Summary
Здесь мы представляем протокол диссоциации клеток для эффективно изолировать клетки присутствуют в низкой изобилия в пределах дрозофилы зрительной системы через клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS).
Abstract
Недавние улучшения в чувствительности следующего поколения секвенирования облегчили применения геномного анализа и транскриптомики для небольшого числа клеток. Использования этой технологии для изучения развития в зрительной системе дрозофилы, который может похвастаться богатством клеток генетического типа инструменты, обеспечивает мощный подход для решения молекулярные основы развития с точным сотовой резолюции. Для такого подхода к возможно важно иметь возможность надежно и эффективно очищает клетки присутствуют в низкой изобилия в головном мозге. Здесь мы представляем метод, который позволяет эффективное очищение одной ячейки клонов в мозаика генетических экспериментов. Этот протокол мы последовательно достичь Высокодоходные клеточной после очистки с помощью флуоресценции активации клеток, сортируя (FACS) (~ 25% всех помеченных клеток) и успешно выполняется анализ transcriptomics на одну ячейку клоны, созданные через Мозаика анализ с маркером repressible клеток (MARCM). Этот протокол является идеальным для применения транскриптомики и геномный анализ типов определенных ячеек в зрительной системе, на различных стадиях развития и в контексте различных генетических манипуляций.
Introduction
Зрительная система дрозофилы является выдающаяся модель для изучения генетической основы развития и поведения. Она включает стереотипных сотовой архитектуры1 и передовых генетических инструментарий для манипулирования клеток конкретных типов2,3. Одним из основных преимуществ этой системы заключается в возможности самостоятельно допросить функции гена в типах клеток интерес с резолюцией одной ячейки, используя генетический мозаика методы4,5. Мы стремились объединить эти генетические инструменты с последних достижений в следующего поколения последовательности для выполнения определенного типа клеток транскриптомики и геномный анализ в одну ячейку клоны в мозаика генетических экспериментов.
Для этого важно разработать надежный и эффективный способ выборочно изолировать низкой обильные клеточных популяций в головном мозге. Ранее мы разработали протокол для изоляции типы конкретных клеток в зрительной системе во время куколки разработки через СУИМ и определение их transcriptomes с помощью РНК seq6. В этих экспериментах подавляющее большинство клеток определенного типа (например , R7 фоторецепторов) дневно были помечены. С помощью этого метода, в генетических мозаика экспериментов, в котором обозначены только подмножество ячеек того же типа, мы смогли выделить достаточное количество клеток для получения качественных данных последовательности. Для решения этой проблемы, мы стремились увеличить сотовой урожайности путем улучшения протокол диссоциации клеток.
Наш подход был снизить Общая длина протокола повысить здоровье диссоциированных клеток, улучшить здоровье клеток, изменяя диссекции и диссоциации буферов, и уменьшить количество механического разрушения Иссеченную ткань. Мы протестировали улучшение протокола7 с помощью анализа мозаика с repressible клеток маркер5 (MARCM), который позволяет поколение сингл дневно помечены клоны типов конкретных клеток, которые дикого типа или мутантный ген интереса к в противном случае гетерозиготных летать. Где в одинаковых условиях, наши ранее протокол удалось создать достаточно материала для РНК seq, улучшение протокол был успешным. Мы можно воспроизвести достичь Высокодоходные клеточной (~ 25% помеченных клеток) и получить высокое качество РНК seq данных как 1000 ячеек7.
Ряд протоколов были ранее описаны изолировать типы клеток конкретного дрозофилы6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. Эти протоколы предназначены главным образом для изоляции клетки, которые изобилуют в головном мозге. Наш протокол оптимизирован для изоляции низких обильные клеточных популяций (менее 100 ячеек на мозг) в зрительной системе с помощью СУИМ для последующего транскриптомики и геномного анализа. Этот протокол мы стремимся обеспечить для герметизации изоляции низких обильные клетки от летать зрительной системы СУИМ и получение высококачественных данных транскриптом РНК-далее
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. планирование перед эксперимент
-
Перед началом эксперимента, выполнения мелких эксперимента для подтверждения, если генетика работать как ожидалось конкретно маркировать нужные ячейки.
