Här beskriver vi de väsentliga steg för hela-cell patch-clamp-inspelningar som gjorts från substantia gelatinosa (SG) nervceller i ryggmärgen in vitro- segmentet. Denna metod tillåter inneboende membran egenskaper, synaptisk transmission och morfologisk karakterisering av SG nervceller att studeras.
Senaste hela-cell patch-clamp studier från substantia gelatinosa (SG) nervceller har lämnat en stor mängd information om spinal mekanismerna bakom sensoriska överföring, nociceptiva förordning och kronisk smärta eller klåda utveckling. Implementeringar av elektrofysiologiska inspelningar tillsammans med morfologiska studier baserade på nyttan av akut ryggmärgen skivor har ytterligare förbättrat vår förståelse av neuronala egenskaper och sammansättning av lokala kretsar i SG. Här presenterar vi en detaljerad och praktisk guide för beredning av ryggmärgen skivor och Visa representativa hela-cell inspelning och morfologiska resultat. Detta protokoll tillåter idealisk neuronala bevarande och kan härma i vivo villkor i viss utsträckning. Sammanfattningsvis, förmågan att få en in vitro- förberedelse av ryggmärgen skivor möjliggör stabil ström och spänning-bordsfäste inspelningar och kunde därmed underlätta detaljerade undersökningar in på inneboende membran egenskaper, lokala kretsar och neuronala struktur använder olika experimentella metoder.
Den substantia gelatinosa (SG, lamina II av spinal dorsala horn) är en obestridligen viktiga relay center för överföring och reglering av sensorisk information. Den består av retande och hämmande interneuroner, som tar emot indata från de primära afferenta fibrerna, lokala interneuronen och endogena fallande hämmande system1. Under de senaste decennierna har utvecklingen av akut ryggmärgen slice förberedelse och tillkomsten av hela-cell patch-clamp inspelning aktiverat olika studier om de inneboende elektrofysiologiska och morfologiska egenskaperna SG nervceller2, 3 , 4 samt studier av de lokala kretsarna i SG5,6. Dessutom, med hjälp av in vitro- ryggmärgen slice beredning, forskare kan tolka förändringarna i neuronala excitabilities7,8, funktionen av ion kanaler9,10, och Synaptic aktiviteter11,12 under olika sjukdomstillstånd. Dessa studier har fördjupat vår förståelse av den roll som SG nervceller spelar i utveckling och underhåll av kronisk smärta och neuropatisk klådan.
Den viktigaste förutsättningen att uppnå en tydlig visualisering av neuronala soma och perfekt hela-cell lapp med akut ryggmärgen skivor är huvudsakligen säkerställa den utmärkta kvaliteten på skivor så friska och patchable nervceller kan erhållas. Dock omfattar förbereda ryggmärgen skivor flera steg, som utför en ventrala laminektomi och ta bort pia-spindelvävshinnan membranet, som kan vara hinder att få friska skivor. Även om det inte är lätt att förbereda ryggmärgen skivor, har utför inspelningar i vitro på ryggmärgen skivor flera fördelar. Jämfört med cell kultur preparat, kan ryggmärgen skivor delvis bevara inneboende synapsförbindelser som är i en fysiologiskt relevanta skick. Dessutom kan hela-cell patch-clamp inspelning med ryggmärgen skivor kombineras med andra tekniker, såsom dubbla patch clamp13,14, morfologiska studier15,16 och encelliga RT-PCR 17. därför denna teknik ger mer information om karaktärisera de anatomiska och genetiska skillnader inom en specifik region och möjliggör undersökning av sammansättningen av lokala kretsar.
Här, ger vi en grundläggande och detaljerad beskrivning av vår metod för att förbereda akut ryggmärgen skivor och förvärva hela-cell patch-clamp inspelningar från SG nervceller.
Detta protokolldetaljer stegen för att förbereda ryggmärgen skivor, som vi har använt framgångsrikt när du utför hela-cell patch-clamp experiment på SG nervceller18,19,20,21. Genom att implementera denna metod, vi nyligen rapporterade att minocyklin, en andra generation av tetracyklin, kan markant förbättra hämmande synaptisk transmission genom en presynaptiska mekanism i SG nervcell…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (nr. 81560198, 31660289).
NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |