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Genetics

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58474
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de dissociação de célula para isolar eficientemente células presentes em baixa abundância dentro do sistema visual de Drosophila através de célula de fluorescência ativada classificação (FACS).

Abstract

Recentes melhorias na sensibilidade do sequenciamento de próxima geração facilitaram a aplicação de transcriptomic e análises genômicas para pequeno número de células. Utilizar esta tecnologia para estudar o desenvolvimento do sistema visual de Drosophila, que ostenta uma riqueza de ferramentas genética de tipo específico de célula, fornece uma abordagem poderosa para abordar a base molecular do desenvolvimento com resolução de celular precisa. Para tal abordagem viável, é fundamental ter a capacidade de forma confiável e eficiente de purificar células presentes em baixa abundância dentro do cérebro. Aqui, apresentamos um método que permite a purificação eficiente de clones de célula única em experimentos de mosaico genético. Com este protocolo, consistentemente alcançamos um alto rendimento celular após purificação usando fluorescência ativado celular classificação (FACS) (~ 25% de todas as células rotuladas) e realizou com sucesso transcriptomics análises na única célula clones gerados através de análise de mosaico com um marcador de célula repressible (MARCM). Este protocolo é ideal para a aplicação transcriptomic e análises genômicas para tipos específicos de células no sistema visual, em diferentes estágios de desenvolvimento e no contexto de diferentes manipulações genéticas.

Introduction

O sistema visual da drosófila é um excelente modelo para o estudo a base genética do desenvolvimento e comportamento. É composto por uma arquitetura celular estereotipados1 e um conjunto de ferramentas de genético avançado para manipular tipos de célula específica2,3. Uma força principal deste sistema é a capacidade de interrogar autonomamente a função do gene em tipos de células de interesse com resolução única célula, usando métodos de mosaico genético4,5. Análises genômicas em única célula clones em experimentos de mosaico genético e procurámos combinar estas ferramentas genéticas com recentes avanços no sequenciamento de geração seguinte para executar transcriptomic de tipo específico de célula.

Para fazer isso, é essencial desenvolver um método robusto e eficiente para seletivamente isolar populações de baixa abundantes células no cérebro. Anteriormente, desenvolvemos um protocolo para isolar tipos de células específicas do sistema visual durante o desenvolvimento pupal através de FACS e determinando suas transcriptomes usando o RNA-seq.6. Nesses experimentos, a grande maioria das células de um tipo específico (por exemplo, R7 fotorreceptores) fluorescente foram rotulada. Usando esse método, em experimentos de mosaico genético, no qual apenas um subconjunto de células do mesmo tipo são rotulados, não conseguimos isolar células suficientes para obter dados de sequenciamento de qualidade. Para resolver isso, procuramos aumentar o rendimento celular melhorando o protocolo de dissociação de célula.

Nossa abordagem foi para diminuir o comprimento total do protocolo para maximizar a saúde das células dissociadas, melhorar a saúde celular, alterando os buffers de dissecção e dissociação e reduzir a quantidade de ruptura mecânica no tecido dissecado. Nós testamos o melhor protocolo7 usando análise de mosaico com uma célula repressible marcador5 (MARCM), que permite a geração de único fluorescente etiquetado clones de tipos de célula específica, que são tipo selvagem ou mutante para um gene de interesse em uma caso contrário heterozigota mosca. Onde, em condições idênticas, o nosso protocolo anterior falhou gerar material suficiente para RNA-seq, o protocolo melhorado foi bem sucedido. Nós reproducibly atingir um alto rendimento celular (~ 25% de pilhas etiquetadas) e obter dados de RNA-seq de alta qualidade de tão pouco como 1.000 células7.

Um número de protocolos têm sido descrito anteriormente para isolar os tipos de célula específica em Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. estes protocolos destinam-se principalmente para isolar as células que são abundantes dentro do cérebro. Nosso protocolo é otimizado para isolar populações de células abundantes baixa (menos de 100 células por cérebro) no sistema visual usando FACS para posterior transcriptomic e análises genômicas. Com este protocolo, nosso objetivo é fornecer uma maneira de isolar reproducibly baixas abundantes células do sistema visual de voar pela FACS e obtenção de dados de alta qualidade transcriptome por RNA-Seq

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Protocol

1. planejamento antes do experimento

  1. Antes de iniciar o experimento, execute um experimento piloto em pequena escala para confirmar se a genética funciona conforme o esperado para rotular especificamente as células desejadas.
    1. Como primeiro passo, uso imuno-histoquímica e microscopia de luz para determinar se as células indesejáveis são rotuladas. Idealmente, marcadores genéticos será específicos dentro da retina e o lobo óptico (Figura 3). Só óptica lóbulos são utilizados para dissociação de célula e então rotulagem no cérebro central não é um problema. Ao mesmo tempo, determine quantas células de interesse são rotuladas por cérebro.
    2. Se a etiqueta genética tem a especificidade desejada, realizar um experimento piloto de FACS (Figura 4) para determinar se uma população pura de células pode ser reproducibly isolada, e também avaliar quantas células de interesse pode ser isolados de cada cérebro. Se necessário, avalie a pureza de células isoladas através de PCR quantitativo para determinar o enriquecimento ou de enriquecimento de genes específicos.
  2. Determine o número de cruzes é necessário para obter a quantidade desejada de material para o experimento.
    Nota: Com base na experiência experimental, ~ 17 – 25% de células fluorescente etiquetadas é consistentemente isolados com este protocolo, e dados de alta qualidade-a sequenciação do ARN são obtidos a partir de 1.000 células de FACS purificado (menos células podem ser suficientes).
    1. Para obter a 1.000 células para análises de RNA-seq, certifique-se de que há pelo menos 40 células de interesse fluorescente etiquetado por cérebro (20 células por lobo óptico). Em torno de ~ 10 células de interesse devem ser purificadas por cérebro, então disse 100 cérebros.
    2. Para obter ~ 100 moscas na fase do desenvolvimento para dissecar em cada experimento, use ~ 100 cruzes se selecionando contra balanceadores (isso irá variar dependendo os genótipos dos pais). Se moscas são homozigotos para os alelos/transgenes de interesse menos cruzes podem ser definidos.
    3. Limite a janela de dissecação para 1h para maximizar a saúde celular e minimizar alterações inespecíficas de expressão gênica e organização do genoma que pode ocorrer depois de cérebros são dissecados, mas isto pode ser ajustado. Determine o número de dissectors necessário para dissecar 100 cérebros em 1 h, que depende da habilidade dos dissectors.

2. trabalho de voar

Nota: Moscas são disparadas a 25 ° C, com umidade de ~ 50% a menos que indicado o contrário. Abaixo o genótipo das fêmeas é indicado como genótipo F e o de machos como genótipo M.

