Summary
כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.
Abstract
מחקרים שנעשו לאחרונה תאים כל תיקון-קלאמפ של נוירונים הסובסטנציה gelatinosa (SG) סיפקו גוף גדול של מידע אודות המנגנונים בעמוד השדרה שידור חושית, תקנה nociceptive ופיתוח כרוני כאב או גירוד. מימושים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יחד עם לימודי מורפולוגי המבוסס על השירות של חוט השדרה חריפה פרוסות השתפרו עוד יותר את ההבנה שלנו של מאפייני עצביים, ההרכב של המעגלים המקומיות ב ס ג. כאן, אנו מציגים מדריך מפורט ומעשי עבור הכנת חוט השדרה פרוסות הצג נציג כל-תא ולהקליט תוצאות מורפולוגי. פרוטוקול זה מאפשר שימור עצביים אידיאלי, ניתן לחקות תנאים ויוו במידה מסוימת. לסיכום, היכולת לקבל הכנה של במבחנה של חוט השדרה פרוסות מאפשרת יציבה זרם, מתח-להדק הקלטות, ובכך יכול להקל על נתונים היסטוריים חקירות המאפיינים קרום פנימי, המעגלים המקומיות, מבנה עצביים באמצעות גישות מגוונות.
Introduction
Gelatinosa הסובסטנציה (SG, הנדן השנייה של ' קרן ' בעמוד השדרה הגבי) היא מרכז חשוב עוררין ממסר עבור משדר וויסות מידע חושי. הוא מורכב interneurons סינאפסות, אשר מקבלים תשומות הסיבים מביא העיקרי, interneurons מקומיים, מעכבות מערכת יורד1אנדוגני. במהלך העשורים האחרונים, הפיתוח של חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה, כניסתו של תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה אפשרו מחקרים שונים המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות ו מורפולוגי פנימי של ס ג נוירונים2, 3 , 4 , כמו גם מחקרים של המעגלים המקומיות ב ס ג5,6. בנוסף, באמצעות במבחנה חוט השדרה פרוסה ההכנה, חוקרים יכולים לפרש את השינויים ב-7,excitabilities עצביים8, הפונקציה של יון ערוצי9,10, ו פעילות סינפטית11,12 בתנאים פתולוגיים שונים. מחקרים אלה יש העמיקה הבנתנו התפקיד כי ס ג נוירונים לשחק בפיתוח ותחזוקה של נוירופתי בגירוד וכאב כרוני.
במהותה, היא תנאי מוקדם מפתח כדי להשיג פריט חזותי ברור של סומא עצביים, אידיאלי תאים כל תיקון חוט השדרה חריפה בפרוסות כדי להבטיח את איכות מעולה של פרוסות אז ניתן להשיג את הנוירונים patchable ובריאה. עם זאת, הכנת חוט השדרה פרוסות כרוך במספר שלבים, כגון ביצוע laminectomy הגחוני של הסרת קרום pia-בחופשיות, אשר עשוי להיות מכשולים בהשגת פרוסות בריא. למרות שלא קל להכין פרוסות חוט השדרה, ביצוע הקלטות במבחנה על חוט השדרה פרוסות יש מספר יתרונות. לעומת ההכנות התרבות תאים, חוט השדרה פרוסות יכול חלקית לשמר קשרים סינפטיים הגלום שנמצאים במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, תיקון שלם-תא-הקלטה באמצעות חוט השדרה פרוסות קלאמפ יכול להיות בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיקון כפול קלאמפ13,14,15,מחקרים מורפולוגי16 תא בודד RT-PCR 17. לכן, טכניקה זו מספקת מידע נוסף על אפיון את הבדלים אנטומיים, גנטיים בתוך אזור מסוים, מאפשר חקירה של ההרכב של המעגלים המקומיות.
כאן, אנו מספקים תיאור בסיסי ומפורט של השיטה שלנו עבור הכנת חריפה השדרה פרוסות ורכישת תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות מ ג נוירונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים ניסיוני תיאר אושרו על-ידי חיה אתיקה הוועדה של נאנצ'אנג האוניברסיטה (נאנצ'אנג, סין, No.2017 האתית-010). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הלחץ והכאב של החיות ניסיוני. ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות שבוצעה כאן בוצעו בטמפרטורת החדר (RT, 22 – 25 ° C).