- Как первый проход, использование иммуногистохимии и световой микроскопии для определения если помечены как нежелательные клетки. В идеале генетических маркеров будет конкретным сетчатки и зрительного лепестка (рис. 3). Только оптические лопастями используются для диссоциации клеток и поэтому маркировки в Центральный мозг не является проблемой. В то же время определите, сколько клеток интерес помечены в мозг.
- Если генетические знак(и) желаемой специфичности, выполнить СУИМ эксперимента (рис. 4) для определения если чисто популяция клеток может быть можно воспроизвести изолированы, и также оценить сколько клеток интерес может быть изолирован от каждого мозга. При необходимости оценить чистоту изолированных клеток путем количественного PCR для определения обогащения или де обогащения специфических генов.
-
Определите количество крестов, необходимых для получения желаемого количества материала для эксперимента.
Примечание: На основе экспериментального опыта, ~ 17 – 25% дневно обозначенные клетки изолированы последовательно с настоящим Протоколом, и высокого качества РНК последовательности данных получаются из всего лишь 1000 ячеек СУИМ очищенный (меньше клетки могут быть достаточно).- Чтобы получить 1000 ячеек для анализа РНК seq, убедитесь, что существует по меньшей мере 40 клеток интерес дневно помечены в мозг (20 ячеек на лоб зрительный). Около ~ 10, что клетки интереса должны быть очищены в мозг, поэтому проанализируем 100 мозги.
- Для получения ~ 100 мух на соответствующем этапе развития вскрыть в каждом эксперименте, используйте ~ 100 крестов, если выбор против балансиры, (это будет варьироваться в зависимости от генотипы родителей). Если мухи гомозиготных для аллели/трансгенов интерес можно задать меньшее количество крестов.
- Ограничьте окно рассечение до 1 ч для свертывания здоровье клеток и неспецифические изменения экспрессии генов и организации генома, которые могут произойти после того, как разделяются мозги, но это может быть скорректирована. Определите количество Диссекторы, необходимые для того чтобы рассечь мозги 100 в 1 h, которая зависит от мастерства Диссекторы.
2. летать работы
Примечание: Мухи возникают при 25 ° C ~ 50% влажности, если не указано иное. Ниже генотипа самки обозначается как генотип F и что мужчины как генотип М.
-
Расширение запасов
- ~ 100 флаконов молодых мух (не более чем на неделю с генотипом F) и ~ 30 флаконов генотипа м получите.
- В четверг 1 неделю флип 100 флаконов генотип F на свежие продукты. Начиная пятницу, флип флаконы каждый день через вторник 2 недели. Эти 6 сальто будет использоваться для сбора девственниц. Также в среду 2 недели, флип мух генотипа м на свежие продукты питания и очистить родителей в пятницу 2 недели. Эти пузырьки будут использоваться для сбора мужчины для кресты.
-
Сбор девственниц
- С понедельника 3 недели Соберите девственниц от генотипа F флаконов. Сбор 2 - 3 раза в день и хранить девственниц на 18 ° C ~ 50% влажности. Повторяйте это каждый день через вторник 4 недели. Настоятельно рекомендуется собрать столько девственниц как можно скорее, поскольку многие из них умирают перед устанавливаются кресты. Как правило пересекает ~ 2500, собранные девственниц установить 100.
-
Установка крестов
- В пятницу 4 недели установите желаемого количества кресты (обычно 100 – 200 кресты за эксперимент) с 15 девственниц генотип F и 7 мужчин генотипа м для каждого Креста. Это очень важно использовать молодых и здоровых мужчин с нетронутыми крыльями.
- Флип кресты каждый день с воскресенья по субботу 5 недели. Дополнение кресты с свежим девственниц или мужчины, если найден мертвым мух. Важно, чтобы предотвратить высыхание пищи, так что вода флаконов при необходимости. Сухая еда будет значительно снизить доходность.