  1. Estoques em expansão
    1. Obter ~ 100 frascos de moscas jovens (não mais de uma semana de idade com genótipo F) e ~ 30 frascos de genótipo M.
    2. Na quinta-feira da semana 1, flip 100 frascos de genótipo F para alimentos frescos. Começando na sexta-feira, vire os frascos cada dia através de 2 semana terça-feira. Estes 6 aletas serão usadas para coletar virgens. Também na quarta-feira da semana 2, flip moscas de genótipo M sobre alimentos frescos e limpar os pais na sexta-feira da semana 2. Estes frascos serão usados para coletar os machos para as cruzes.
  2. Coleta de virgens
    1. De segunda-feira da semana 3, colete virgens de frascos de genótipo F. Coletar 2 - 3 vezes por dia e armazenar as virgens a 18 ° C, com umidade de ~ 50%. Repita isto cada dia através de terça-feira da semana 4. É altamente recomendável para coletar tantas virgens quanto possível, uma vez que muitos deles morrem antes que as cruzes são definidas. Normalmente, ~ 2.500 virgens devem ser recolhidas para definir 100 cruzes.
  3. Configuração de cruzes
    1. Na sexta-feira da semana 4, defina os números desejados de cruzes (tipicamente de 100 – 200 cruzes por experiência) com 15 virgens de genótipo F e 7 machos de genótipo M para cada cruz. É muito importante o uso de machos jovens e saudáveis com asas intactas.
    2. As cruzes da aleta todos os dias de domingo a sábado da semana 5. Complementar as cruzes com virgens frescas ou os machos se encontram-se moscas mortas. É essencial para evitar que os alimentos sequem, então os frascos da água conforme necessário. Alimentos secos diminuirá significativamente o rendimento.
  4. Controlo negativo para classificação de FACS
    1. Incluir um controle negativo sem as células desejadas ser rotuladas para a classificação de FACS. Idealmente, o controle negativo deve ter o repórter (por exemplo, UAS-GFP) mas não o driver (por exemplo, GAL4), para que a expressão basal do repórter (UAS-construções podem ser "furados") pode ser determinado conjunto apropriado de canal para a classificação de FACS. Inverter as moscas para o controle negativo ao mesmo tempo com as moscas experimentais e fase-los da mesma forma.
  5. Pupas de encenação
    1. Para coletar as células em um estágio específico do desenvolvimento pupal (por exemplo, 40 h após a formação do casulo [h APF]), palco as pupas em uma janela de tempo de 1 h para coincidir com o período de 1h alocado para as dissecções (discutidas acima). FACS deve ser realizada imediatamente após a dissociação do celular, que ocorre após as dissecções e leva ~ 40 min. Assim, a hora exata da encenação e dissecações é determinada pela disponibilidade de FACS.
    2. Para obter pupas a 40 h APF, estágio na segunda-feira da semana 6, em um ponto específico de tempo (por exemplo, 17:00) para dissecar pupas 40 h mais tarde (por exemplo, 09:00 de quarta-feira). Use um pincel molhado suavemente escolher brancos pré-pupas e colocá-los na parede em frascos previamente aquecidos. Só escolha as pupas com genótipo desejado.
  6. Réplicas biológicas
    1. Fazer pelo menos 3 réplicas biológicas para cada experimento. Como uma maneira simples, repeti a experiência três vezes na mesma semana (semana 6) usando as mesmas cruzes. Por exemplo, fase de pupas para a segunda e o terceira é replicada na terça e quarta-feira, respectivamente. Disse esses pupas na quinta e sexta-feira, respectivamente.

3. preparação da amostra

Nota: Todos os reagentes utilizados neste protocolo são listados na Tabela de materiais.