1. בעלי חיים
- השתמש חולדות ספראג-Dawley (בן 3-5 שבועות) של מין או. בית החיות תחת מחזור 12 שעות אור-כהה, נותן להם ad libitum גישה נאותה מזון ומים.
2. הכנת החומרים והפתרונות
- פתרונות
- להכנת נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) (במ מ): 117 NaCl, 3.6 אשלגן כלורי, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, ד 11-גלוקוז, חומצה אסקורבית 0.4 ו- 2 פירובט נתרן. ראה טבלה 1.
- להכין סוכרוז-כלנית חדד (במ מ): 240 סוכרוז, 2.5 אשלגן כלורי, 1.25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, חומצה אסקורבית 0.4 ו נתרן 2 פירובט. עיין בטבלה 2.
- להכין K+-המבוסס על פתרון תאיים (במ מ): 130 K-gluconate, 5 אשלגן כלורי, נה 102-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 מ ג-ATP ו Li 0.3-GTP. עיין בטבלה 3.
- להכין Cs+-המבוסס על פתרון תאיים (במ מ): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, נה 102-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (תה) - קלרנית, 0.5 EGTA, 10 HEPES מ ג - ATP ו Li 0.3-GTP. עיין בטבלה 4.
הערה: כל הפתרונות חייבים להיות מוכנים באמצעות מים מזוקקים. חנה המבר ואת סוכרוז-חנה המבר צריך להיות carbogenated (95% O2 ו- 5% CO2 תערובת) לפני השימוש כדי לשמור על pH אופטימלי של 7.4 ולאחר osmolality הפתרונות הללו שני צריך להיות מותאם כדי mOsm 300 – 310. כי חומצה אסקורבית יכול להשפיע על ערוצי סידן, סוכן זה חייב להיות מושמט אם אחד רוצה להקליט זרמים סידן. Osmolality ו- pH של פתרונות תאיים עליו להיות נמדד, התרגלו 290-300 mOsm ו- 7.2 – 7.3, בהתאמה. מומלץ לסנן את הפתרונות תאיים עם 0.2 µm מסננים ולאחסן את הפתרונות כמו aliquots 1 מ"ל ב-20 ° C. Cs+ ותה מוחלות ב Cs+-המבוסס על פתרון תאיים לערוץ אשלגן בלוק, אשר תורמת באמצעות המגבר להחזיק את הקרום פוטנציאל קבוע ב 0 mV בעת הקלטת הזרמים postsynaptic מעכבות (IPSCs). - להכין את הפתרון neurobiotin 488 0.05%. לפזר 2 מ ג של neurobiotin 488 ב 4 מ של K+-המבוסס על פתרון תאיים ולהתאים את osmolality כדי 290-300 mOsm באמצעות מים מזוקקים או סוכרוז במידת הצורך.
הערה: 1 מ מ סוכרוז מגדילה osmolarity 1 mOsm. - להכין 3% אגר כבלוק בחוט השדרה. להמיס 7.5 גר' של אגר ב 250 מ של מים מטוהרים בתוך זכוכית, ולאחר מכן להשתמש מיקרוגל אחמם את זה עד רותחים ולנקות. מערבולת הפתרון, שופכים את התערובת לתוך 17.5 ס"מ x 10.5 ס"מ x 1.8 ס מ קופסת פלסטיק התמצקות לאחר מכן. שמור על אגר ב 4 ° C לפני השימוש.
- להכין 4% paraformaldehyde (PFA) עיבוד immunohistochemical. מיקס 40 גר' אבקת PFA ~ 800 מיליליטר מחוממים (כ 60 ° C) 1 x PBS פתרון (130 מ"מ NaCl, 7 מ מ נה2HPO4, 3 מ מ NaH2PO4). לאט לאט להתאים את ה-pH על-ידי הוספת 1 טיפות N NaOH עד PFA אבקת התפרקה לחלוטין. ברגע הפתרון כבר ברור, לכוונן את עוצמת הקול הכולל עד 1 ליטר עם 1 x PBS. להתאים מחדש את ה-pH ל 7.2 – 7.4 באמצעות 1 HCl N בעת הצורך, ואז לסנן את הפתרון PFA 4%, לאחסן אותו ב-20 ° C עד השימוש.
