FACS. I campioni sono pronti per FACS.
- Essere sicuri di avere microprovette per la raccolta di cellule di FACS purificato pronto in anticipo. Per RNA-seq, ordinare celle da ciascun campione direttamente in microprovette contenenti 300 μL di tampone di RLT (tampone di lisi) dal kit di purificazione RNA (aggiungere 1: 100 2–mercaptoetanolo prima dell'uso).
- Ordinamento di FACS
Nota: Dopo dissociazione, ordinare immediatamente le cellule di FACS (max 1 h). Assicurarsi che prenotare sessioni di FACS conseguenza durante la pianificazione per l'esperimento. Un sorter delle cellule con 100 μm ugello viene in genere utilizzato.- Confrontare la distribuzione delle cellule nel controllo negativo e il campione sperimentale per impostare il gating per l'ordinamento. Idealmente, stabilire il gating nell'esperimento pilota di FACS, e il campione di controllo negativo fornirà conferma o messa a punto della gating pre-stabilito. Le celle di interesse dovrebbero essere ben separate dalle cellule sfondo che sono presenti sia il controllo negativo e il campione sperimentale (Figura 4) (verificare questo negli esperimenti pilota).
- Raccogliere le cellule ordinate nei tubi preparati insieme.
- Purificazione di RNA
- Dopo l'ordinamento delle celle direttamente in 300 μL di tampone di RLT, dispensare su e giù per lisare le cellule.
- Purificare il RNA seguendo il protocollo standard di purificazione di RNA totale da utilizzando la purificazione di cellule umane e animali kit (Vedi Tabella materiali) con di digestione del DNA in colonna7. Eluire il RNA in 20 μL di acqua RNAsi-libera.
- Congelare i campioni di RNA con azoto liquido e conservare a-80 ° C.
- Per ogni esperimento eseguire almeno 3 ripetizioni per condizioni sperimentali e di controllo. Preparare le librerie di cDNA per tutti i campioni allo stesso tempo ed eseguire tutti gli esempi sulla stessa cella di flusso per il controllo tecnico variabilità. Una volta che tutti i campioni di RNA sono preparati, utilizzare un vac di velocità per ridurre il volume a 2 – 5 μL (ogni campione).
4. preparazione di librerie di cDNA e sequenziamento di Smart-seq2
Nota: Per ridurre al minimo la variabilità tecnica, rendono tutte le librerie di cDNA allo stesso tempo e loro sequenza sulla stessa cellula di flusso.
- Usare un ingresso di 1,5 μL di RNA concentrato a fare librerie di cDNA seguendo il protocollo standard per Smart-seq217 fatta eccezione per le seguenti modifiche: uso un master di PCR ad alta fedeltà diverso mix (Vedi Tabella materiali) per PCR amplificazione; utilizzare una purificazione di PCR in colonna kit (Vedi Tabella materiali) invece di biglie magnetiche per purificare i prodotti di PCR.
- Il protocollo di Smart-seq2 comprende una fase di pre-amplificazione di PCR dopo trascrizione inversa, nonché una fase PCR di arricchimento finale dopo tagmentation. Il numero di cicli l'amplificazione di PCR dipende l'abbondanza del materiale in ingresso. Con 1.000 cellule come input, in genere utilizzare 15 cicli in fase di pre-amplificazione di PCR e 12 cicli per il passaggio PCR di arricchimento finale.
- Piscina le librerie e loro sequenza su una cella di flusso singolo (ad esempio, la piattaforma di NextSeq).
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Representative Results
Regime generale
Uno schema generale del protocollo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo è diviso in tre parti principali: volare lavoro, preparazione del campione, sequenziamento e analisi dei dati. La "Pianificazione prima dell'esperimento" sessione del protocollo non è incluso nel regime generale per semplicità.
Timeline
Un calendario delle parti principali del protocollo (Fly lavoro e preparazione del campione) è illustrato nella Figura 2.