  1. Preparar soluções para dissecções e dissociação de tecido
    1. Preparar a solução de reserva de mistura de enzimas proteolíticas (ver Tabela de materiais) por reconstituir a enzima liofilizada com DDQ2O a uma concentração de 26 unidades Wünsch (Wu) / mL. Para um frasco contendo 260 Wu (frasco grande), adicionar 10 mL de DDQ2O para o frasco e fazer uso único alíquotas (4,2 µ l são necessários por dissociação). Solução estoque de loja a-20 ° C. Cada experimento exige dissociação das duas amostras (controlo negativo e tecido experimental).
    2. Prepare-se 10 x solução (RS do Rinaldini) e mídia (CSM da Schneider completa) no dia anterior a dissecação (segunda-feira da semana 6). Prepare-se 5 mL do CSM para cada Dissecador e cerca de 5 mL de 1x do RS e 5 mL do CSM para dissociação de 2 amostras (controlo negativo e experimental). Armazene o RS 10 x a 4 ° C por até um mês e o CSM a 4 ° C por até uma semana.
      1. Para preparar 100 mL de 10 x RS, dissolva 8 g de NaCl, 200 mg de KCl, 50 mg de NaH2PO4, 1G de NaHCO3 e 1 g de glicose em 100 mL de DDQ2O em um copo de 250 mL. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,22 mm.
      2. Adicione 20 mg de L-glutationa para 1 mL de DDQ2O em um microtubo.
      3. Para preparar 50 mL de CSM, adicionar 5 mL de calor inativada soro bovino, 0,1 mL de solução de insulina de 10 mg/mL, 5 mL de solução de L-glutamina de 200 mM, 12,5 μL de 20 mg/mL L-glutationa e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina (5.000 unidades de penicilina e 5 mg de estreptomicina / mL) para 38,9 mL de mídia do Schneider. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,22 mm.
      4. Dilua 10 x RS com O ddH2para fazer 1 x solução de trabalho de RS. Prepare-se para cada amostra 500 μL de 1 x RS em microtubos não adesivas.
    3. Ligue um banho de água e definir a temperatura a 37 ° C. Certifique-se que a temperatura é precisa, usando um termômetro. O banho de água deve estar na temperatura correta antes da ativação de papaína. Recomenda-se definir a temperatura a noite antes de uma dissecação de manhã.
  2. Preparar a papaína e a enzima proteolítica misturar
    Nota: Fazer a solução de papaína fresco antes de cada dissociação.
    1. Na terça-feira da semana 6 em torno de 45 min antes de iniciar as dissecções, recuperar 1 frasco de pó de papaína de 4 ° C e incubar a temperatura ambiente. Também Reserve CSM em um tubo de Eppendorf à temperatura ambiente para depois adicionar o pó de papaína.
    2. min antes do início das dissecções usar uma seringa para adicionar a temperatura CSM para o frasco de papaína (diretamente através da tampa) para que a concentração é de 100 unidades/mL (a quantidade de pó em cada frasco é um pouco diferente; para um frasco contendo 123 unidades adicionar 1,23 m L do CSM). Para misturar, primeiro, inverta o frasco para capturar qualquer pó preso no interior da tampa e em seguida Pipetar para cima e para baixo.
    3. Adicione o frasco para um béquer contendo água de 37 ° C em banho-maria. Certifique-se que o frasco de solução de papaína não é flutuante. Ativar a papaína durante 30 min a 37 ° C.
    4. Depois de adicionar a papaína para um béquer no banho de água, recuperar uma parte alíquota de mistura de enzimas proteolíticas (26 Wu/mL) de-20 ° C e -incubar à temperatura ambiente. Após 30 min de ativação, incube a papaína à temperatura ambiente.
  3. Dissecções
    1. Na terça-feira da semana 6, dissecar o cérebro pupal encenado no frio CSM com pinça limpa e cortar os lóbulos óptica por beliscar na junção do lobo óptico e o cérebro central.
    2. Adicione os lóbulos no fundo de um microtubo contendo 500 μL de 1 x RS (um microtubo para o tecido experimental) e outro para o tecido de controle negativo. Sempre manter os tubos em gelo.
    3. Disse lóbulos tantos quanto possível em 1h. Para o tecido de controlo negativo, 10 lobos são suficientes. Piscina dissecado lóbulos de óptica em um microtubo único para eliminar a perda de tecido durante a transferência entre microtubos.
  4. Dissociação de célula
    1. Remova cuidadosamente a RS 1 x do microtubo com lóbulos de óptica dissecados usando uma pipeta P200, deixando o suficiente para cobrir os lóbulos. Cuidadosamente, adicione 500 μL de RS 1 x ao lado do tubo, de modo a perturbar os menos possível de cérebros. Mantenha sempre o tubo no gelo.
    2. Deixa os lóbulos se ao fundo. Só uma vez, tome a 200 μL e pipetar para fora a mistura (lóbulos devem movimentar). Deixe-os lóbulos resolver novamente.
    3. Para duas amostras (controle experimental e negativo), alíquota 600 μL de papaína de temperatura registrados para um microtubo. Adicione 4.2 μL de mistura de enzimas proteolíticas de temperatura ambiente em solução de papaína 600 μL para obter uma concentração final de 0.18 Wu/mL. Misture pipetando para cima e para baixo. Esta é a solução de dissociação.
    4. Cuidadosamente remova o RS 1 x cada amostra e adicionar 300 μL de solução de dissociação dos lóbulos. Incube as amostras a 25 ° C, 1.000 rpm por 15 min em um microtubo de thermomixer.
    5. Nos 5 e 10 min tempo pontos, pare a thermomixer e deixar os lóbulos afundam até o fundo do microtubo. Ocupam 200 μL de solução e pipeta para fora para misturar.
    6. Depois de 15 min, deixe os lóbulos se estabelecer ao fundo e Retire cuidadosamente a solução de dissociação de lóbulos (tentar não perturbar os lóbulos).
    7. Lave duas vezes com 1 x RS. Para fazer isso, adicione cuidadosamente 500 μL 1 x RS (tentar não perturbar os lóbulos). A mistura, pipeta suavemente até 200 μL e pipetar então fora para o microtubo. Deixe os lobos afundar até o fundo e repita.
    8. Lave cada amostra duas vezes com 500 μL de CSM (igual ao passo anterior).
    9. Cuidadosamente remova o CSM e adicionar outro 200 μL do CSM para o tubo. Usando uma pipeta P200, perturbar o tecido pipetando acima e para baixo sem formação de espuma, até que a solução é homogênea (i.e., não posso mais ver todos os restos de tecido).
    10. Filtrar a suspensão através de um tampão de malha 30 μm em um tubo de 5 mL FACS no gelo (use um P200 e certifique-se que atravessa a suspensão inteira). Adicionar outro 500 μL do CSM para enxaguar o microtubo de dissociação e filtrar a solução no tubo de FACS.
    11. Cuidadosamente Tire a tampa do tubo FACS, recolher a solução sob o filtro de rede com um P200 e adicioná-lo para o resto da suspensão no tubo do FACS. As amostras estão prontas para FACS.
    12. Assegure-se de microtubos para coletar células FACS purificado pronto com antecedência. Para o RNA-seq, classificar as células de cada amostra diretamente em microtubos contendo 300 μL de tampão RLT (lise) do kit de purificação de RNA (adicionar 1: 100 2–Mercaptoethanol antes do uso).
  5. Classificação de FACS
    Nota: Após a dissociação, imediatamente classificar as células por FACS (máximo de 1 h). Certifique-se de sessões de FACS livro conformemente ao planejar o experimento. Um classificador de pilha com tamanho de bico 100 μm é normalmente usado.
    1. Compare a distribuição de célula no controle negativo e a amostra experimental para configurar o canal para a classificação. Idealmente, estabelecer o gating no experimento piloto FACS, e a amostra de controlo negativo irá fornecer a confirmação ou a sintonia fina do gating pré-estabelecidas. As células de interesse devem ser bem separadas as células de fundo que estão presentes em ambos o controle negativo e a amostra experimental (Figura 4) (testar isso nos experimentos piloto).
    2. Colete as células classificadas nos tubos preparados coleção.
  6. Purificação de RNA
    1. Após separação das células diretamente em 300 μL de tampão, RLT, pipeta para cima e para baixo lisar as células.
    2. Purificar o RNA após o protocolo padrão de purificação de RNA Total do Animal e humano as células usando a purificação kit (veja a Tabela de materiais)-com de digestão de DNA na coluna7. Eluir o RNA em 20 μL de água livre de RNase.
    3. Congelar as amostras de RNA com nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
    4. Para cada experimento execute pelo menos 3 repetições para condições experimentais e de controle. Preparar as bibliotecas de cDNA para todas as amostras ao mesmo tempo e executar todas as amostras na mesma célula de fluxo para controlar a variabilidade técnica. Uma vez que todas as amostras de RNA são preparadas, use uma vac de velocidade para reduzir o volume de 2 – 5 μL (cada amostra).