הערה: PFA הוא רעיל, כך נדרש ללבוש מסיכות, כפפות, כמו גם בטיחות משקפיים. לנהל את תהליך הכנת 4% PFA בתוך ברדס מאוורר. אבקת PFA יכול להיות מומס לחלוטין ב- pH של 9 – 10.
-
כלי נגינה
- מערכת אלקטרופיזיולוגיות טיפוסי, להשתמש במיקרוסקופ זקוף מצויד עם ניגודיות התערבות דיפרנציאלית אינפרא-אדום (IR-DIC), מטרה טבילה במי ברזולוציה גבוהה, מצלמת CCD/CMOS, מגבר תיקון-קלאמפ, בעל micropipette ו- a micromanipulator המאפשר התאמת משובח של העמדה פיפטה. שלב XY נחוץ גם כדי להזיז את המיקרוסקופ.
- הר כל הציוד על שולחן בידוד רטט מוקף כלוב פאראדיי. לחבר צג וידאו מצלמת וידאו כדי לבחון את הנוירונים והמחש את micropipettes.
-
Micropipettes
- להפוך אלקטרודות הקלטה מ זכוכית בורוסיליקט נימים באמצעות של פולר micropipette. הטווחים ההתנגדות פיפטה אופייני של MΩ 3-6 כאשר מלא עם פתרון תאיים.
-
בלוק אגר
- הכן של 1.2 ס מ x 1.5 ס"מ x 2.0 ס מ אגר בלוק. חתוך את הבלוק לתוך הצורות המוצגות באיור 1 כנדרש.
3. חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה
הערה: פרוסות חוט השדרה רוחבי או parasagittal מוכנות כמו בעבר תיאר18,19,20.
- לפני transcardial זלוף והפקת חוט השדרה, להכין ~ 500 מל סוכרוז-כלנית חדד equilibrated עם 95% O2 ו- 5% CO2 , מגניב הפתרון כקרח (0 – 4 ° C).
- לקרר כל דיסקציה הכלים (למשל, לנתח מספריים, מספריים איריס, מלקחיים במיתולגיות, מלקחיים בסדר, מלקחיים מעוקלים) על הקרח. הדיאגרמה ההכנה של חוט השדרה חריפה פרוסה מוצג באיור1.
- Transcardial זלוף
- לאחר זריקה אחת (i.p. בקרום הבטן,) של urethane (1.5 g/ק ג), להמתין 2-3 דקות, להעריך את עומק ההרדמה של חולדות באמצעות בדיקה תגובות קמצוץ הבוהן או הזנב. ברגע מטוס כירורגי של הרדמה נשמר, מניחים את החולדה על קרח כתוש במצב פרקדן.
הערה: עבור הפקת הרדמה עמוקה מספיק עבור אי-תפיסת הכאב במהלך ניקור חזה, בצע את ההנחיות IACUC המקומי שלך. - בחתך (3-4 ס מ) דרך העור מן הסרעפת יווארה לעצם הבריח, ולאחר מכן בצע חתך רוחבי מתחת לרמה של הסרעפת.
- לאחוז ולגדל הסרעפת עם זוג מלקחיים מעוקל לחשוף את הסרעפת לחלוטין. עושים חתך רוחבי דרך הסרעפת ולאחר מכן לחתוך בית החזה בין החזה הצלעות בשני הצדדים כדי לפתוח את החזה. השתמש המלקחיים מעוקל להבין הסרעפת קשת הצלעות הוא קבוע, הלב חשוף במידה מספקת.
- החזקת את הלב עם מלקחיים מעוקל עוד בעדינות, ולאחר מכן להכניס מחט 22 גרם דרך החדר השמאלי לבסיס של קשת אבי העורקים.
- לחתוך אטריום ימין עם מספריים בסדר באופן מיידי ולאחר מכן התחל את זלוף של קר כקרח, מחומצן סוכרוז-חנה המבר דרך מערכת הכבידה.
הערה: transcardial מהיר ולא מספיקות זלוף עם סוכרוז כקרח-חנה המבר יכול להקל על התקררות מהירה של חוט השדרה, תוך ריכוז נתרן וסידן עשויה לעזור להקל על רעילות סינאפסות ולהגן על תפקוד. בנוסף, ניקוי תאי דם אדומים יהיה מועיל להפחתת רקע ההכתמה של biocytin בעת ביצוע מחקר מורפולוגי. זלוף נחשב מספיק מרוצה עוד הנוזל יציאה אטריום ימין נקי, צבע הכבד של החולדה, כפות רגליים הוא חיוור. קצה המחט 22 גרם צריך להיות בוטה כדי למנוע קריעה מבחינה והלב.