-
Отрицательного контроля для сортировки СУИМ
- Включать отрицательный контроль без быть помечены нужные ячейки для сортировки СУИМ. В идеале отрицательный контроль должен иметь репортер (например UAS-GFP), но не драйвер (например GAL4), так что базальную выражение репортер (UAS-конструкции может быть «Дырявый») может быть определена для задания соответствующим ограничением для сортировки СУИМ. Флип мух для отрицательного контроля в то же время с экспериментальной мух и этап их таким же образом.
-
Постановка куколок
- Чтобы собрать клетки на определенной стадии развития куколки (например 40 h после формирования puparium [h НФА]), стадии куколки в окно времени 1 ч в соответствии с периодом 1 h отведенное для вскрытия (обсуждалось выше). СУИМ должна быть выполнена непосредственно после диссоциации клеток, которая возникает после вскрытия и занимает ~ 40 мин. Таким образом точное время постановки и вскрытия определяется наличием СУИМ.
- Чтобы получить куколки в 40 h НФА, этап в понедельник недели 6 в точке определенное время (например, 5 вечера) для того чтобы рассечь куколок 40 h позже (например, 9 утра в среду). Использование влажной кистью аккуратно выбрать белый предварительно куколок и разместить их на стене в подогретым флаконов. Только выберите куколки с желаемой генотипа.
-
Биологическая реплицирует
- Сделайте по крайней мере 3 биологических репликация для каждого эксперимента. Как простой способ повторите эксперимент три раза в течение одной недели (неделя 6) с помощью же кресты. Например этап куколок для второго и третьего реплицирует во вторник и среду, соответственно. Проанализируем эти куколки в четверг и пятницу, соответственно.
3. Пробоподготовка
Примечание: Все реактивы, используемые в настоящем Протоколе, перечислены в Таблице материалов.
- Подготовка решения для вскрытия и ткани диссоциации
- Подготовьте смесь Стоковый раствор протеолитического фермента (см. Таблицу материалы) путем воссоздания лиофилизированные фермента с ddH2O к концентрации 26 Wünsch единиц (Wu) / мл. Флакон, содержащий 260 Ву (большой флакон) ddH2O на 10мл флакон и сделать одноразовый аликвоты (4.2 мкл требуются за диссоциации). Стоковый раствор хранить при температуре-20 ° C. Каждый эксперимент требует диссоциации двух выборок (отрицательный контроль и экспериментальной ткани).
- Подготовка 10 x Rinaldini в раствор (RS) и полный Шнайдер СМИ (CSM) за день до вскрытия (понедельник недели 6). Подготовить 5 мл CSM для каждого диссектор и около 1 x RS 5 мл и 5 мл CSM для диссоциации 2 образцов (отрицательный контроль и экспериментально). Магазин 10 x RS на 4 ° C до одного месяца и CSM при 4 ° C до недели.
- Подготовить 100 мл 10 x RS, Растворите 8 г NaCl, 200 мг KCl, 50 мг NaH2PO4, 1 г NaHCO3 и 1 г глюкозы в 100 мл ddH2O в стакан 250 мл. Фильтр стерилизовать с фильтром 0,22 мм.
- Добавьте 20 мг L-глутатион 1 мл ddH2O в микропробирок.
- Чтобы подготовить 50 мл CSM, добавьте 5 мл тепла инактивированная бычьим сывороточным, 0,1 мл раствора инсулина 10 мг/мл, 5 мл 200 мм L-глютамин решения, 12,5 мкл 20 мг/мл L-глутатион и 1 мл раствора пенициллина и стрептомицина (5000 единиц пенициллина и стрептомицина 5 мг / Мл) до 38,9 мл Шнейдера СМИ. Фильтр стерилизовать с фильтром 0,22 мм.
- Развести 10 x RS с ddH2O сделать 1 x RS Рабочий раствор. Подготовка 500 мкл 1 x RS в не клей пробирок для каждого образца.