4. preparação de bibliotecas de cDNA e sequenciamento por Smart-seq2

Nota: Para minimizar a variabilidade técnica, fazer todas as bibliotecas de cDNA ao mesmo tempo e sequenciá-los na mesma célula de fluxo.

  1. Use uma entrada de 1,5 µ l de RNA concentrado para tornar as bibliotecas de cDNA, seguindo o protocolo padrão para Smart-seq217 , exceto para as seguintes modificações: utilização de um mestre de PCR de alta-fidelidade diferente mistura (veja Tabela de materiais) para PCR amplificação; Use uma purificação de PCR na coluna kit (veja a Tabela de materiais) em vez de grânulos magnéticos para purificar os produtos de PCR.
  2. O protocolo de Smart-seq2 inclui uma etapa de pré-amplificação do PCR após a transcrição reversa, bem como um passo PCR de enriquecimento final após tagmentation. O número de ciclos de amplificação da PCR depende da abundância de material a entrada. Com 1.000 células como entrada, usado tipicamente 15 ciclos na etapa pré-amplificação do PCR e 12 ciclos para a etapa PCR de enriquecimento final.
  3. As bibliotecas da piscina e Sequencie-los em uma célula de fluxo único (por exemplo, a plataforma de NextSeq).

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Representative Results

Regime geral
Um esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo é dividido em três partes principais: voar de trabalho, preparação da amostra, sequenciamento e análise de dados. A sessão "Planejamento antes do experimento" do protocolo não está incluída no regime geral para a simplicidade.