- לאחר זריקה אחת (i.p. בקרום הבטן,) של urethane (1.5 g/ק ג), להמתין 2-3 דקות, להעריך את עומק ההרדמה של חולדות באמצעות בדיקה תגובות קמצוץ הבוהן או הזנב. ברגע מטוס כירורגי של הרדמה נשמר, מניחים את החולדה על קרח כתוש במצב פרקדן.
- חיתוך בחוט השדרה וחלוקת
- עושים חתך אורכי (5 ס מ) על העור בחזרה מן סימטרית כדי rostral, ואז לחתוך את בית החזה בין עמוד השדרה ואת הצלעות משני צדדיו של מדינת זלוף.
- עושים חתך בסוף סימטרית של עמוד השדרה, להשתמש במספריים לחתוך משם הרקמות הסובבות, לבודד במהירות על קטע lumbosacral של עמוד השדרה.
- להעביר את המקטע lumbosacral צלחת זכוכית המכיל חנה המבר מבוססי סוכרוז קר כקרח. עם הצד הבטני כלפי מעלה, השתמש בסדר מספריים לחתוך דרך pedicle בחוליות בשני הצדדים ולחשוף את חוט השדרה בקפידה. לבודד של 2 ס מ ארוך חוט השדרה עם התרחבות lumbosacral (L1-S3) ולהעביר את המקטע בעמוד השדרה עוד צלחת זכוכית מלא עם סוכרוז קר-כלנית חדד.
- הסר את קרומי המוח ואת קרום pia-בחופשיות תחת מיקרוסקופ ויבתר. חותכים כל הגחוני / ואת השורשים העזוב משם מהר ככל האפשר.
- במקום חוט השדרה על בלוק אגר בעבר החתוך. כדי להכין פרוסות רוחבי, לצרף את הצד הבטני של חוט השדרה אגר ותנו הצד הגבי לכיוון הלהב. כדי להכין פרוסות parasagittal, לצרף הצד הבטני עם דבק מגע אגר בכיוון אנכי כמוצג באיור1. לאחר מכן, הר אגר גוש על פלטפורמה vibratome עם דבק מגע. להכין 300 – 500 מיקרומטר רוחבי או פרוסות parasagittal עם מהירות מראש של 0.025 mm/s, תדירות הרטט של 80 הרץ.
- השתמש פיפטה של חיתוך פלסטיק כדי להעביר את הפרוסות על רשת ניילון בתוך תא האחסון המכיל ברציפות מחומצן כלנית חדד-32 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות לפני ההקלטה.
הערה: לטפל כדי למנוע פגיעה בחוט השדרה, במיוחד קרן הגבי, בעת הסרת את קרומי המוח ואת השורשים בעמוד השדרה. צריך להיות פרוס חוט השדרה הגבי-ventrally. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפרוסות כדאי להיערך במהירות (תוך 15-20 דקות). עובי הפרוסה בעמוד השדרה צריך להיות לא יותר מ-600 מיקרומטר לספק ניראות התא. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת לעיל כדי לקבל פרוסות בעמוד השדרה אופקי.
4. כל תא תיקון-קלאמפ הקלטות
- כדי לנהל את הקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ ס ג נוירונים, השתמש K+-המבוסס על פתרון תאיים ברוב המקרים הקלטה, תוך יישום מדעי המחשב+-המבוסס על פתרון רק עבור ההקלטה של זרמי postsynaptic מעכבות.
- להניע בעדינות פרוסה חוט השדרה אל התא הקלטה, ולאחר מכן לשמור אותו עם חוט הפלטינה בצורת U מחובר עם חוטי ניילון בחוזקה ליציבות פרוסה אופטימלית. בהתמדה perfuse את הפרוסה עם חנה המבר מבעבע-RT דרך מערכת הכבידה ולהגדיר את קצב זלוף ב- 4-2 מ ל/דקה כדי להשיג חמצון מספיקות.
- לזהות את האזור של SG (רצועה שקופה) באמצעות עדשה מיקרוסקופ ברזולוציה נמוכה, לבחור נוירון בריא באמצעות המטרה ברזולוציה גבוהה כמו תא היעד, להתאים אותו למרכז המסך צג וידאו.
