Summary
Här presenterar vi ett cell dissociation protokoll för effektivt isolera celler närvarande vid låg överflöd inom Drosophila visuella systemet genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS).
Abstract
Senaste förbättringar av känsligheten av nästa generations sekvensering har underlättat tillämpningen av transcriptomic och genomiska analyser på litet antal celler. Utnyttja denna teknik för att studera utvecklingen i Drosophila visuella systemet, som ståtar med en mängd cell typspecifika genetiska verktyg, ger en kraftfull metod för att hantera den molekylära basen för utveckling med precisa cellulära upplösning. För en sådan vara genomförbart, är det viktigt att ha kapacitet att tillförlitligt och effektivt rena celler närvarande vid låg överflöd i hjärnan. Här presenterar vi en metod som möjliggör effektiv rening av enstaka cell kloner i genetiska mosaik experiment. Med detta protokoll uppnå vi konsekvent en hög cellulära avkastning efter rening med hjälp av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) (~ 25% av alla märkta celler), och framgångsrikt utfört transkriptomik analyser på enstaka cell kloner genereras genom Mosaic analys med en repressible cell markör (MARCM). Detta protokoll är idealisk för att applicera transcriptomic och genomiska analyser till specifika celltyper i det visuella systemet, över olika stadier av utveckling och inom ramen för olika genetiska manipulationer.
Introduction
Drosophila visuella systemet är en enastående modell för att studera den genetiska grunden för utveckling och beteende. Den består av en stereotyp cellulära arkitektur1 och en avancerad genetisk toolkit för att manipulera specifika cell typer2,3. En stor styrka med detta system är förmågan att självständigt förhöra geners funktion i celltyper sevärdheter med enstaka cell upplösning, använder genetiska mosaik metoder4,5. Vi försökt kombinera dessa genetiska verktyg med senaste framstegen inom nästa generations sekvensering att utföra cell typspecifika transcriptomic och genomiska analyser i enskild cell kloner i genetiska mosaik experiment.
För att åstadkomma detta, är det nödvändigt att utveckla en robust och effektiv metod för att isolera selektivt låga riklig cellpopulationer i hjärnan. Tidigare har utvecklat vi ett protokoll för att isolera specifika celltyper i det visuella systemet under Pupp utveckling genom FACS, och avgöra deras transcriptomes som använder RNA-seq6. I dessa experiment, var den stora majoriteten av celler av en viss typ (t.ex. R7 fotoreceptorer) fluorescently märkt. Med den här metoden i genetiska mosaik experiment, där endast en delmängd av celler av samma typ är märkta, misslyckats vi med att isolera tillräckligt med celler för att få kvalitet sekvensering data. För att lösa detta, försökte vi öka cellulär avkastningen genom att förbättra cell dissociation protokollet.
Vår strategi var att minska den totala längden av protokollet att maximera hälsa dissocierade celler, förbättra cellulär hälsa genom att ändra dissektion och dissociation buffertar, och minska den mekaniska störningar i dissekerade vävnad. Vi testade den förbättra protokoll7 med hjälp av mosaic analys med en repressible cell markör5 (MARCM), som tillåter generation av enkel fluorescently märkt kloner av speciella celltyper, som vildtyp eller mutant för en gen av intresse i en annars heterozygot fluga. Där, under identiska förhållanden, vår tidigare protokoll misslyckades med att generera tillräckligt med material för RNA-seq, var förbättrad protokollet framgångsrik. Vi reproducibly uppnå en cellernas kickavkastning (~ 25% av märkt celler) och få hög kvalitet RNA-seq data från så lite som 1000 celler7.
Ett antal protokoll har beskrivits tidigare för att isolera särskilda celltyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. dessa protokoll är främst avsedda för att isolera cellerna som finns i överflöd i hjärnan. Våra protokoll är optimerad för att isolera låg rikligt cellpopulationer (färre än 100 celler per hjärnan) i det visuella systemet med FACS för efterföljande transcriptomic och genomiska analyser. Med detta protokoll, vi strävar efter att ge ett sätt att isolera reproducibly låg rikligt celler från FACS och erhålla högkvalitativ transkriptom data av RNA-följande punkter flyga visuella systemet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Planering innan experimentet
-
Innan du börjar experimentet, utföra en småskaliga pilot experiment för att bekräfta om genetiken fungerar som förväntat att specifikt beteckna önskad cellerna.