Verifica di etichettatura specifica delle cellule mediante microscopia confocale
In un esperimento rappresentativo, L3 neuroni di lamina monopolari (L3) fluorescente sono stati etichettati. L3 neurone è uno dei cinque neuroni omologa della lamina (L1-L5) che ricevano input dai fotorecettori ampiamente sintonizzati R1-R6 e trasmettono le informazioni al centro alto di synapsing ai neuroni bersaglio nel midollo. In un esperimento MARCM, singola cella L3 cloni vengono generati tramite la ricombinazione mitotica e fluorescente etichettati da due indicatori, myr-tdTOM (membrana) e H2A-GFP (nucleari). I genotipi di mosche utilizzate nelle croci sono riportati nella tabella 1. Per verificare l'etichettatura cellula-specifico, volare cervelli del genotipo desiderato sono stati sezionati presso lo stadio di sviluppo di interesse (40h APF). Immunostaining è stato effettuato come descritto in precedenza7 utilizzando anticorpi specifici contro dsRed e GFP (Figura 3, magenta e verde), come pure l'anticorpo 24B10 come riferimento per il neuropils della lamina e midollo (Figura 3, blu). Microscopia confocale ha confermato che la L3 è l'unico tipo di cellula etichettato da dsRed e GFP nel lobo ottico.
Isolamento delle cellule di basso-abbondanza di FACS
Un rappresentante FACS ordinamento risultato è mostrato in Figura 4. 100.000 eventi sono stati registrati. 29,9% di tutti gli eventi sono potenziali camiciole, e il resto potrebbe essere detriti o aggregati. Doppiette e cellule con diverse dimensioni erano quindi gated fuori base alla granularità e dimensione. Dalle singole celle rimanenti (canottiere FSC, 27,3% di tutti gli eventi), i neuroni L3 è apparso come un cluster stretto in P1 (Figura 4, esemplare, magenta), che era ben separati dalle cellule del fondo (Figura 4, esemplare, blu). Il formato delle celle in P1 era simile coerente con una popolazione cellulare omogenea. In particolare, alcune cellule in P2 (Figura 4, esemplare, verde) con l'intensità di fluorescenza intermedi di dsRed e GFP sono state distribuite tra il gruppo di cellule in P1 e lo sfondo. L'identità di queste cellule non era chiaro. Poiché le cellule P2 avevano una dimensione diversa rispetto alle cellule di P1, queste cellule erano probabili essere non specifici. Per evitare potenziali contaminazioni dalle cellule aspecifiche, soltanto le cellule P1 sono stati raccolti per l'esperimento. Da 100.000 eventi, si ottengono 45 P1 celle.
Figura 1: uno schema generale del protocollo. Il protocollo è costituito da tre parti: volare lavoro, preparazione del campione, sequenziamento e analisi dei dati. È indicato il tempo approssimativo di elaborazione di ogni parte. Passaggi principali di ciascuna parte sono indicate anche nella rispettiva regione "in box". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Timeline per Vola lavoro e preparazione del campione. Il protocollo prende circa 6 settimane. Calendario per i passaggi principali figura nel calendario. La dissezione, la dissociazione e la purificazione di RNA sono fatte nello stesso giorno come l'ordinamento di FACS e non vengono visualizzati nel calendario per semplicità. Tre replicati biologici avvengono in sequenza nella stessa settimana con le croci stesse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: un'immagine di microscopia confocale rappresentante mostrando l'etichettatura selettiva di desiderata di cellule da marcatori fluorescenti. Negli esperimenti MARCM, singolo L3 neuroni di lamina monopolari sono state fatte per esprimere myr-tdTOM e H2A-GFP utilizzando un GAL4 L3 specifici driver (9-9-GAL4)18. Volare cervelli del genotipo desiderato sono stati sezionati a 40hr APF e macchiati con gli anticorpi anti-dsRed, anti-GFP e 24B10 (come un riferimento per il neuropils della lamina e midollo). Contrassegno fluorescente è stata valutata mediante microscopia confocale. L3 neuroni nascono negli assoni della lamina e progetto che terminano nel midollo neuropil. In ogni cervello, un sottoinsieme dei neuroni L3 espresse entrambe reporter fluorescenti, e queste erano le celle sola nel lobo ottico che esprimono i marcatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: purificante singolo neurone della lamina di L3 MARCM cloni via FACS: una trama di FACS rappresentativa. Porte (ad esempio P1) sono state create base sull'intensità di granularità, la dimensione e la fluorescenza delle cellule per isolare cellule singole omogenee. L3 neuroni che esprimono livelli altrettanto elevati di myr-tdTOM e H2A-GFP sono stati raccolti da P1 (magenta). Alcune cellule con l'intensità di fluorescenza intermedi sono osservate in P2 (verde). Queste sono dimensioni diverse rispetto ai neuroni L3 in P1 e potrebbe rappresentare le cellule aspecifiche. Questi non sono stati raccolti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Genotipo | Fonte |
| w; TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | Peng et al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | Peng et al., 2018 |
Tabella 1: Genotipi di mosche utilizzate nelle croci.