- למלא את micropipette של אמצעי אחסון המתאים של K+-מבוסס או Cs+-המבוסס על פתרון תאיים כנדרש, להכניס את micropipette בעל אלקטרודה, ולוודא כי הפתרון תאיים יוצר קשר החוט כסף בפנים מחזיק.
- להכניס את micropipette המוקד, לטבול אותו לתוך חנה המבר באמצעות micromanipulator ולאחר מכן החל לחץ חיובי מתון (~ 1 psi כאשר נמדד עם manometer) כדי לאלץ את micropipette מן כל לכלוך ופסולת.
- להעביר את micropipette לעבר יישוב נוירון בהדרגה. שחרור הלחץ חיובי ברגע פיפטה גישות הנוירון וטפסים גומת חן קטן מאוד על קרום עצביים כדי ליצור gigaseal.
- לשנות את החזקת פוטנציאל ל-70 mV, אשר קרוב פיזיולוגיים נח קרומית אפשרית (RMP) של תא. לאחר מכן, חלות יניקה ארעי ועדין micropipette קרע את הקרום, ליצור תצורת תאים כל טוב.
הערה: לאחר העברת הפרוסה לחדר ההקלטה, ודא זלוף יציב למשך לפחות 5 דקות לנקות את הלכלוך על פני פרוסה. ראוי לציין כי היכולת להבחין בין נוירונים בריא, לא בריא/מת היא בעלת חשיבות עליונה עבור הקלטה יציבה ואטימות טובים. נוירון לא בריא/מת יש מראה נפוח או מכווצים, יחד עם גרעין גדול לעין, בעוד נוירון בריא מאופיין על-ידי צורה תלת-ממדי (3D) עם קרום מבריק וחלק, בגרעין בלתי נראה. כדי להשיג תצורה של תאים שלמים, זה חיוני כדי לפצות על קיבול מהירה או איטית שלב אחר שלב בעת הצורך. במלון RT, מחושבת לצומת נוזלי פוטנציאל להיות 15.1 – 15.2 mV ו- 4.3 – 4.4 mV ב- K+-מבוסס ו Cs+-המבוסס על פתרון תאיים, בהתאמה. במחקרים שלנו, נתוני ההקלטות תוקנו לא עבור צומת נוזלי פוטנציאל. - הקלטות של מאפייני קרום פנימי
- להקליט את מאפייני פסיבי קרום פנימי: שיא RMP מיד (תוך 20 s) לאחר הפסקת. לקבוע את ההתנגדות קלט העצבית על ידי מדידת מתח התגובה depolarizing הנוכחי (pA 10, 500 ms) בכל RMP במצב הנוכחי-קלאמפ.
- הרשומה ירי מאפיינים: לבחון את דפוס הירי של כל נוירון הנוכחי-קלאמפ עם סדרה של 1 s depolarizing פולסים הנוכחי (25 – 150 הרשות הפלסטינית עם הרשות הפלסטינית 25 הפרש קבוע)-RMP. למדוד את הסף, משרעת ו בחצי-רוחב של פוטנציאלי פעולה יחיד במצב לא מקוון.
- להקליט הנוכחי subthreshold: כדי להעריך את הזרמים subthreshold הסומטית, החזק את הקרום פוטנציאליים ב-50 mV במצב מתח-קלאמפ. לאחר מכן, להחיל שורה של hyperpolarizing מתח פולסים של משך s 1 מ-60 mV ל-120 mV, עם הקטנת 10-mV.
- להקליט זרמים postsynaptic מעוררים (EPSCs): EPSCs שיא עם K+-המבוסס על פתרון תאיים במצב מתח-קלאמפ ב פוטנציאל החזקה של-70 mV.
- IPSCs שיא: להחיל Cs+-המבוסס על פתרון תאיים הקלטה IPSCs. לאחר תצורת כל תא הוא הוקם, להחזיק את הקרום פוטנציאליים ב-70 mV ~ 5 דקות ולאחר מכן תשנה החזקת פוטנציאליים 0 mV בהדרגה. המתן מספר דקות לייצוב ולאחר מכן התחל להקליט את האירועים IPSC.