- Som ett första pass, Använd immunohistokemi och ljusmikroskopi att avgöra om är oönskade celler märkta. Idealiskt, genetiska markörer är specifik inom näthinnan och synnerven lob (figur 3). Endast optic lober används för cellen dissociation och så märkning i centrala hjärnan är inte en fråga. Samtidigt, bestämma hur många celler av intresse är märkta per hjärna.
- Om de genetiska etikett(er) har önskad specificitet, utföra en pilot FACS experiment (figur 4) för att avgöra om en ren population av celler kan isoleras reproducibly, och också för att bedöma hur många celler av intresse kan isoleras från varje hjärna. Om det behövs, bedöma renheten av isolerade celler genom kvantitativa PCR att bestämma berikning eller avinstallation anrikning av specifika gener.
-
Bestämma antalet korsningar som krävs för att erhålla önskad mängd material för experimentet.
Obs: Baserat på experimentella erfarenhet, ~ 17 – 25% av fluorescently märkta celler isoleras konsekvent med detta protokoll, och hög kvalitet RNA-sekvensering uppgifter fås från så få som 1 000 FACS renat celler (färre celler kan räcka).- För att erhålla 1 000 celler för RNA-seq analyser, säkerställa att det finns minst 40 celler av intresse fluorescently märkt per hjärnan (20 celler per optic LOB). Runt ~ 10 celler av intresse bör renas per hjärnan, dissekera så 100 hjärnor.
- För att få ~ 100 flugor i ett lämpligt stadium av utveckling att dissekera i varje experiment, Använd ~ 100 kors om du väljer mot belastningsutjämnare (detta varierar beroende på genotyperna av föräldrarna). Om flugor är homozygota för den alleler/transgener sevärdheter färre kors kan ställas in.
- Begränsa fönstret dissektion till 1 h för att maximera cellulär hälsa och minimera ospecifika förändringar i genuttryck och genome organisation som kan uppstå efter hjärnor är dissekeras, men detta kan justeras. Bestämma antalet analysera krävs att dissekera 100 hjärnor i 1 h, som beror på skicklighet att analysera.
2. flyga arbete
Obs: Flugor höjs vid 25 ° C med ~ 50% luftfuktighet om inget annat anges. Nedanför genotypen av honor är indicerat som genotyp F, och att män som genotyp M.
-
Expanderande bestånd
- Få ~ 100 injektionsflaskor unga flugor (ingen mer än en vecka gammal med genotyp F) och ~ 30 injektionsflaskor av genotyp M.
- På torsdag i vecka 1, flip 100 injektionsflaskor med genotyp F på färska livsmedel. Start på fredagen, flip injektionsflaskorna varje dag genom tisdag i vecka 2. Dessa 6 flips används för att samla oskulder. Även på onsdagen i vecka 2, vänd flugor av genotyp M på färska livsmedel och rensa ut föräldrarna fredag i vecka 2. Dessa flaskor används för att samla män för korsen.
-
Samlande oskulder
- Från måndag vecka 3, samla oskulder från genotyp F injektionsflaskorna. Samla 2 - 3 gånger om dagen och lagra jungfrurna på 18 ° C med ~ 50% luftfuktighet. Upprepa detta varje dag genom tisdag i vecka 4. Det rekommenderas starkt att samla så många oskulder som möjligt, eftersom många av dem dör innan korsen är inställda. Typiskt, ~ 2500 oskulder bör samlas in för att ställa in 100 korsar.
-
Ställa in korsar
- På fredag i vecka 4, ange siffrorna av korsar (vanligtvis 100 – 200 korsar per experiment) med 15 oskulder genotyp f och 7 hanar av genotyp M för varje kors. Det är mycket viktigt att använda unga och friska hanar med intakt vingar.