Linha do tempo
Um calendário das principais partes do protocolo (mosca trabalho e preparação da amostra) é mostrado na Figura 2.

Verificando a células específicas de rotulagem por microscopia confocal
Em um experimento de representante, L3 neurônios monopolares de lâmina (L3) fluorescente foram rotulados. Neurônio de L3 é um dos cinco neurônios homólogos lâmina (L1-L5) que recebem entrada dos FOTORRECEPTORES amplamente sintonizados R1-R6 e retransmitem as informações para o centro de alta por synapsing de neurônios alvo na medula. Em um experimento MARCM, única célula L3 clones são gerados por recombinação mitótica e fluorescente etiquetados por dois marcadores, myr-tdTOM (membrana) e H2A-GFP (nucleares). Os genótipos de moscas usados na cruza são mostrados na tabela 1. Para verificar se a rotulagem específicos de célula, voar os miolos do genótipo desejado foram dissecados em fase de desenvolvimento de interesse (40 h APF). Immunostaining foi realizada como descrito anteriormente7 usando anticorpos específicos contra dsRed e GFP (Figura 3, magenta e verde), bem como o anticorpo 24B10 como uma referência para o neuropils de lâmina e medula (Figura 3, azul). Microscopia confocal confirmou que L3 é o único tipo de célula rotulado por dsRed e GFP no lobo óptico.

Isolamento de células de baixa abundância por FACS
Um representante FACS classificação resultado é mostrado na Figura 4. 100.000 eventos foram registrados. 29,9% de todos os eventos são potenciais Camisolas interiores, e o resto poderia ser detritos ou agregados. Parelhas e células com diferentes tamanhos foram então fechadas com base na granularidade e tamanho. Das restantes células única (singletos FSC, 27,3% de todos os eventos), L3 neurônios apareceram como um aglomerado apertado na P1 (Figura 4, espécime, magenta), que foi bem separou as células de fundo (Figura 4, amostra, azul). O tamanho das células em P1 foi semelhante consistente com uma população celular homogênea. Notavelmente, algumas células em P2 (Figura 4, espécime, verde) com intensidade de fluorescência intermediário de dsRed e GFP foram distribuídas entre o apertado conjunto de células em P1 e o plano de fundo. A identidade dessas células não estava clara. Uma vez que as células P2 tinham um tamanho diferente do que as células de P1, estas células eram prováveis ser específico. Para evitar a potencial contaminação de células não-específica, apenas P1 células foram coletadas para o experimento. De 100.000 eventos, 45 P1 células são obtidas.

Figure 1
Figura 1: um regime geral do protocolo. O protocolo é composto por três partes: voar de trabalho, preparação da amostra, sequenciamento e análise de dados. É indicado o tempo de processamento aproximado de cada parte. Principais etapas de cada parte também são mostradas nas regiões Box correspondentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: linha do tempo para voar de trabalho e preparação da amostra. O protocolo leva cerca de 6 semanas. Sincronismo para os principais passos é mostrado no calendário. Dissecção, dissociação e purificação de RNA são feitos no mesmo dia em que a classificação de FACS e não são mostrados no calendário para a simplicidade. Três réplicas biológicas são feitas sequencialmente na mesma semana com o mesmo atravessa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: uma imagem de microscopia confocal representativo mostrando a rotulagem seletiva do desejado células por marcadores fluorescentes. Em experimentos MARCM, único neurônios da lâmina L3 monopolares foram feitos para expressar myr-tdTOM e H2A-GFP usando um GAL4 L3 específico motorista (9-9-GAL4)18. Voar cérebros do genótipo desejado foram dissecados 40 HR APF e manchados com anticorpos anti-dsRed, anti-GFP e 24B10 (como uma referência para o neuropils de lâmina e medula). Etiquetando fluorescente foi avaliada por microscopia confocal. L3 neurônios nascem em lâmina e projeto axônios que terminam dentro o neurópilo de medula. Em cada cérebro, um subconjunto de neurônios L3 expressa ambos os repórteres fluorescentes, e estas foram as células única no lobo óptico expressando os marcadores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Purifying único neurônio de lâmina L3 MARCM clones através de FACS: uma parcela representativa de FACS. Gates (por exemplo, P1) foram criados com baseadas na intensidade de fluorescência, tamanho e granulosidade celular para isolar células individuais homogéneas. L3 neurônios expressando similarmente elevados níveis de myr-tdTOM e H2A-GFP foram coletados em P1 (magenta). Algumas células com intensidade de fluorescência intermediários são observadas em P2 (verdes). Estas são diferentes em tamanho do que os neurônios de L3 em P1 e poderiam representar células inespecíficas. Estas não foram coletadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Genótipo Fonte
w; GFP-TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B Peng et al, 2018
w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B Peng et al, 2018

Tabela 1: Genótipos de moscas usados na cruza.