הערה: יש לבחור רק נוירונים עם RMP של פחות מ-50 mV והצגה להחטיא ללימוד נוסף. סדרת resistances במחקר שלנו. בדרך כלל 10-30 MΩ, לא להיות כלולים הקלטה ברגע ההתנגדות סדרת שינויים על ידי יותר מ 20%. EPSCs יכול להיות מאושרות עם יישום אמבט של 50 מיקרומטר APV ו 20 מיקרומטר CNQX, בעוד IPSCs יכול להיות מאושרות עם 10 מיקרומטר bicuculline ו 1 מיקרומטר סטריכנין.
5. מחקר מורפולוגי
- לניסויים מורפולוגי, להשתמש K+-המבוסס על פתרון תאיים המכילה 0.05% neurobiotin 488.
- לאחר שמירה על יציבה אלקטרופיזיולוגיות מהקלטה של 20 דקות לפחות, הסר את micropipette בכיוון כלפי מעלה כדי לאפשר את קרום התא לאטום מחדש ולהעביר את הפרוסה חוט השדרה במיכל מלא עם 4% מחברים. לסדר את הפרוסות ב- 4% PFA RT עבור 1 h ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את הפרוסות ב- PBS ולאחר מכן לטבול אותם 50% אתנול למשך 30 דקות. לאחר עוד שלושה שוטף ב- PBS, לטעון את הפרוסות בעובי המקורי שלהם על גבי שקופיות עם מדיום הרכבה.
- השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלה של חומרים) עבור ייבוא תמונות ושיחזור 3D עצביים. סרוק את הנוירונים דרך עדשה X 20 עם z-ערימת 1.5 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חוט השדרה חריפה פרוסות הוכנו על פי התרשים המוצג באיור1. לאחר חיתוך שחזור, פרוסה חוט השדרה הועברה לחדר ההקלטה. נוירונים בריא אותרו על סמך מראה חיצוני סומא באמצעות מיקרוסקופ IR-DIC. הבא, פוטנציאל פעולה של ס ג נוירונים היינו שהפיק סדרה של depolarizing פולסים הנוכחי (משך s 1) כאשר נוירונים התקיימו RMP. כפי שמוצג באיור 2, ירי הדפוסים שנצפו בס ג נוירונים הכלולים טוניק-ירי, נדחתה ירי, gap-ירי, הראשונית-פרץ, phasic מתפרצת, יחיד-ספייק, בעל כורחו-ירי, אשר תיאר, מסווגות על-ידי מחקרים קודמים.
במסגרת ההכנה הזאת, גם הקלטנו את זרמי המופיעים באופן ספונטני וזרמים subthreshold מתח קלאמפ. עקבות נציג של זרמים subthreshold, כולל הנוכחי לפעיל על-hyperpolarization (אניh), סידן T-type הנוכחי (IT), אשלגן מסוג A הנוכחי (IA), מקבלים איור 3A. זרמים אלה התקבלו על-ידי החזקת תאים ב-50 mV ו בהדרגה נכנס 10-mV יפחת מ-60 ל-120 mV. אניh הופעל על-ידי hyperpolarizing מתח צעדים. עם זאת, אניT ואניA הופעלו על-ידי hyperpolarizing prepulses לשחרר מן איון עקב עם מתח depolarized. איור 3B 3 ג מראים נציג ספונטנית EPSCs (sEPSCs) IPSCs (sIPSCs) הוקלט בין הנוירונים SG, בהתאמה. ניתן לנתח את משרעת ואת התדירות של אירועים סינפטית אלה באמצעות ניתוח מיני התוכנה במצב לא מקוון.
כדי לאפיין תכונות מורפולוגיות עצביים, פרוסות parasagittal הוחלו כי רוב הנוירונים ס ג יש באופן משמעותי rostrocaudal התפשטות הדנדריטים, neurobiotin 488 נוספה לפתרונות תאיים. הגודל של סומא עצביים וההיקף והמידות של תהליכי הדנדריטים שלהם הוערכו לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה. כפי שדווח בעבר, ס ג נוירונים להראות הבחנות מורפולוגיות, יכול להיות מסווגים לתוך תאים המרכזי, תאים רדיאלי, תאים אנכי, תאי איון ותאים בלתי מסווג. Micrographs נציג של תאים אלה מוצגים באיור4.
איור 1: תרשים עבור חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה- לאחר להיות מורדם עמוקות עם urethan (i.p.), חולדות הן transcardially perfused עם carbogenated קר כקרח סוכרוז-כלנית חדד. השדרה ואז גזור במהירות, ומתבצעת הגחון laminectomy. קרומי המוח, קרום pia-בחופשיות ושורשים עצבי השדרה המצורפת יוסרו. לאחר מכן, הדגימה חוט השדרה נטענה בבלוק agarose. פרוסות רוחבי או parasagittal לחתוך עם vibratome לפי הצורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ירי דפוסים של נוירונים ס ג. דפוסי בירי נקבעים על ידי הזרקת סדרה של 1 s depolarizing פולסים הנוכחי לתוך נוירון SG-RMP. ניתן לסווג את דפוסי הירי כמו טוניק-ירי נדחתה ירי, gap-ירי, ראשוני-פרץ, phasic מתפרצת, יחיד-ספייק, בעל כורחו-ירי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מתח-קלאמפ הקלטות בנוירונים ס ג. עקבות נציג (A) מציג בתגובה hyperpolarizing נוכחי הזרקת מסווגים אניh,אני , אני,T. החלונית התחתונה מציגה את פרוטוקול evoking סף תת זרמי מתח-קלאמפ. (B) עקבות נציג של sEPSCs הקליט מ ג נוירונים ב-70 mV היעדרות, נוכחות של 50 μM APV ו 20 μM CNQX. להוריד עקבות רצופות, אשר מוצגות באיור של סרגל הזמן המורחב לפני (משמאל), תחת (מימין) הפעולה של APV, CNQX, להתכתב תקופה שצוין על-ידי בר המוצג להלן תרשים ההקלטה. עקבות נציג (C) sIPSCs שנרשמו מ ג נוירונים היעדרות ונוכחות של 10 μM bicuculline ו סטריכנין 1 μM ב 0 mV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מורפולוגיה נציג של נוירונים עכברוש ס ג. על-פי מאפייני דנדריט שמוצג בתמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית וגדלים סומא, ס ג נוירונים ניתן לסווג תא מרכזי (A), תא רדיאלי (B), תאים אנכי (C), תאים איון (D) ו לא מסווג תא (E ). V: הגחוני /; הגבי; d: R: rostral; C: סימטרית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רכיב | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) | g/L |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6.84 |
| אשלגן כלורי | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-גלוקוז | 180 | 11 | 1.98 |
| חומצה אסקורבית | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| פירובט נתרן | 110 | 2 | 0.22 |
טבלה 1: מתכון כלנית חדד.
| רכיב | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) | g/L |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6.84 |
| אשלגן כלורי | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-גלוקוז | 180 | 11 | 1.98 |
| חומצה אסקורבית | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| פירובט נתרן | 110 | 2 | 0.22 |
טבלה 2: מתכון סוכרוז-כלנית חדד.
| רכיב | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) | מ"ג/100 מ"ל |
| K-gluconate | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| אשלגן כלורי | 74.5 | 5 | 37.28 |
| נה2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15.7 |
טבלה 3: מתכון K+-המבוסס על פתרון תאיים.
| רכיב | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) | מ"ג/100 מ"ל |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| נה2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| תה-קלרנית | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15.7 |
טבלה 4: מתכון Cs+-המבוסס על פתרון תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרטים זה פרוטוקול השלבים להכנת פרוסות בחוט השדרה, אשר השתמשנו בהצלחה בעת ביצוע ניסויים תאים כל תיקון-קלאמפ ב ס ג נוירונים18,19,20,21. על-ידי יישום שיטה זו, דיווחנו לאחרונה minocycline, דור שני של טטרציקלין, יכול לשפר במידה ניכרת הסינאפסית מעכבות באמצעות מנגנון presynaptic ס ג נוירונים19. בנוסף, סוכן זה יכול להקטין משרעת של אניh , עוד לעכב את דעתנית של ס ג נוירונים21. כדי לתמוך אלה לאור הנתונים ואת התוצאות נציג שאנו מראים פה, השיטה כיום המתואר מתאים לשימוש במגוון רחב של מחקרים אלקטרופיזיולוגיות.