- Vänd kors varje dag från söndag till lördag i vecka 5. Komplettera kors med färska oskulder eller män om döda flugor finns. Det är viktigt att förhindra maten från att torka ut, så vatten i injektionsflaskor som behövs. Torka mat kommer att avsevärt minska avkastningen.
-
Negativ kontroll för FACS sortering
- Inkluderar en negativ kontroll utan önskad cellerna märks för FACS sorteringen. Helst bör den negativa kontrollen ha reportern (t.ex. UAS-GFP) men inte föraren (t.ex. GAL4), så att basala uttryck av reporter (UAS-konstruktioner kan vara ”läckande”) kan bestämmas att ställa lämpliga gating för FACS sorteringen. Vänd flugor för den negativa kontrollen samtidigt med de experimentella flugorna, och arrangera dem på samma sätt.
-
Iscensättning puppor
- För att samla celler på ett visst utvecklingsstadium Pupp (t.ex. 40 h efter puparium bildandet [h APF]), skede tilldelat puppor i en 1 h tidsramen att matcha med perioden 1 h för dissektioner (ovan). FACS bör utföras direkt efter cell dissociation, som uppstår efter dissektioner och tar ~ 40 min. Den exakta tidpunkten för mellanlagring och dissektioner bestäms således av FACS tillgänglighet.
- För att erhålla puppor på 40 h APF, steg på måndagen i vecka 6 vid en viss tidpunkt (t.ex. 5 pm) att dissekera puppor 40 h senare (t.ex. 9 am på onsdag). Använd en våt pensel för att försiktigt plocka vit före puppor och placera dem på väggen i förväg värmde injektionsflaskor. Bara plocka puppor med önskad genotyp.
-
Biologiska replikat
- Göra minst 3 biologiska replikat för varje experiment. Ett enkelt sätt, upprepa experimentet tre gånger i samma vecka (vecka 6) använder samma kors. Till exempel stage puppor för de andra och tredje replikat på tisdag och onsdag, respektive. Dissekera dessa puppor på torsdag och fredag, respektive.
3. provberedning
Obs: Alla de reagens som används i detta protokoll är listade i Tabell för material.
- Förbereda lösningar för dissektioner och vävnad dissociation
- Förbereda proteolytiska enzym blandning stamlösning (se Tabell för material) genom beredning av det frystorkade enzymet med ddH2O en koncentration på 26 Wünsch enheter (Wu) / mL. För en flaska som innehåller 260 Wu (stor flaska), tillsätt 10 mL av ddH2O att injektionsflaskan och göra engångsbruk alikvoter (4.2 µL krävs per dissociation). Beståndet förvaras vid-20 ° C. Varje experiment kräver dissociation av två prover (negativ kontroll och experimentella vävnad).
- Förbereda 10 x Rinaldinis lösning (RS) och komplett Schneiders Media (CSM) dagen innan dissektion (måndagen i vecka 6). Förbereda 5 mL CSM för varje DISSEKTOR, och ca 5 mL 1 x RS och 5 mL CSM för dissociationen av 2 prover (negativ kontroll och experimentell). Lagra 10 x RS vid 4 ° C i upp till en månad och CSM vid 4 ° C i upp till en vecka.
- För att bereda 100 mL 10 x RS, lös 8 g NaCl, 200 mg kaliumklorid, 50 mg av NaH2PO4, 1 g NaHCO3 och 1 g glukos i 100 mL ddH2O i en 250 mL bägare. Filter sterilisera med 0,22 mm filter.
- Tillsätt 20 mg L-glutation till 1 mL ddH2O i ett mikrorör.
- För att förbereda CSM 50 mL, tillsätt 5 mL av värme inaktiverat bovint serum, 0,1 mL om 10 mg/ml med insulin, 5 mL 200 mM L-glutamin lösning, 12,5 μl 20 mg/ml L-glutation och 1 mL Penicillin-Streptomycin lösning (5.000 enheter av penicillin och 5 mg av streptomycin / mL) till 38,9 mL av Schneiders media. Filter sterilisera med 0,22 mm filter.
- Späd 10 x RS med ddH2O för att göra 1 x RS fungerande lösning. Förbereda 500 μL 1 x RS i icke-häftande mikrorör för varje prov.