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Discussion
Questo protocollo è semplice e non tecnicamente difficili da eseguire, ma ci sono chiave diversi passaggi che se trascurato volontà causare una notevole riduzione di resa cellulare. (Passaggio 2.3.2). È fondamentale che le croci sono sani, e che il cibo non si asciughi. Annaffiature regolari di croci è essenziale per massimizzare il numero di mosche disponibili per dissezione del genotipo giusto e nella corretta fase di sviluppo. Quanto spesso croci c'è bisogno di essere innaffiato variano a seconda il cibo utilizzato e le condizioni di alloggio delle mosche. Affinché le croci non asciugarsi, esaminare le fiale due volte al giorno e aggiungere acqua di conseguenza. (Fase 3.3.) È anche importante stagno dissecati cervelli in una microprovetta singola che verrà utilizzata per la dissociazione, al contrario di avere ogni dissettore di utilizzare i propri conetti e poi successivamente pool di campioni. Questo eliminerà qualsiasi cervello perduto da trasferire tra microprovette, che può essere notevole. (Passaggio 3.4.9). Quando si pipetta su e giù per interrompere manualmente il tessuto, è vitale per farlo fino a quando non resti del tessuto sono visibili dall'occhio nella sospensione. Rottura incompleta del tessuto ridurrà il numero di singole cellule che possono essere ordinati via FACS e così fanno diminuire il rendimento cellulare.
La limitazione principale di rendimento cellulare è materiale di partenza. A questo proposito, le dissezioni sono limitante per diversi motivi: (1) il protocollo di dissociazione richiede ottica lobi essere dissecato fuori la testa e ' staccato dal cervello centrale, (2) per ottenere tessuto a precisi intervalli di tempo durante lo sviluppo il tempo finestra per le dissezioni deve essere limitato, (3) più lungo il periodo di tempo tra le dissezioni e FACS, maggiore sarà la possibilità di non ottimale delle cellule salute e non specifici effetti sull'espressione genica e organizzazione genomica (cioè, più è breve la dissezione periodo migliore). Il tempo trascorso di dissezione dovrebbe essere modificato per ottenere la quantità desiderata di materiale in quantità minima di tempo. La maggior parte della risoluzione dei problemi viene eseguita negli esperimenti pilota. Qui è fondamentale: ottimizzare genetica etichettatura per luminosità e specificità (Figura 3), valutare se una popolazione riproducibile delle cellule di interesse sono chiaramente segregati dalle cellule di sfondo nelle piazzole FACS (Figura 4), determinare la numero dei cervelli che hanno bisogno di essere sezionati per ottenere una quantità sufficiente di materiale per le successive applicazioni (vedere passaggio 1. Volare a lavoro) e determinare la quantità minima di tempo necessario per sezionare i numeri adatti di cervelli.
Il principale progresso di questo protocollo è che permette l'efficiente isolamento delle cellule basse abbondanti per trascrittomica e applicazioni genomiche, migliorando la sensibilità notevolmente nel corso della nostra precedente metodo6. Basata sulle nostre stime, fluorescente contrassegnati popolazioni composto da meno di 100 cellule per lobo ottico possono essere efficacemente isolati per le analisi di RNA-seq. Questo consente di trascrittomica e analisi genomica da applicare negli esperimenti di mosaico genetico, in cui sottoinsiemi di cellule di tipi particolari sono geneticamente manipolati in uno sfondo al contrario normale. Questo rappresenta un progresso critico, come tali esperimenti sono essenziali per determinare le funzioni del gene autonomi e non autonomi delle cellule in tessuti complessi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal NINDS dei National Institutes of Health, sotto numero premio K01NS094545, andgrants dal centro Lefler per la studio di Malattie Neurodegenerative. Riconosciamo Liming Tan e Jason McEwan per conversazioni importanti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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