- Включите на водяной бане и температуры при 37 ° C. Убедитесь, что температура точно с помощью термометра. Водяной бане должно быть при правильной температуре до активации папаин. Рекомендуется для установки температуры вечером перед утром рассечение.
- Подготовка папаин и протеолитического фермента смесь
Примечание: Убедитесь, что решение папаин свежий перед каждой диссоциации.- Во вторник 6 недели около 45 минут до начала вскрытия получить 1 флакон папаин порошка из 4 ° C и инкубации при комнатной температуре. Также в трубе Эппендорф при комнатной температуре, чтобы позже добавить порошок папаин отложите CSM.
- мин до начала вскрытия использовать шприц для добавления комнатной температуре CSM в флаконе папаин (непосредственно через крышку), так что концентрация составляет 100 единиц/мл (количество порошка в каждом флаконе немного отличается, флакон содержащий 123 единицы добавить 1,23 м L CSM). Смешать, сначала перевернуть флакон для захвата любой порошок, застрял на внутренней стороне крышки и затем Пипетка вверх и вниз.
- Добавьте флакона в стакан, содержащий воды 37 ° C в водяной бане. Убедитесь, что флакон папаин решения не плавает. Активируйте папаин на 30 минут при 37 ° C.
- После добавления папаин стакан на водяной бане, получить Алиготе протеолитического фермента смеси (26 Ву/мл) от-20 ° C и проинкубируйте его при комнатной температуре. После 30 минут активации Инкубируйте папаин при комнатной температуре.
- Анатомирование
- Во вторник 6 недели вскрыть поставил куколки мозги в холодной CSM чистым пинцетом и отрезали зрительного лопастями, щипать на стыке лоб зрительный и Центральный мозг.
- Добавьте лопастями нижней части Микропробирка, содержащий 500 мкл 1 x RS (один Микропробирка для экспериментальной ткани) и один для отрицательного контроля ткани. Всегда держите трубы на льду.
- Вскрыть столько долей как можно в 1 час. Отрицательный контроль ткани 10 долей являются достаточно. Бассейн расчлененный зрительного лепестков в одном Микропробирка по ликвидации потерь ткани во время передачи между пробирок.
- Диссоциации клеток
- Осторожно удалите 1 x RS от Микропробирка с расчлененными зрительного лопастями, с помощью пипетки P200, оставляя достаточно, чтобы покрыть лопастями. Аккуратно добавьте 500 мкл 1 x RS на стороне трубки, с тем чтобы нарушить мозги как можно меньше. Всегда держите трубку на льду.
- Пусть долей оседают на дно. Только один раз, занимают 200 мкл и Пипетка смешивать (лопастями должна двигаться). Пусть долей урегулировать снова.
- Для двух выборок (экспериментальная и отрицательный контроль) аликвота 600 мкл активирована папаин комнатной температуры в микропробирок. Добавление 4.2 мкл комнатной температуре протеолитического фермента смеси в 600 мкл папаин решение для получения конечной концентрации 0,18 Ву/мл. Смешайте закупорить вверх и вниз. Это решение диссоциации.
- Тщательно удалить 1 x RS из каждого образца и добавьте 300 мкл раствора диссоциации лопастями. Проинкубируйте образцы при 25 ° C, 1000 об/мин за 15 мин в thermomixer микропробирок.
- В 5 и 10 мин время остановите thermomixer и пусть долей опускаться на дно микропробирок. Занять до 200 мкл раствора и пипетки, перемешать.
- После 15 минут пусть лопастями оседают на дно и тщательно удалить решение диссоциации от долей (постарайтесь не беспокоить долей).
- Мыть дважды с 1 x RS. Для этого, тщательно добавить 500 мкл 1 x RS (постарайтесь не беспокоить долей). Микс, нежно накапайте до 200 мкл и затем накапайте в микропробирок. Пусть лопастями опускаться на дно и повторить.
- Мыть каждый образец дважды с 500 мкл CSM (же, как предыдущий шаг).
- Осторожно удалите CSM и добавьте еще 200 мкл CSM трубки. С помощью пипетки P200, срывать ткань, закупорить вверх и вниз без пены, до тех пор, пока решение однородной (то есть, больше не видим каких-либо остатков ткани).