- Slå på ett vattenbad och Ställ in temperaturen vid 37 ° C. Kontrollera temperaturen är korrekta med hjälp av en termometer. Vattenbadet måste vara rätt temperatur före papain aktivering. Det rekommenderas att ställa in temperaturen kvällen innan en morgon dissektion.
- Förbereda papain och proteolytiska enzym blandning
Notera: Se papain lösning färska innan varje dissociation.- På tisdag i vecka 6 runt 45 min innan dissektionerna, Hämta 1 injektionsflaska med papain pulver från 4 ° C och odla i rumstemperatur. Även avsatt CSM i ett Eppendorf-rör vid rumstemperatur att senare lägga till papain pulvret.
- min före start av dissektioner Använd en spruta för att lägga till rumstemperaturen CSM injektionsflaskan med papain (direkt genom den gemensamma jordbrukspolitiken) så att koncentrationen är 100 enheter/mL (mängden pulver i en injektionsflaska är något annorlunda, för en injektionsflaska innehållande 123 enheter lägga till 1,23 m CSM L). För att blanda, först Vänd injektionsflaskan för att fånga något pulver som fastnat på insidan av locket och sedan Pipettera upp och ner.
- Lägg till injektionsflaskan i en bägare som innehåller 37 ° C vatten i vattenbadet. Kontrollera injektionsflaskan med papain lösning inte är flytande. Aktivera papain under 30 minuter vid 37 ° C.
- Efter tillägger papain till en bägare i vattenbad, hämta en alikvot av proteolytiska enzym blandning (26 Wu/mL) från-20 ° C och odla det i rumstemperatur. Efter 30 min av aktiveringen, inkubera papain i rumstemperatur.
- Dissektioner
- På tisdag i vecka 6, dissekera stegvis Pupp hjärnor i kalla CSM med ren pincett och avskurna optic loberna genom att nypa vid korsningen av den optiska loben och centrala hjärnan.
- Lägg till loberna längst ned i ett mikrorör innehållande 500 μL 1 x RS (ett mikrorör för experimentell vävnaden) och en för negativ kontroll vävnaden. Håll alltid rören på is.
- Dissekera så många lober som möjligt i 1 h. För den negativa kontroll vävnaden räcker 10 lober. Pool dissekeras optic lober i en enda mikrorör att undanröja vävnad förlust under överföring mellan mikrorör.
- Cell dissociation
- Ta försiktigt bort 1 x RS från mikroröret med dissekerade optic lober med P200 pipett, lämnar tillräckligt för att täcka loberna. Tillsätt försiktigt 500 μL 1 x RS till sidan av röret, så att störa hjärnor så lite som möjligt. Håll alltid röret på is.
- Låt loberna bosätta sig till botten. Bara en gång, ta upp 200 μL och Pipettera ut för att blanda (lober bör flytta). Låt loberna bosätta sig igen.
- För två prover (experimental och negativ kontroll) aktiveras alikvotens 600 μL av rumstemperatur papain i ett mikrorör. Tillsätt 4.2 μL av rumstemperatur proteolytiska enzym blandning till 600 μL papain lösning att erhålla en slutlig koncentration på 0,18 Wu/mL. Blanda genom pipettering upp och ner. Detta är dissociation lösningen.
- Försiktigt bort 1 x RS från varje prov och tillsätt 300 μL av dissociation lösning till loberna. Inkubera proverna vid 25 ° C, 1000 rpm i 15 min i ett mikrorör thermomixer.
- I 5 och 10 min tidpunkter, stoppa thermomixer och låt loberna sjunka till botten av mikroröret. Ta upp 200 μL av lösningen och Pipettera ut för att blanda.
- Efter 15 min, låt loberna bosätta sig botten och ta försiktigt bort dissociation lösningen från loberna (försök att inte störa loberna).
- Tvätta två gånger med 1 x RS. För att göra detta, tillsätt försiktigt 500 μL 1 x RS (försök att inte störa loberna). Att blanda försiktigt Pipettera upp 200 μL och sedan Pipettera ut i mikroröret. Låt loberna sjunka till botten och upprepa.