כפי שציינו קודם לכן, transcardial זלוף הוא יסוד חיוני להשגת דגימות בריא. ראשית, אנו משתמשים כקרח פתרון עבור זלוף אז חוט השדרה יכולה להיות מקורר במהירות, חילוף החומרים עצביים יכולים להיות אטיים22. שנית, שהוחלפו סוכרוז כלנית חדד, פתרון 'הגנה חיתוך' עם ריכוז Na+ , ניתן להפחיתם זרם Na+ פסיבי, ובכך להפחית בצקת עצביים באמצעות הזנת מים23. שלישית, זה מועיל להשיג ולנתח מורפולוגיה עצביים מכיוון זלוף יכול למזער את הרקע נגרם על-ידי biocytin22. על ההכנות מוצלחת, חשוב גם להשתמש קצת חמצון כדי להפחית נזק חמצוני, המאפשר שימור עצביים24. לפיכך, בפרוטוקול שלנו, אנחנו תוספת חומצה אסקורבית ו פירובט נתרן, אשר הם נוגדי חמצון רבי עוצמה, ניתן להפחיתם בצקת חוט השדרה פרוסות ביעילות, כלנית חדד והן סוכרוז-כלנית חדד. בנוסף, מניסיוננו, אנו יכולים להשיג בריא השדרה פרוסות בהצלחה מ- neonatal וכן 3 – 10 שבועות חולדות SD הישן. לפיכך, עבור פרוטוקול זה מוצלח, אנו ממליצים להשתמש חולדות SD כי הם בני פחות מ- 10 שבועות.
בזמן ביצוע 'הגחון' laminectomy והסרה של קרומי המוח, עצבים בעמוד השדרה, אחד צריך להיות סבלני וזהיר למנוע חיתוך, מתיחה או פיצול של חוט השדרה. במחקרים מסוימים, חוט השדרה פרוסות עם שורשים העזוב המצורפת שימשו כדי להעריך את סינפטית שידור ס ג נוירונים התקבל באופן עקיף25,26. ההליך של הסרת קרום pia-בחופשיות היא הקושי הטכני, במקרה הזה, זה דורש הרבה סבלנות.
זה פרוסה הכנת טכניקה גם יש כמה מגבלות. חסרון ברור אחד הוא אמנם פרוסות חריפה לשמר קשרים סינפטיים שופע, שהוא יכול לא לשקף את מצבו האמיתי, כתובת מה בדיוק קורה בתוך vivo. לכן, מחקרים יש ליישם ויוו הקלטות כי הם בדרך כלל תרגיל 'עיוור'27,28,29. עם זאת, גישה זו אין ויוו טכנית מאתגר, זה קשה לומר אם הקלטה מתבצע סומא או דנדריט ללא מספיק ניסיון. מגבלה נוספת בשיטה הנוכחית שלנו הוא שזה סוכרוז-כלנית חדד לא עשוי להיות מספיק לשימור עצביים בעת הכנת פרוסות להזדקן מכרסמים. גישה מעודכן באמצעות N-מתיל-D-glucamine כפי תחליף Na+ הוצע, וכן מתודולוגיה זו ממוטבת בצורה ניכרת יכול לשפר את שימור פונקציונלי מורפולוגיים של נוירונים בפרוסות חריפה30,31 32, ,33. לבסוף, ס ג נוירונים מראים מאפיינים מורפולוגיים אלקטרופיזיולוגיות שונים3. זה נראה קשה לפרש והנתונים שהתקבלו כל-תא הקלטות בעודכם משקיפים על הטרוגניות. מגבלה זו עשויה להיות sidestepped על ידי נוסף אימות הפרטים מורפולוגי של הקליט נוירונים5 או באמצעות העכברים הטרנסגניים, אשר יכול לעזור לחוקרים לזהות נוירונים ספציפיים20,34. יתר על כן, optogenetics, כלי הרומן המאפשר שליטה על אוכלוסיה המשנה של תאים35, יכול להיות משולב עם תיקון שלם-תא-הקלטה ללמוד את התפקיד של תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים או חלבונים, לחקור מעגלים עצביים מסוימים קלאמפ.
בסך הכל, טכניקה זו הכנה היא הדרך האידיאלית כדי לחקור את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות מורפולוגי, תרופתי, הביולוגי של הנוירונים SG, כהשלמה תיקון-קלאמפ הקלטה, צביעת immunofluorescent, ספציפית אגוניסטים או היריבים, הטכניקה RT-PCR תא בודד. יתר על כן, ניתן ליישם גישה זו יחד עם תיקון לזווג-קלאמפ הקלטות או optogenetics, ולכן כלי אבחוני מאירה את מתוכנת עצביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מס 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