- Фильтрации суспензии клеток через шапка сетки 30 мкм в 5 мл СУИМ трубку на льду (использовать Р200 и убедитесь, что вся подвеска проходит через). Добавить еще один 500 мкл CSM для полоскания Микропробирка диссоциации и фильтр решение в трубу СУИМ.
- Тщательно снять крышку трубки СУИМ, собирать решения под сетчатый фильтр с Р200 и добавить его в остальной части подвески в трубке СУИМ. Образцы готовы для СУИМ.
- Убедитесь в том иметь пробирок для сбора СУИМ очищенного клеток готовы заранее. РНК seq, сортировать клетки от каждого образца непосредственно в пробирки, содержащие 300 мкл буфера RLT (буфера lysis) из комплекта Очистка РНК (добавить масштаба 1: 100 2–меркаптоэтанол перед использованием).
- СУИМ сортировка
Примечание: После диссоциации, сразу сортировать клетки, СУИМ (1ч Макс). Убедитесь, что книга СУИМ сессий соответственно при планировании эксперимента. Сортировщик ячейки с 100 мкм Сопло размер обычно используется.- Сравните распределение ячеек в отрицательный контроль и экспериментальный образец, чтобы настроить ограничение для сортировки. В идеале, установить стробирования в СУИМ эксперимента, и пример отрицательного контроля будет обеспечивать подтверждение или тонкой настройки заранее установленным ограничением. Клетки интереса должны быть хорошо отделены от фона ячеек, которые присутствуют в отрицательный контроль и экспериментального образца (рис. 4) (проверить это в экспериментальном экспериментов).
- Соберите сортировки клеток в подготовленные коллекции трубок.
- РНК
- После сортировки ячеек непосредственно в 300 мкл буфера RLT, накапайте вверх и вниз, чтобы лизировать клетки.
- Очистить РНК после стандартный протокол очистки всего РНК от животных и человеческих клеток с помощью очистки комплект (см. Таблицу материалы) с по колонки ДНК пищеварение7. Элюировать РНК в 20 мкл РНКазы свободной воды.
- Замораживание образцов РНК с жидким азотом и хранить при температуре-80 ° C.
- Для каждого эксперимента выполните по крайней мере 3 реплицирует для управления и экспериментальных условиях. Подготовить кДНК библиотек для всех образцов в то же время и выполнить все образцы, на ту же ячейку потока для контроля технических изменчивости. После подготовки всех образцов РНК, используйте скорость vac для уменьшения объема до 2 – 5 мкл (каждый образец).
4. Подготовка кДНК библиотек и последовательность смарт seq2
Примечание: Для сведения к минимуму технических изменчивости, сделать все библиотеки cDNA в то же время и последовательность их на одной и той же клетке потока.
- Используйте входной 1,5 мкл концентрированного РНК сделать кДНК библиотек, следуя стандартным протоколом для смарт seq217 , за исключением следующих изменений: использование различных мастер ПЦР-высококачественный микс (см. Таблицу материалы) для ПЦР усиление; использование очистки ПЦР на колонки комплект (см. Таблицу материалы) вместо магнитной бусины для очистки продуктов PCR.
- Смарт seq2 протокол включает в себя шаг до амплификации PCR после обратной транскрипции, а также окончательное обогащения ПЦР шаг после tagmentation. Количество циклов в амплификации PCR зависит от обилия входного материала. С 1000 ячеек в качестве входных данных обычно используют 15 циклов в шаге предварительной амплификации PCR и 12 циклов для окончательного обогащения ПЦР шаг.
- Бассейн библиотек и последовательности их на одном потоке ячейку (например, платформы NextSeq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая схема
На рисунке 1показана общая схема протокола. Протокол состоит из трех основных частей: летать работы, подготовки проб, последовательности и анализа данных. «Планирование перед эксперимент» сессии протокола не включается в общую схему для простоты.