- Tvätta varje prov två gånger med 500 μL av CSM (samma som föregående steg).
- Försiktigt bort CSM och lägga till en annan 200 μL av CSM i röret. Med pipett P200 störa vävnaden genom pipettering upp och ner utan skumbildning, tills lösningen är homogen (dvs. kan inte längre se alla rester av vävnaden).
- Filtrera cellsuspensionen genom en 30 μm mesh cap i en 5 mL FACS röret på is (Använd en P200 och kontrollera hela suspensionen går igenom). Lägga till en annan 500 μL av CSM att skölja det dissociation mikroröret och filtrera lösningen till FACS röret.
- Försiktigt ta av locket av FACS röret, samla lösningen under filtret mesh med en P200 och lägga till resten av suspensionen i FACS röret. Proverna är redo för FACS.
- Vara säker på att ha mikrorör för insamling FACS renat celler redo i förväg. För RNA-seq, sortera celler från varje prov direkt i mikrorör som innehåller 300 μL av RLT buffert (lyseringsbuffert) från RNA rening kit (Lägg till 1: 100 2–merkaptoetanol före användning).
- FACS sortering
Obs: Efter dissociation, omedelbart sortera cellerna av FACS (1 h max). Se till att boka FACS sessioner med detta när du planerar för experimentet. En cell sorterare med 100 μm munstycke används normalt.- Jämför cell fördelningen i den negativa kontrollen och experimentella provet att ställa in den gating för sorteringen. Idealiskt, fastställa den gating i pilot FACS experimentet, och det negativa kontrollprovet ger bekräftelse eller finjustering av i förväg fastställda gating. Cellerna av intresse skall vara väl åtskilda från bakgrunden cellerna som finns i både den negativa kontrollen och experimentella provet (figur 4) (testa detta i pilot experiment).
- Samla in sorterat cellerna i beredda samling rören.
- RNA rening
- Efter sortering cellerna direkt till 300 μL av RLT buffert, Pipettera upp och ner för att lysera celler.
- Rena RNA efter standardprotokollet för rening av Total-RNA från djur- och mänskliga celler använder rening kit (se Tabell för material) med den kolumn DNA matsmältningen7. Eluera RNA i 20 μL av RNase-gratis vatten.
- Frysa av RNA-prov med flytande kväve och förvaras vid-80 ° C.
- Utför minst 3 replikat för kontroll och experimentella förhållanden för varje experiment. Förbereda cDNA biblioteken för alla prover samtidigt och köra alla prover på samma flöde cell styra för tekniska variabilitet. När alla RNA prover bereds, använda en speed vac för att minska volymen för 2 – 5 μL (varje prov).
4. förbereda cDNA bibliotek och sekvensering av Smart-seq2
Obs: För att minimera tekniska variabilitet, göra alla cDNA bibliotek på samma gång, och sekvensera dem på samma flöde cell.
- Använda en ingång på 1,5 μL av koncentrerad RNA för att göra cDNA bibliotek genom att följa standardprotokollet för Smart-seq217 med undantag för följande ändringar: Använd en olika HiFi-PCR master mix (se Tabell för material) för PCR förstärkning; använda en på-kolumn PCR rening kit (se Tabell för material) i stället för magnetiska pärlor att rena PCR-produkter.
- Smart-seq2 protokollet innehåller ett PCR före förstärkning steg efter omvänd Transkription samt en slutlig anrikning PCR steg efter tagmentation. Antalet cykler i den PCR-amplifieringen beror på överflödet av ingående material. Med 1000 celler som indata, använder du vanligtvis 15 cykler i steget PCR före förstärkning och 12 cykler för slutliga anrikning PCR-steg.
- Biljard bibliotek och sekvensera dem på ett enda flöde cell (t.ex. den NextSeq plattformen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systematiken
En systematik i protokollet visas i figur 1. Protokollet är uppdelad i tre huvuddelar: flyga arbete, provberedning, sekvensering och dataanalys. ”Planering innan experimentet” sessionen av protokollet ingår inte i det allmänna systemet för enkelhet.
