ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס
Summary
כאן מוצג זרימת עבודה עבור ניתוח ביטוי תרבות, גנים של תאי אנדותל תחת גזירה נוזלים. כלול הוא סידור הפיזי בו זמנית דיור וניטור צ’יימברס מרובים זרימה בסביבה מבוקרת, את השימוש RNA אקסוגני עזר עבור ה-PCR כמותי.
Abstract
אנו מתארים זרימת עבודה עבור הניתוח של ביטוי גנים מתאי אנדותל בכפוף זרימה שכבתית קבועה באמצעות תאי זרימה במקביל-plate בפיקוח מרובים. תאי אנדותל ליצור תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם, באופן כרוני חשופים לכוח חיכוך של זרימת הדם הנקרא גזירה. בתנאים פיזיולוגיים, תאי אנדותל פונקציה בנוכחות גזירה לתנאים שונים. לפיכך, היישום של גזירה תנאים במבחנה במודלים יכול לספק תובנות רבות יותר על תגובות אנדותל vivo בתוך. תא הזרימה במקביל-plate שפורסמו קודם לכן על ידי ליין. et al. 9 הוא מותאם ללמוד הכונה אנדותל הנוכחות ואת היעדר זרימה שכבתית (שאינם פועמת) קבוע. עיבודים מפתח בקביעת עבור זרימה שכבתית כפי שהוצג כאן כוללים סביבה גדול, ייעודי הבית זרימה בו-זמניות מעגלים, הפיקוח על המחירים זרימה ב בזמן אמת, והכללה של אקסוגני הפניה RNA על נירמול של נתונים כמותיים PCR בזמן אמת. כדי להעריך טיפולים/תנאים מרובים עם היישום של גזירה, זרימת החשמל מרובים, משאבות משמשים בו זמנית בתוך החממה מחוממת, humidified אותו. קצב הזרימה של כל מעגל זרימה נמדד באופן רציף בזמן אמת לתקנן את התנאים גזירה לאורך כל הניסויים. כי ניסויים אלה יש תנאים מרובים, אנו משתמשים גם של RNA אקסוגני עזר זה עלה בבזמנו של RNA חילוץ עבור נירמול של החילוץ-RNA, הראשון-strand cDNA סינתזה היעילות. השלבים למזער את השונות בין הדגימות. אסטרטגיה זו מועסק בצבר שלנו לניתוח ביטוי גנים עם גזירה ניסויים באמצעות תא הזרימה במקביל-צלחת, אבל חלקים של אסטרטגיה זו, כגון אקסוגני הפניה ספייק-ב-RNA, יכול בקלות, באופן חסכוני לשמש יישומים אחרים.
Introduction
תאי אנדותל כלי הדם בצורת תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם במערכת הלב וכלי הדם הסגורה של מינים גבוה יותר. הם יוצרים את הממשק בין הדם לבין רקמות, מאופיינים luminal ומשטחים abluminal. אנדותל היא מערכת מגוונת, פעיל, והוא מסתגלת המווסת את זרימת הדם מזין סחר, חסינות, הצמיחה של כלי דם חדשים1. בגוף, תאי אנדותל קיימים בדרך כלל בסביבה שבה הם נחשפים לכוח חיכוך של מחזור הדם, גזירה2. גזירה הרגולטור חשוב של ביטוי גנים תא אנדותל3, תאי אנדותל לנסות לשמור על גזירה בתוך2,בטווח נתון4. תאי אנדותל מדגימים האנגיוגנזה תכנים בהעדר מאמץ גזירה5 שיכולות לשפר רקמות זלוף. דפוסים אזוריים של זרימה מופרעת, גזירה שינו משויכות הביטוי של גנים דלקתיים6 לבין התפתחות טרשת עורקים7,8. כך, דגמים הכוללים מאמץ גזירה הם מרכיב מרכזי להבנת הכונה אנדותל.
נתאר שיטת לימוד של הכונה בתאי אנדותל כלי הדם תחת גזירה. מערכת זו משתמשת זרימה פועמת ואת מחקה רמות הנוזלים גזירה, ריכוז חמצן את התנאים מודל עבור תאי אנדותל עורקי. פרוטוקול זה כולל פרטים על שיטות נוקאאוט גנטי באמצעות התערבות ב RNA (RNAi), הסידור של יישום באמצעות מכשירים במקביל-plate זרימה, שיטות ספייק-אין של אקסוגני הפניה RNA לפני הניתוח על ידי מאמץ גזירה תגובת שרשרת של פולימראז כמותית-טרנסקריפטאז (RT-qPCR). צינור זה משמש עבור הלומדים הכונה בתאי האנדותל הנוכחות ואת היעדר למינריות גזירה, כולל עיבוד של המנגנון הזרימה במקביל-plate מתוארת על ידי ליין. et al. 9. הגדרת המסוים הזה נועד לקדם את ההערכה בו זמנית של מספר תנאים ניסיוני המאפשר השוואה ישירה של תנאים גזירה, כמו גם את הנורמליזציה של RNA ניתוח. יחידה גדולה מחוממת עם מבוקרת לחות מנוצל כדי לאפשר זרימה נפרדת צ’יימברס מרובים, משאבות לנהל בו זמנית עם זרימה המחירים פיקוח להרכבה הקאמרית לכל הזרימה בזמן אמת. היישום של זה משמש נוקאאוט גנטי באמצעות RNAi בסביבה של זרימה שכבתית/גזירה, אך ניתן ליישם היבטים של פרוטוקול זה כל הערכה של RNA ביטוי.