Хронология
Календарь основных частей протокола (Fly работы и подготовки проб) показано на рисунке 2.
Проверка ячейки конкретных маркировки, конфокальная микроскопия
В представитель эксперимента дневно были названы L3 пластинки монополярной нейронов (L3). Нейрон L3 является одним из пяти гомологичных пластинки нейронов (L1-L5), которые получают входные данные от широко настроило фоторецепторов R1 R6 и доведения информации до высокой центр по synapsing к целевой нейронов в мозге. В MARCM эксперименте Одноячеистый L3 клоны формируются митотическая рекомбинации и дневно обозначены двумя маркерами, myr-tdTOM (мембраны) и Н2А-GFP (ядерной). Генотипов мух, используемых в кресты приведены в таблице 1. Для проверки ячейки конкретных маркировки, летать мозги желаемого генотипа были расчленены на стадии развития интереса (40 h НФА). Иммуноокрашивания была выполнена ранее описанных7 используя антитела специфические против dsRed и GFP (рис. 3, пурпурного и зеленого), а также 24B10 антитела в качестве образца для пластинки и продолговатого мозга neuropils (рис. 3, голубой). Конфокальная микроскопия подтвердил, что L3 является единственным типом ячейки, помечены как dsRed, так и гена GFP в лоб зрительный.
Изоляция низкой изобилие клеток СУИМ
Представитель СУИМ, сортировка результат показан на рисунке 4. 100,000 события были записаны. 29,9% всех событий являются потенциальными фуфайки, и остальные может быть мусора или агрегатов. Дуплеты и клетки с различными размерами были затем условного вне зависимости от гранулярности и размер. Из оставшихся одиночных камер (FSC фуфайки, 27,3% всех событий), L3 нейронов появился как плотно кластера в P1 (рис. 4, образец, пурпурный), который также был отделен от фона ячеек (рис. 4, образец, синий). Размер ячеек в P1 сходна с однородной клеточной популяции. В частности несколько ячеек в P2 (Рисунок 4, образец, зеленый) с интенсивностью промежуточных флуоресценции dsRed и GFP были распределены между жесткой скопление клеток в P1 и фон. Не ясно, личность этих клеток. Поскольку другой размер чем клетки P1, P2 клетки эти клетки были склонны быть неспецифические. Чтобы избежать потенциального загрязнения от неспецифических клеток, только P1 клетки были собраны для эксперимента. От 100 000 событий получены 45 P1 клетки.
Рисунок 1: Общая схема протокола. Протокол состоит из трех частей: летать работы, подготовки проб, последовательности и анализа данных. Приблизительное время обработки каждой части указывается. Также крупные шаги по каждой части приведены в соответствующих регионах в штучной упаковке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: временная шкала для fly работы и подготовки проб. Протокол занимает около 6 недель. Сроки основных этапов отображается в календаре. Выполняются в тот же день как СУИМ сортировки рассечение, диссоциации и РНК, не отображаются в календаре для простоты. Три биологических реплицирует выполняются последовательно в течение одной недели с же кресты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель конфокальная микроскопия изображением селективного маркировки желаемой клетки флуоресцентных маркеров. В MARCM эксперименты один L3 пластинки монополярной нейроны были сделаны выразить myr-tdTOM и Н2А-GFP с помощью L3-конкретных GAL4 драйвер (9-9-GAL4)18. Муха мозги желаемого генотипа были расчленены на 40hr АТФ и витражи с анти dsRed, анти GFP и 24B10 антител (как ссылку для neuropils пластинки и продолговатого мозга). Confocal микроскопии оценивали люминесцентные маркировки. L3 нейронов рождаются в пластинки и проект аксоны, остановленных в пределах Нейропиль продолговатого мозга. В каждом мозге подмножество L3 нейронов выразили как флуоресцентные журналистам, и это были только ячейки в доле Оптика, выражая маркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Очищающая один нейрон пластинки L3, MARCM клоны через СУИМ: представительный участок СУИМ. Ворота (например P1) были созданы основанные на ячейку детализации, размер и флуоресценции интенсивности изолировать однородных единичных клеток. L3 нейронов, выражая аналогичным образом высокий уровень myr-tdTOM и Н2А-ГФП были собраны в P1 (пурпурный). Несколько ячеек с интенсивностью промежуточных флуоресценции наблюдаются в P2 (зеленый). Эти разные по размеру чем L3 нейронов в P1 и может представлять неспецифической клетки. Они не собирались. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Генотип | Источник |