Tidslinjen
En kalender över större delar av protokollet (flyga arbete och provberedning) visas i figur 2.
Verifiera-specifika märkning av konfokalmikroskopi
I en representativ experiment, var L3 lamina monopolär nervceller (L3) fluorescently märkt. L3 neuron är en av de fem homologa lamina nervceller (L1-L5) som tar emot input från i stort sett trimmad fotoreceptorer R1-R6 och vidarebefordra informationen till stadens höga av synapsing till målet nervceller i medulla. I ett experiment med MARCM enda cell L3 kloner skapas av mitotisk rekombination och fluorescently märkt av två markörer, myr-tdTOM (membran) och H2A-GFP (kärnkraft). Genotyperna av flugor som används i korsar visas i tabell 1. För att verifiera cell-specifik märkning, var flyga hjärnor av önskad genotyp dissekerade på utvecklingsstadiet av intresse (40 h APF). Immunfärgning utfördes som tidigare beskrivna7 använder antikroppar specifikt mot dsRed och god Jordbrukarsed (figur 3, magenta och grönt), samt 24B10 antikroppen som referens för den lamina och medulla neuropils (figur 3, blå). Konfokalmikroskopi bekräftat att L3 är den enda celltypen som märkt av både dsRed och god Jordbrukarsed i det optic LOB.
Isolering av låg-överflöd celler av FACS
En representant FACS sortera resultatet visas i figur 4. 100,000 händelser registrerades. 29,9% av alla händelser är potentiella undertröjor, och resten kan vara skräp eller aggregat. Midjekort jacka och celler med olika storlekar var sedan gated ut baserat på detaljnivå och storlek. Från de återstående enstaka cellerna (FSC undertröjor, 27,3% av alla händelser), L3 nervceller dök upp som ett tight kluster i P1 (figur 4, Specimen, magenta), som var väl åtskilda från bakgrunden cellerna (figur 4, Specimen, blå). Storleken på cellerna i P1 var liknande konsekvent med en homogen cellulär befolkning. Särskilt distribuerades några celler i P2 (figur 4, Specimen, grön) med mellanliggande fluorescensintensiteten hos dsRed och god Jordbrukarsed mellan det stram klustret av celler i P1 och bakgrunden. Identiteten hos dessa celler var inte klart. Eftersom P2 celler hade en annan storlek än de P1 cellerna, skulle dessa celler kunna vara ospecifika. För att undvika potentiella föroreningar från icke-specifika celler, samlades endast P1 celler för experimentet. Från 100.000 händelser erhålls 45 P1 celler.
Figur 1: en systematik i protokollet. Protokollet består av tre delar: flyga arbete, provberedning, sekvensering och dataanalys. Ungefärliga handläggningstiden för varje del är indicerat. Stora steg för varje del visas också i motsvarande boxed regioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tidslinjen för flyga arbete och provberedning. Protokollet tar ca 6 veckor. Tidpunkten för de stora stegen visas i kalendern. Dissektion, dissociation och RNA rening görs i samma dag som FACS sortering och visas inte i kalendern för enkelhet. Tre biologiska replikat görs sekventiellt i samma vecka med samma kors. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en representativ konfokalmikroskopi bild visar selektiv märkning av önskad celler av fluorescerande markörer. I MARCM experiment, var enda L3 lamina monopolär nervceller gjorde att uttrycka myr-tdTOM och H2A-GFP använder en L3-specifika GAL4 drivrutin (9-9-GAL4)18. Flyga hjärnor av önskad genotyp var dissekeras på 40hr APF och färgas med anti-dsRed, anti-GFP och 24B10 antikroppar (som en referens för den lamina och medulla neuropils). Fluorescerande märkning bedömdes av konfokalmikroskopi. L3 nervceller föds i lamina och projektet axoner som avslutar inom den medulla neuropil. I varje hjärna, en delmängd av L3 nervceller uttryckt både fluorescerande reportrar, och dessa var de enda cellerna i den optic loben uttrycker markörerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Purifying enda L3 lamina neuron MARCM kloner via FACS: en representativ FACS tomt. Gates (t.ex. P1) skapades baserat på cell granularitet, storlek och fluorescens intensitet att isolera homogen enstaka celler. L3 nervceller uttrycker samma höga nivåer av myr-tdTOM och H2A-GFP samlades in från i P1 (magenta). Några celler med mellanliggande fluorescensintensiteten observeras i P2 (grön). Dessa är olika i storlek än L3 nervceller i P1, och kan utgöra icke-specifika celler. Dessa samlades inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Genotyp | Källa |