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Discussion

Este protocolo é simples e não é tecnicamente difícil de executar, mas há chave de várias etapas que se negligenciado irá causar uma redução considerável no rendimento celular. (Etapa 2.3.2.) É crucial que as cruzes são saudáveis, e que a comida não secar. Molhar regular de cruzes é essencial para maximizar o número de moscas disponíveis para dissecação que estão com o mesmo genótipo e a correta fase de desenvolvimento. Quantas vezes cruzes precisa ser regada irá variar dependendo o alimentos utilizados e as condições de habitação das moscas. Para assegurar-se de cruzes não secar, examinar as ampolas duas vezes por dia e adicionar água em conformidade. (Passo 3.3.) Também é importante para piscina cérebros dissecados para um microtubo único que será usado para a dissociação, em oposição a ter cada Dissecador usar seu próprios microtubo e então posteriormente pool de amostras. Isto eliminará qualquer cérebro perdido de transferência entre microtubos, que podem ser consideráveis. (Passo 3.4.9.) Quando pipetagem para cima e para baixo para interromper manualmente o tecido, é vital a fazê-lo até sem resquícios do tecido são visíveis a olho nu na suspensão. Rompimento de tecido incompleto irá reduzir o número de células únicas que podem ser classificados através de FACS e, portanto, diminuir o rendimento celular.

A grande limitação de rendimento celular é o material começar. A este respeito, as dissecções são taxa de limitação por várias razões: (1) o protocolo de dissociação requer lóbulos óptica para ser dissecado fora da cabeça e separada do cérebro central, (2) para obter o tecido em tempo-pontos precisos durante o desenvolvimento do tempo janela para dissecções deve ser limitada, (3) ao longo do período entre as dissecções e FACS, maior a chance de qualidade inferior celular saúde e efeitos não-específicos na expressão gênica e organização genômica (ou seja, quanto menor a dissecação período de melhor). Dissecando o tempo gasto deve ser modificado para obter a quantidade desejada de material no montante mínimo de tempo. A maioria da solução de problemas é executada nas experiências piloto. Aqui é crucial para: otimizar a genética de rotulagem para brilho e especificidade (Figura 3), avaliar se uma população pode ser reproduzida de células de interesse são claramente separados dos células de fundo nas tramas de FACS (Figura 4), determinar a número de cérebros que precisam ser dissecado para obter uma quantidade suficiente de material para aplicações subsequentes (consulte a etapa 1. Voar de trabalho) e determinar a quantidade mínima de tempo necessário para dissecar os números adequados de cérebros.

O grande avanço deste protocolo é que ele permite isolamento eficiente de baixas abundantes células para aplicações genômicas, melhorando a sensibilidade consideravelmente sobre nossos anteriores método6e transcriptomic. Com base em nossas estimativas, as populações fluorescente etiquetadas composto por menos de 100 células por lobo óptico podem ser eficientemente isoladas para análises de RNA-seq. Isto permite análises genômicas para ser aplicado em experimentos genéticos mosaico, no qual subconjuntos de células de tipos específicos são geneticamente manipulados em um plano normal e transcriptomic. Isto representa um avanço crítico, como tais experiências são essenciais para determinar funções de gene autónoma e não autónomos de células em tecidos complexos.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi financiada pelo NINDS dos institutos nacionais de saúde, sob número do prêmio K01NS094545, andgrants do centro para o estudo de doenças neurodegenerativas Lefler. Reconhecemos a calagem Tan e Jason McEwan para conversas valiosas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

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References

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Genética edição 139 sistema visual de Drosophila lobo óptico neurônios dissociação de célula FACS a sequenciação do ARN MARCM mosaico genético baixa abundância
Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila
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Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. … More

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

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