| w; UAS 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, TubP-GAL80, FRT40, 27G-GFP; 9-9-GAL4, бла myr::tdTOM/TM6B | Пэн et al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, бас GFP; УАН Н2А GFP/TM6B | Пэн et al., 2018 |
Таблица 1: Генотипами мух, используемых в кресты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол является простой и технически не сложно выполнять, но есть несколько ключевых шагов, если игнорировать волю вызывает значительное сокращение в клеточных урожайности. (Шаг 2.3.2.) Важно, что кресты являются здоровыми, и что еда не высыхает. Регулярный полив кресты важно максимально увеличить количество доступных для рассечения мух, которые имеют право генотипа и на правильной стадии развития. Как часто кресты нужно поливать будет варьироваться в зависимости от пищи используется и жилищных условий мух. Для обеспечения кресты не высыхает, изучить флаконы дважды в день и добавить воды, соответственно. (Шаг 3.3.) Также важно объединить расчлененных мозги в единый Микропробирка, который будет использоваться для диссоциации, противоположность после каждого диссектор использовать свои собственные Микропробирка и затем впоследствии объединения образцов. Это позволит устранить любые мозги, потерял от передачи между пробирок, которые могут быть значительными. (Шаг 3.4.9.) Когда закупорить вверх и вниз, сорвать вручную ткани, жизненно важно сделать это до тех пор, пока не остатки ткани видимы глазом в подвеске. Неполные тканей срыв уменьшит количество одиночных камер, которые могут быть отсортированы через СУИМ и таким образом уменьшить сотовой урожайности.
Главное ограничение сотовой доходности исходного материала. В этой связи Анатомирование являются скорость, ограничения по нескольким причинам: (1) диссоциации протокол требует зрительного лопастями расчлененный из головы и отделены от центрального мозга, (2) для получения ткани на точное время очки во время разработки время окно для вскрытия должна быть ограниченной, (3) дольше времени период между Анатомирование и СУИМ, тем больше шанс субоптимальные клетки здравоохранения и неспецифической воздействия на экспрессии генов и геномной Организации (то есть, чем короче рассечение период лучше). Времени, затраченного секционный должна быть изменена для получения желаемого количества материала в минимальное количество времени. Большинство неполадок осуществляется в экспериментальных экспериментов. Здесь важно: оптимизации генетическим маркировки для яркости и специфичность (рис. 3), оценить ли воспроизводимые популяция клеток интерес четко отделены от фона ячеек в СУИМ участков (рис. 4), определить количество мозги, которые должны быть расчленены получить достаточное количество материала для последующих приложений (см. шаг 1. Fly работы) и определить минимальное количество времени, необходимого для рассечения соответствующего числа мозги.
Основные продвижение этого протокола является то, что эффективной изоляции низких обильные клеток транскриптомики и геномных приложений, значительно улучшить чувствительность над наш предыдущий метод6. Исходя из нашей оценки, дневно обозначенные население состоит из менее чем 100 ячеек на лоб зрительный могут быть эффективно изолированы для РНК seq анализов. Это позволяет транскриптомики и геномный анализ применяться мозаика генетических экспериментов, которой подмножества ячеек отдельных видов генетически манипулировать в противном случае обычный фон. Это представляет собой критический шаг вперед, поскольку такие эксперименты существенно важное значение для определения функции автономных и неавтономных генов клеток в сложных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось NINDS национальных институтов здравоохранения под номером премии K01NS094545, andgrants от центра Лефлер для изучения нейродегенеративных расстройств. Мы признаем известкования Тан и Джейсон МакЭван для ценных разговоров.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