| w; TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | Peng et al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | Peng et al., 2018 |
Tabell 1: Genotyper av flugor som används i kors.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är enkel och inte tekniskt svår att utföra, men det finns flera viktiga steg som om förbises kommer att orsaka en betydande minskning av cellulära avkastning. (Steg 2.3.2.) Det är avgörande att korsar är friska och att maten inte torkar ut. Regelbunden vattning av korsar är viktigt att maximera antalet flugor tillgängliga för dissektion som är av rätt genotyp och i rätt skede av utveckling. Hur ofta korsar behöver vattnas varierar beroende på den mat som används och inhysa villkorar av flugor. Att säkerställa korsar inte torka ut, undersöka injektionsflaskorna dagligen och tillsätt vatten med detta. (Steg 3.3.) Det är också viktigt att pool dissekerade hjärnor i en enda mikrorör som kommer att användas för dissociationen, i motsats till efter varje DISSEKTOR som använder sina egna mikrorör och sedan därefter pooling proverna. Detta kommer att eliminera alla hjärnor förlorade från överföring mellan mikrorör, som kan vara betydande. (Steg 3.4.9.) När pipettering upp och ner manuellt störa vävnad, är det viktigt att göra så tills ingen resterna av vävnad är synliga genom ögat i suspensionen. Ofullständig vävnad störningar kommer att minska antalet enstaka celler som kan sorteras via FACS, och därmed minska cellulära avkastning.
Den största begränsningen av cellulära avkastning är utgångsmaterial. I detta avseende dissektionerna är hastighetsbestämmande av flera skäl: (1) protokollet dissociation kräver optic lober dissekeras ur huvudet och separerade från centrala hjärnan, (2) för att erhålla vävnad på exakta tidpunkter under utveckling tiden fönster för dissektioner måste vara limited, (3) ju längre tidsperioden mellan dissektioner och FACS, desto större chans att suboptimala cell hälsa och icke-specifika effekter på genuttryck och genomiska organisationen (dvs., ju kortare dissektion perioden desto bättre). Den tid dissekera bör ändras för att få önskad mängd material i den minimala tid. De flesta av felsökning utförs i pilotförsök. Här är det viktigt att: optimera genetiska märkning för ljusstyrka och specificitet (figur 3), bedöma huruvida en reproducerbar population av celler av intresse är tydligt åtskilda från bakgrunden celler i FACS tomter (figur 4), bestämma den antal hjärnor som behöver vara dissekeras för att erhålla en tillräcklig mängd material för senare ansökningar (se steg 1. Flyga arbete), och bestämma den minimala mängden tid som behövs för att dissekera antal hjärnor.
Det stora framsteget i detta protokoll är att det tillåter effektiv isolering av låg rikligt celler för transcriptomic och genomisk applikationer, förbättra känsligheten betydligt över våra tidigare metod6. Baserat på vårt anseende, kan fluorescently märkt populationer som består av färre än 100 celler per optic LOB isoleras effektivt för RNA-seq analyser. Detta tillåter transcriptomic och genomiska analyser tillämpas i genetiska mosaik experiment, vari delmängder av celler av särskilda typer är genetiskt manipulerade i en annars normal bakgrund. Detta utgör ett avgörande framsteg, som sådant experiment är nödvändiga för att fastställa självständiga och icke självständiga gen cellfunktioner i komplexa vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Forskningen finansierades av NINDS av det nationella Institutes of Health award nummer K01NS094545, andgrants från Lefler Center för den studie av neurodegenerativa sjukdomar. Vi erkänner kalkning Tan och Jason McEwan för värdefulla samtal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