גישות נפוצות היישום של גזירה עבור תאי אנדותל כוללים מערכות microfluidic10, עם מד צמיגות חרוט ופלייט-11קאמרית הזרימה במקביל-plate12. Microfluidic מערכות מיצרנים שונים היו שימושיים בלימוד mechanobiology ו- mechanotransduction תא מרובים, סוגי רקמות ואת מגוון רחב של גירויים ביופיזיקלי. עבור תאי אנדותל, הם שימשו ללמוד תאי אנדותל בידוד, כמו גם את האינטראקציה של תאי אנדותל וסחר של תאי החיסון או גידול10. עם זאת, מערכות אלו מתאימים פחות ההתאוששות של מספר גדול של תאים9. מד צמיגות קונוס-ו-plate והן במקביל-plate זרימה צ’יימברס לאפשר ההתאוששות של מספר גדול של תאים confluent monolayers12. מערכות אלה ניתן להפיק מגוון של הכוחות ודפוסי הטיה12. במקביל-plate זרימה קאמרית הרכבה9 יש את היתרון הזה הדמיה בזמן אמת יכול להתבצע דרך חלון זכוכית להערכת המורפולוגיה הסלולר בכל נקודת זמן. יתר על כן, ניתן לאסוף את perfusate בתנאים סטריליים. עבור מערכת המספרים המובאים כאן, הזרם ניתן גם לנטר בזמן אמת, מלכודת קאמרית מרובה, המאפשרת קיום התנאים הטיה בין צ’יימברס.
לניסויים נציג, הוא יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר מייצגים סוג תאי אנדותל macrovascular, משמשים, ונשתמש התנאים גזירה (1 הרשות הפלסטינית) משקפים מצבים עורקי (0.1 – 0.7 הרשות הפלסטינית). עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם סוגי תאים אנדותל אחרים, התנאים גזירה יכול להיות מותאם על פי השאלה ניסיוני. לדוגמה, ההערכה של תאי אנדותל אדם תנאים בהם מודל מחזור ורידים ידרוש רמות נמוכות יותר של גזירה (Pa 1-6), מחקרים כי מודל זרימת microvascular נעזרו גזירה רמות של 0.4 – הרשות הפלסטינית 1.213 , 14. בנוסף, גזירה יכול להשתנות אפילו בין תאי אנדותל בתוך כלי דם באותו6. הסידור הנוכחי, מערכת מעקב יחיד משמש זה יכול לעקוב אחר בו זמנית ארבע לולאות זרם נפרד. עבור מעבדות צריכה לולאות זרם נוסף, יש שטח בסביבה ייעודית למערכת ניטור נוספים.
RT-qPCR משמש את כימות מוחלטת של ביטוי גנים בהגדרה של גזירה. הביטוי היחסי של הגנים יעד משמש לעתים קרובות כדי להשוות RNA הביטוי על-פני תנאים. מינים מסוימים RNA יכול להתקיים כמויות נמוכות מאוד או להיעדר, ובכך שמסבך מידות יחסית. לדוגמה, זמן noncoding RNAs בתאי האנדותל שיכולים להפעיל אפקטים חזק במספרים עותק נמוך יחסית לכל תא5. בנוסף, הבדלי יעילות פריימר יכול להוביל פרשנות שגויה של ניצול שיטת הסף (Ct) של מחזור דלתא-delta לנתח את הנתונים. כדי לטפל חשש זה, אנו מבצעים כימות מוחלטת על ידי יצירת עיקול רגיל באמצעות כמות ידועה של פלסמיד ה-DNA. יתר על כן, משלימים לסינתזת DNA (cDNA) הוא תהליך לא יעיל, הבדלים cDNA יעילות יכול להסביר הבדלים בביטוי RNA בין בתנאים ובין דגימות15. היישום של גזירה ו/או תרביות תאים ריאגנטים יכול להשפיע על התפשטות תאים אפופטוזיס, הכדאיות, או להוסיף רכיבים עלולים להפריע סינתזה RNA בידוד ו/או cDNA. להביא בחשבון האפשרות של הטיה מן הבידוד רנ א cDNA סינתזה, אנו משתמשים בספייק RNA פקד מסונתז במעבדה, הוסיף בזמנו של החילוץ-RNA, נמדד עם כל cDNA סינתזה ויה RT-qPCR. פעולה זו מאפשרת לא רק את ההתאמה טכני הבדלי סינתזה RNA חילוץ ו- cDNA אך גם מאפשר חישוב כמויות מוחלטת בכל תא, כאשר ספירת ידוע.
מערכת זו משתמשת צעדים נוספים כדי לשמור על דמיון או בחשבון הבדלים טכניים בין תנאי. שלבים אלה מודגשת במיוחד בגלל האופי המורכב של ניסויים אלה, בהם מעורבים מספר set-ups פיזי ותנאים ניסיוני זה יכול להוביל השתנות ניסיוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמץ גזירה הוא מצב הפיזיולוגיות ממיקרו הפונקציה אנדותל, בחלקו, על-ידי המשפיעים על מצב יציב ג’ין ביטוי2,5. מודלים של הכונה בתנאים שונים של גזירה יתרום להבנה גדולה יותר של פונקציית אנדותל. זרימת עבודה מעשית זו כוללת מעגל זרימה באמצעות תא הזרימה במקביל-plate מקורי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי CIHR מגב 142307 P.A.M. H.S.J.M. הוא הנמען של קנדי מוסדות של הבריאות מחקר תוכנית אימונים במלגת רפואה רגנרטיבית. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ו- M.K.D. הם הנמענים המלכה אליזבת השנייה לתואר שני מלגות המדע והטכנולוגיה.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
